Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från Frozen Buffy Coats använder icke-integrerande Episomalt plasmider

Published: June 5, 2015 doi: 10.3791/52885
* These authors contributed equally

Summary

Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) utgör en källa till patientspecifika vävnader för kliniska tillämpningar och grundforskning. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att programmera humana perifera mononukleära blodceller (PBMNCs) som erhållits från frysta gula hinnor till virusfria iPSCs använder icke-integrerande episomala plasmider.

Abstract

Somatiska celler kan omprogrammeras till inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) genom att tvinga uttrycket av fyra transkriptionsfaktorer (okt-4, Sox-2, KLF-4, och c-Myc), typiskt uttryckt av humana embryonala stamceller (hESCs) . På grund av deras likhet med hESCs har iPSCs blivit ett viktigt verktyg för potentiella patientspecifika regenerativ medicin, undvika etiska frågor i samband med hESCs. För att erhålla celler som är lämpliga för klinisk applikation, transgen fria iPSCs behöver genereras för att undvika transgenen reaktive, förändrad genexpression och missriktade differentiering. Dessutom är det nödvändigt med en mycket effektiv och billig omprogrammering metod att härleda tillräckliga iPSCs för terapeutiska ändamål. Med tanke på detta behov, är en effektiv icke-integrerande episomal plasmid strategi att föredra val för iPSC härledning. För närvarande är den vanligaste celltypen som används för omprogrammering syften är fibroblaster, isoleringen av som kräver vävnadsbiopsi, en invasive kirurgisk procedur för patienten. Därför representerar humant perifert blod den mest tillgängliga och minst invasiva vävnad för iPSC generationen.

I denna studie, är en kostnadseffektiv och viral fria protokoll med användning av icke-integrerande episomala plasmider rapporterats för generering av iPSCs från humana perifera mononukleära blodceller (PBMNCs) erhållna från frysta gula hinnor efter helblod centrifugering och utan densitetsgradient separation.

Introduction

År 2006, den grupp av Shinya Yamanaka 1 visade för första gången att somatiska celler från vuxna möss och människor kan omvandlas till en pluripotent tillstånd genom ektopisk uttryck för fyra omprogrammering faktorer (okt-4, Sox-2, KLF-4, och c-Myc), alstra de så kallade inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) 2. Patientspecifika iPSCs liknar nära mänskliga embryonala stamceller (hESCs) i fråga om morfologi, spridning och förmåga att differentiera till de typer tre könsceller (mesoderm, endoderm och ektoderm), medan saknar etiska problem som är förknippade med användningen av hESCs och förbikoppling möjlig immunavstötning 3. Således iPSCs visas som en av de viktigaste källorna till patientspecifika celler för grundforskning, läkemedelsscreening, sjukdom modellering, utvärdering av toxicitet, och regenerativ medicin ändamål 4.

Flera tillvägagångssätt har använts för iPSC generationen: virala integrerande vektorer(Retrovirus 5, lentivirus 6), viral icke-integrerande vektorer (adenovirus 7), Sendai-virus 8, BAC transposoner 9, episomala vektorer 10, proteiner 11 eller RNA leverans 12. Även om användningen av virusmedierad metoder kan leda till hög effektivitet omprogrammering, virala vektorer integreras i genomet hos värdceller och därmed potential slumpmässig insertionsmutationer, inte kan uteslutas permanent förändring av genuttryck, och reaktivering av tystade transgener under differentiering 13.

För att göra iPSCs säkrare för regenerativ medicin, har ansträngningar gjorts för att härleda iPSCs utan integration av exogent DNA i cellulära genomer. Även om punktskattepliktiga virala vektorer och transposoner har utvecklats, är det fortfarande oklart om korta vektorsekvenser, som oundvikligen kvar i de omvandlade cellerna efter excision, och transposasgenen uttryck, kan ge upphov till förändring i cellular fungera 13. Trots sin höga omprogrammering effektivitet representerar Sendaivirus en dyr strategi och nå igenom licensproblem med det företag som utvecklat systemet har potential att begränsa dess tillämpning i translationella studier. Dessutom, behovet av direkt införande av proteiner och RNA kräver multipel avgivning av omprogrammering molekyler med de inneboende tekniska begränsningar Detta inför, och den totala effektiviteten omprogrammering är mycket låg 14. Notera kostnadseffektiva virusfria och icke-integrerande metoder baserade på användning av episomala plasmider har framgångsrikt rapporterats för omprogrammering av hudfibroblaster 15. Närmare bestämt i detta arbete beslutade vi att använda kommersiellt tillgängliga integrationsfria episomala plasmider, som tidigare rapporterats 10,15.

Hittills hudfibroblaster representerar de mest populära donator celltyp 5. Men andra cellkällor varit successfully omprogrammeras till iPSCs inklusive keratinocyter 16, benmärgs mesenkymala stamceller 17, fett stromaceller 18, folliklar håret 19 och tandmassaceller 20. Isoleringen av dessa celler kräver kirurgiska ingrepp, och flera veckor behövs för in vitro-cellexpansion i syfte att upprätta en primär cellkultur.

Mot bakgrund av detta är valet av start celltyp kritisk och det är lika viktigt att kunna producera iPSCs från lättillgängliga och mindre invasiva vävnader såsom blod. Båda navelsträngsblod mononukleära celler (CBMNCs) 21,22 och perifera mononukleära blodceller (PBMNCs) 14,22-24 representerar lämpliga källor av celler för härledning av iPSCs.

Även om effektiviteten hos vuxna PBMNC omprogrammering är 20-50 gånger lägre än den för CBMNCs 22, de förblir det bekväm celltyp för provtagning ändamål. IFaktum är PBMNC provtagning fördelen av att vara minimalt invasiva, och dessutom dessa celler inte kräver omfattande expansion in vitro innan omprogrammering experiment. Hittills har olika protokoll rapporterat att PBMNCs efter densitetsgradient separation kan frysas och tinas dagar till flera månader efter frysning och expanderades för några dagar innan omprogrammering i iPSCs 22,23. Icke desto mindre, så långt vi är medvetna inga rapporter har beskrivit omprogrammering av PBMNCs från frysta gula hinnor. Viktigt frysta gula hinnor samlats utan densitetsgradient separation representerar de vanligaste blodprover lagras i storskaliga biobanker från befolkningsstudier, vilket motsvarar en lättillgänglig pool av material för iPSC produktion som undviker ytterligare provtagning.

Häri rapporterar vi för första gången genereringen av virusfria iPSCs från humana frysta buffy coats, baserad på en tidigare beskriven protokoll 22. IDessutom gjordes iPSCs genereras från frysta PBMNCs erhållna efter densitetsgradient separation, såsom en styrprotokoll för de icke-densitetsgradient renade PBMNC resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Perifera mononukleära blodceller (PBMNCs) isolerades från humana perifera blodprover från friska donatorer efter undertecknade informerat samtycke och godkännande av etisk kommitté i provinsen Sydtyrolen. Experiment utfördes i enlighet med de principer som uttrycks i Helsingforsdeklarationen. Alla data samlades in och analyserades anonymt.

1. Isolering av perifera mononukleära blodceller (PBMNCs)

  1. PBMNCs erhållen från buffy coats efter helblod centrifugering, utan densitetsgradient separation.
    1. Samla 8 ml venöst perifert blod in i en natriumcitrat-buffrad plaströr, och förvara vid rumstemperatur (25 ° C). Process blod inom 12 timmar efter provtagningen.
    2. Centrifugera röret vid 2000 xg under 15 minuter vid 4 ° C i en svängande hink rötor, avslagcentrifug bromsar.
    3. Samla det grumliga gula hinnan (skiktet mellan det övre plasmafasen och den undrefas som innehåller det mesta av erytrocyter), som innehåller den anrikade PBMNC fraktionen (500 l) i en cryovial rör.
    4. Resuspendera 500 pl av buffy coat med 500 | il av 2x frysmedium innehållande 90% FBS och 20% DMSO, för att erhålla en total volym av 1 ml med 10% DMSO-koncentration.
    5. Frys flaska i en kontrollerad hastighet frysnings behållare vid -80 ° C. Förvara celler i flytande kväve under längre perioder.
  2. PBMNCs erhålls efter densitetsgradient separation
    1. Samla 12 ml venöst perifert blod in i en natriumcitrat-buffrad plaströr, och förvara vid RT. Process blod inom 12 timmar efter provtagningen.
    2. Späd blod med steril PBS till en slutvolym av 35 ml.
    3. Försiktigt och långsamt, skikt 35 ml utspätt blod på 15 ml polysackaros lösning (används för densitetsgradient separation) (p = 1,077) i en 50 ml koniskt rör (förhållande 3: 1).
    4. Centrifugera röret vid 800 xg under 30 min vid RT ien svängande hink rötor, avslagcentrifug bromsar.
    5. Sug den övre, gul fas innehållande plasma och kassera den. Försiktigt, överföra det opaka vita interskikt innehållande PBMNCs till en ny 50 ml koniska rör.
    6. Bring totala volymen till 30 ml med steril PBS och centrifugera vid 300 xg under 10 min vid RT.
    7. Kasta bort supernatanten och suspendera cellerna med 30 ml PBS. Räkna antalet viabla celler, baserat på trypanblåexklusion 25.
    8. Centrifugera PBMNCs vid 300 xg under 10 minuter vid RT, aspirera supernatanten och kassera den.
    9. Resuspendera cellpelleten i en lämplig mängd av frysmedium innehållande 90% FBS och 10% DMSO, för att erhålla en koncentration av 5 x 10 6 celler / ml.
    10. Alikvot 1 ml per flaska (cirka 5 x 10 6 celler / ml) och frysa flaska i en kontrollerad hastighet frysning behållare vid - 80 ° C. Förvara celler i flytande kväve under längre perioder.

    2. Upptining och plätering av PBMNCs (dag 0)

    1. PBMNCs erhållen från buffy coats efter helblod centrifugering, utan densitetsgradient separation.
      1. För att starta protokollet använder PBMNCs från frysta buffy coats, tina en flaska med celler i ett vattenbad vid 37 ° C och späd lättcellskoncentratet med steril PBS till en slutlig volym av 2 ml.
      2. Överför den utspädda buffy coat i en 50 ml koniskt rör, tillsätt 10 ml av röda blodkroppar lyseringsbuffert och inkubera under 10 min vid RT.
      3. För framställning av 500 ml av röda blodkroppar lysbuffert, tillsätt 0,5 g kaliumvätekarbonat, 4,145 g ammoniumklorid, 100 pl av 0,5 M EDTA-lösning till 500 ml ultrarent vatten, pH 7,2 till 7,4.
      4. Bring totala volymen till 50 ml med steril PBS och centrifugera vid 300 xg under 10 min vid RT.
      5. Kasta bort supernatanten och tvätta pelleten med 50 ml steril PBS, centrifugera lättcellskoncentratet vid 300 xg under 10 min vid RT.
      6. Resuspendera cellerna i1 ml av PBMNC-medium, såsom beskrivits tidigare 22 sammansatt av IMDM och Hams F-12 (förhållande 1: 1), 1% av insulin-Transferrin-Selenium-etanolamin (ITS-X), 1% av kemiskt definierade lipid koncentrat (CDL), 1% penicillin / streptomycin, 0,005% av L-askorbinsyra, 0,5% av bovint serumalbumin (BSA), 1-Thioglycerol (slutlig koncentration 200 pM), stamcellsfaktor SCF (100 ng / ml), interleukin -3 IL-3 (10 ng / ml), Erytropoietin EPO (2 U / ml), insulinliknande tillväxtfaktor IGF-1 (40 ng / ml), dexametason (1 uM) och holo-transferrin (100 ^ g / ml ).
      7. Överföra dem till en brunn i en 12-brunnsplatta med standardvävnadsodlingsbehandlade ytan, utan beläggning, vid en densitet av 2 x 10 6 celler / ml. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 i en fuktad inkubator i 48 timmar, tills den förändrade medel steg (se avsnitt 3).
    2. PBMNCs erhålls efter densitetsgradient separation
      1. För att starta protokollet använder frysta PBMNCs efterdensitetsgradient separation, tö en flaska med celler i ett vattenbad vid 37 ° C och överför cellerna i 5 ml PBMNC-medium. Centrifugera vid 300 xg under 10 min vid RT.
      2. Resuspendera cellerna i 1 ml PBMNC medium och överföra dem till en brunn i en 12-brunnar, vid en densitet av 2 x 10 6 celler / ml. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 i en fuktad inkubator i 48 timmar, tills den förändrade medel steg (se avsnitt 3).

    3. Kultur och Utbyggnad av PBMNCs (DAG 2-13)

    1. Samla PBMNCs i suspensionskultur, med användning av en pipett med en 1 ml spets, i en 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 300 xg under 10 min vid RT.
    2. Kasta bort supernatanten och suspendera cellerna i 1 ml färskt PBMNC medium.
    3. Överföra celler i en brunn i 12-brunnar med standardvävnadsodlingsbehandlade ytan, utan beläggning, och inkubera dem vid 37 ° C, 5% CO2 i en fuktad inkubator.

    4. Transfektion av PBMNCs med Episomalt plasmider (dag 14)

    Obs: Utför isolering av fyra kommersiella intergation fria episomala plasmider, bär pluripotens gener med hjälp av ett kommersiellt kit för plasmidrening och bedöma kvaliteten på de renade plasmiderna med hjälp av en agarosgelanalys, enligt tillverkarens anvisningar.

    1. Samla PBMNCs i 15 ml koniska rör och räkna antalet viabla celler (på basis av trypanblåttuteslutning) 25.
    2. Centrifugera 2 x 10 6 celler vid 300 xg under 10 min vid RT.
    3. Resuspendera 2 x 10 6 celler i transfektion blandning innehållande 100 pl resuspensionsbuffert T och 1 mikrogram av varje plasmid-DNA (en plasmid som bär OCT3 / 4 och shRNA mot p53, en plasmid som bär Sox2 och Klf4, enplasmid som bär L-MYC och LIN28, och en plasmid som bär EGFP att kontrollera transfektionseffektiviteten).
    4. Aspirera transfektionsblandning innehållande cellerna in i en 100 | il spets och sätt i pipetten med provet vertikalt i röret, fylld med 3 ml elektrolytisk Buffert E2, placerade i pipetten stationen av elektroporation maskin, i enlighet med tillverkarens instruktioner.
    5. Effektivt elektroporera celler genom att använda följande program: 1.650 V, 10 ms, 3 pulser.
    6. Resuspendera electroporated celler (2 x 10 6 celler) i 2 ml förvärmda PBMNC-medium, tillsätta 0,25 mM natriumbutyrat (NaB) och räkna antalet livsdugliga celler efter elektroporering protokoll (på grundval av trypanblåttuteslutning) 25.
    7. Överföra celler till en brunn i en 6-brunnsplatta utan beläggning, försiktigt vicka plattan och inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 i en fuktad inkubator.
    8. Dagen efter elektroporering, count antalet GFP-positiva celler under fluorescensmikroskopi 8-10 slumpmässiga områden, i syfte att bedöma transfektion effektivitet.
    9. Behåll de transfekterade cellerna utan uppdelning i 3 dagar, tills plätering dem på MEF (se avsnitt 6).
    10. Ersätt 2 ml färskt PBMNCs mediet, plus 0,25 mM NAB varannan dag.

    5. Förbered rätter med Feeder-celler för Co-kultur (DAG 16)

    1. Belägga brunnarna i en 6-brunnsplatta med en ml basalmembranmatris för 15 min vid 37 ° C och platt musen Embryonala fibroblasts (MEFs) vid en densitet av 2 x 10 5 celler / brunn med 2 ml 10% FBS innehöll DMEM (MEF medium) en dag före passage av electroporated PBMNCs på MEF feeder-celler.

    6. Plätering transfekterade PBMNCs på MEF (DAY 17-19)

    1. Samla PBMNCs i suspensionskultur, med användning av en pipett med en ml spets, i 15 ml koniskt rör och centrifugera transfekterade PBMNCs vid 300 xg under 10 minutervid RT.
    2. Kasta supernatanten och suspendera pelleten i 2 ml färskt PBMNC medium plus 0,25 mM NaB.
    3. Plate de celler på MEF-belagd 6 väl-platta och inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 i en fuktad inkubator.
    4. Efter två dagar, aspirera på medellång och ersätta det med 2 ml iPSC medium sammansatt av knockout DMEM (KO-DMEM), 20% KO-Serum Byte (KOSR), 1 mM NEAAs, 1% penicillin / streptomycin, 20 mM L- glutamin, 0,1 mM β-merkaptoetanol, 10 ng / ml FGF (grundläggande bFGF) och 0,25 mM NaB.
    5. Byt 2 ml färskt iPSC medel varje dag och kontrollera cellerna dagligen.
      Obs: Vid ungefär dag 22-25, bör de första kolonier av iPSCs vara synliga.

    7. Plocka och Expansion av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) Kloner (DAY 30-35)

    Obs: Vid ungefär 30-35 dagar efter transfektion, bör IPSC kolonier vara redo för plockning och omstryka. Omprogrammering effektivitet bör vara estiparad som andel av antalet IPSC kolonier / totala antalet elektroporerade celler, som tidigare rapporterats 26.

    1. Dagen innan passage IPSC kolonier, förbereda MEF matare i en 12-brunnar (1,25 x 10 5 celler / brunn).
    2. Aspirera MEF mediet och förändring med 1 ml iPSC medium med 10 ng / ml bFGF och 10 ^ M Y-27632. Dissekera manuellt med en nål en koloni vid varje tidpunkt under dissektionsmikroskop i plock-huven i syfte att erhålla ett rutnät, samla mindre klumpar genom pipettering och överföra dem individuellt varje del i en brunn i 12-brunnars platta belagd med MEF.
    3. Passage och expandera varje 12-brunnsplatta med en 6-brunnsplatta i ett förhållande 1: 2, sedan varje 6-brunnsplatta i ett förhållande 1: 4 för vidare förökning. Dissekera och expandera iPSCs manuellt under de första 2-3 passager (som noggrant beskrivs i steg 7,2), sedan använda ett förfarande enzym dissociation (start från steg 7,4).
    4. För ett enzym dissociation protokoll, ren iPSC Colonies genom att aspirera differentierade delar under dissekera mikroskop i plock-huva.
    5. Inkubera iPSCs med 1 ml kollagenas IV (1 mg / ml) under 10 minuter vid 37 ° C.
    6. Sug enzymlösningen, skölj cellerna med 1 ml KO-DMEM och samla kolonierna i en 15 ml koniska rör. Centrifugera vid 100 xg under 2 min vid rumstemperatur.
    7. Aspirera supernatanten, resuspendera kolonier i 2 ml iPSC medium med 10 ng / ml bFGF och 10 ^ M Y-27.632 och plattan dem på MEF belagda 6-brunnsplatta (förhållande 1: 4).

    8. Karakterisering av iPSCs (Mellan 5-15 Passager)

    1. Alkaline Phosphatase Färgning
      1. Kultur IPSC kolonier för 3-5 dagar i iPSC-medium med 10 ng / ml bFGF.
      2. För att starta ett alkaliskt fosfatas färgningsprotokollet, skölj iPSCs gång med PBS och därefter fixera dem med en ml av 4% PFA i 20 min vid rumstemperatur.
      3. Tvätta cellerna tre gånger med PBS, för att avlägsna återstående PFA.
      4. Fläcken fixerade celler med användning avett kommersiellt alkaliskt fosfatas färgningskit enligt tillverkarens instruktioner.
    2. Immunofluorescens
      1. Kultur IPSC kolonier för 3-5 dagar i iPSC-medium med 10 ng / ml bFGF.
      2. För att starta en immunofluorescensanalys, tvätta iPSCs gång med PBS och därefter fixera dem med en ml av 4% PFA i 20 min vid rumstemperatur.
      3. Tvätta cellerna tre gånger med PBS, för att avlägsna återstående PFA.
      4. Behandla fasta iPSCs med 1 ml permeabilization / blockeringslösning innehållande 4% getserum, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 och 0,05% natriumazid (NaN 3) under en timme vid RT.
      5. Sug den blockerande lösningen och inkubera de fixerade cellerna med primära antikroppar i 3% BSA och 0,05% NaN3 lösning O / N vid 4 ° C (kontrollera materialet tabellen för primär lista antikropp och föreslog antikroppsutspädningsfaktor).
      6. Nästa dag, tvätta iPSCs tre gånger med PBS, sedan inkubera cellerna med Alexa Fluor 488 get-anti-mus och Alexa FlUeller 555 get-anti-kanin-antikroppar, utspädda 1: 1000 i 3% BSA och 0,05% NaN3 lösning, 1 timme vid 37 ° C.
      7. Färga kärnorna med DAPI (1 pg / ml) under 10 minuter vid rumstemperatur i mörker, följt av tre gånger tvättning med PBS.
    3. Differentieringen av iPSCs i Embryoid organ (EBS)
      1. Kultur IPSC kolonier för 5-6 dagar i iPSC-medium med 10 ng / ml bFGF.
      2. Ta differentierade delar från IPSC kolonier genom att aspirera under dissekera mikroskop i plock-huva.
      3. Inkubera iPSCs med 1 ml kollagenas IV (1 mg / ml) under 10 minuter vid 37 ° C.
      4. Sug enzymlösningen, skölj cellerna med 1 ml KO-DMEM och samla kolonierna i en 15 ml koniska rör. Centrifugera vid 100 xg under 2 min vid rumstemperatur.
      5. Aspirera supernatanten och återsuspendera kolonierna i två ml EB-medium sammansatt av KO-DMEM, 20% definierat fetalt bovint serum (FBS), 1 mM NEAAs, 1% penicillin / streptomycin, 20 mM L-glutamin, 0,1 mM46; merkaptoetanol.
      6. Plate IPSC kolonier i suspension 6 dagar på ultralåga fäst 6-brunnars plattor, för att tillåta bildandet av sfäroidala tredimensionella embryoidkroppar (EBS). Ändra 2 ml färskt EB-medium varannan dag.
      7. På dag 7, samla EB och plattan dem på 0,1% gelatinbelagda plattor med 6 brunnar i 2 ml EB mediet och bibehålla EB i differentiering i 20 dagar.
      8. Ändra 2 ml färskt EB-medium varannan dag.
    4. QRT-PCR för genuttryck analys
      1. Kultur IPSC kolonier för 5-6 dagar i iPSC-medium med 10 ng / ml bFGF.
      2. Utdrag totala RNA från PBMNCs, iPSCs eller EBS använder 1 ml kommersiell reagens i enlighet med tillverkarens instruktioner.
      3. Utvärdera RNA-koncentration och renhet genom lämpliga metoder, såsom användning av en spektrofotometer (hög kvalitet RNA med A 260 / A 280 och A 260 / A 230-förhållanden> 1,8) 27.
      4. KontrolleraRNA integritet med hjälp av ett kommersiellt kit enligt tillverkarens protokoll (hög kvalitet RNA RQI> 9,5) 28.
      5. Utföra en omvänd transkriptionsreaktion på en jig av totalt RNA med användning av ett kommersiellt omvänt transkriptas kit enligt tillverkarens instruktioner.
      6. Förbered qPCR blandningar innehållande 5 ng cDNA mall, 7,5 pl SYBR Green Supermix, 2 pl av 5 iM primers (framåt: 1 pl och bakåt: 1 pl) och 6 il RNas / DNas-fritt vatten för varje reaktion 29.
      7. Utför QRT-PCR med användning av följande program: ett initialt denatureringssteg vid 95 ° C under 10 min, följt av 40 cykler uppdelade i ett denatureringssteg vid 95 ° C under 15 sekunder och primer-annealing och förlängningssteg vid 60 ° C under 45 sek 29.
      8. Normalisera expressionen av andra gener med användning av GAPDH såsom hushållning gen 28 (se de primrar som anges i tabell 1).
    5. qPCRför Transgene Uteslutning
      1. Extrahera DNA från PBMNCs eller iPSCs använder en ml av lysbuffert innehållande 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) och 20 pg / ml proteinas K.
      2. Tillsätt en lika volym (1 ml) av 100% isopropanol, blanda genom inversion tre gånger för att möjliggöra DNA-utfällning och centrifugera vid 10.000 xg under 5 min vid RT.
      3. Kassera supernatanten, tvätta DNA-pelleten med en ml 70% etanol och centrifugera vid 10.000 xg under 5 min vid RT. Aspirera och kassera supernatanten och återsuspendera den i RNas / DNas-fritt vatten.
      4. Utvärdera DNA-koncentration och renhet genom lämpliga metoder, såsom användning av en spektrofotometer (hög kvalitet RNA med A 260 / A 280 och A 260 / A 230-förhållanden> 1,8) 27.
      5. Förbered qPCR blandningar innehållande 5 ng DNA-mall, 7,5 pl SYBR Green Supermix, 2 pl 5 iM primers (framåt: 1 pl och bakåt: 1 pl) och 6 &# 181; l RNas / DNas-fritt vatten för varje reaktion 29.
      6. Normalisera expressionen av specifika episomala plasmiden EBNA-1-genen med användning av FBX-15 som hushållning gen 29 (se de primrar som anges i tabell 1).
    6. Karyotyp Analys
      1. Kultur IPSC kolonier för 5-6 dagar på feeder-fri basmembran matris belagda plattan med en kommersiell definierad, matare fritt underhåll medium för iPSCs, enligt tillverkarens anvisningar.
      2. För att starta karyotypen analysprotokoll, lossa IPSC kolonier med en ml celllösgör lösning för 5 min vid 37 ° C, tills man erhåller encelliga dissociation.
      3. Samla cellerna och centrifugera vid 400 xg under 5 min vid RT.
      4. Resuspendera iPSCs i 2 ml av ett medium speciellt utvecklat för att odla celler för prenatal diagnostiska metoder. Tavla encelliga iPSCs Onto basalmembranmatrisbelagda glasskålar och inkubera dem i en 37 ° C, 5% CO 2 </ Sub> inkubator.
      5. Efter 2-4 dagar, tillsätt 10 | il / ml kolchicin direkt till kulturerna och inkubera under 3 h vid 37 ° C, 5% CO2 i en fuktad inkubator.
      6. Aspirera medium och inkubera iPSCs i 1 ml av en hypoton lösning (0,6% natriumcitrat och 0,13% kaliumklorid) under 10 min vid RT.
      7. Skölj celler med 1 ml av 5% ättiksyralösning och fixa iPSCs med metanol / ättiksyralösning (förhållande 3: 1) i en maskin med kontrollerad temperatur och fuktighet (28 ° C, 42% RH).
      8. Sänk och fläckfixerade celler med kinakrin lösning för 15-20 minuter vid rumstemperatur i mörker (för att erhålla Q-band) 30.
      9. Förvärva cellmetafaser under ett fluorescensmikroskop vid 100X förstoring 29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denna studie en enkel och effektiv protokoll för generering av virusfria iPSCs genom omprogrammering av PBMNCs isolerade från frysta gula hinnor efter helblod centrifugering och jämförelse med omprogrammering av PBMNCs erhållna efter densitetsgradient separation rapporterats. Figur 1A visar en schematisk representation av den detaljerade protokoll. Efter upptining, de isolerade PBMNCs, som visar en typisk rund form, expanderas i specifik blododlingsmedium för 14 dagar (Figur 1B) och transfekterades sedan med episomala plasmider. Efter 10-15 dagar efter transfektion, små rundade ljusa kolonier med definierade marginaler och embryonala stamceller-liknande morfologi börjar dyka upp (Figur 1C). Cirka 20-30 dagar efter transfektion, IPSC kolonier blir mycket kompakt, med vassa kanter, öka sin storlek och är redo för plockning och expansion (figur 1D). Efter de första passage steg (2-3 passager),IPSC kolonier behålla sin odifferentierade tillstånd och visar en typisk mänskliga embryonala-stamceller morfologi. Under de första kanalerna, är manuell plockning en effektivare expansions sätt jämfört med enzym dissociation för att välja helt odifferentierade, kompakt och tätt packade kolonier (Figur 2A). Större förstoring av IPSC kolonier visar enskilda celler i kolonierna och den höga kärnan till cytoplasman förhållande lättare observeras (Figur 2B). Efter inledande mekanisk plockning, väljs IPSC kloner utökas med enzym dissociation använder kollagenas IV. Efter 10-15 passager av in vitro expansion är cytogenetisk analys som genomförts på IPSC kolonier. Cirka 20 metafaser från minst två oberoende kulturer, på cirka 300-400 bandnivå, analyseras och alla prover visar en normal karyogram (Figur 2C). Denna observation antyder att iPSCs är genetiskt stabila.

AftER in vitro-expansionen (5-10 passager), är iPSCs kännetecknas för uttrycket av stemness markörer och deras pluripotens potential. Figurerna 3A, B visar att iPSCs är positiva för alkaliskt fosfatas-färgning. Använda QRT-PCR-analys, har vi kontrollerat att iPSCs uttrycker endogena pluripotenta gener (SOX-2, OCT3 / 4, nanog) på betydligt högre nivåer än utgångs PBMNCs, medan uttrycksnivåer av endogen C-MYC och KLF-4 är lika före och efter iPSC omprogrammering (figur 3C). Efter bara 5 passager i odling, kan uttryck av exogena episomala transgener inte detekteras i iPSCs, vilket indikerar en framgångsrik aktivering av endogena pluripotenta gener. PBMNCs 5 dagar efter transfektion, med starka transgenuttryck nivå, som utvärderats av episomala specifika primrar för EBNA-1, används som positiv kontroll. PBMNCs som aldrig utsätts för plasmider som bär de fyra exogena pluripotensbestämmande gener, användes som negativ kontroll (Figur 3D). Slutligen visar immunofluorescensanalys att iPSCs uttrycka pluripotens markörer, såsom OCT3 / 4, SOX-2, SSEA-4, TRA-1-60, och TRA-1-81 (Figur 4).

iPSCs differentieras till embryoidkroppar (EBS) med användning av en spontan differentiering protokoll, såsom visas i fig 5A, för att utvärdera deras in vitro-pluripotens potential. QRT-PCR-experiment visar att iPSCs kan differentiera till celler av de tre germinallager; faktiskt, EBS erhölls efter 20 dagar av differentiering display betydande uppreglering av linjemarkeringar företrädare för endodermen (SOX-7, AFP), mesoderm (CD31, ACTA-2, CDH-5, RUNX-1) och ektoderm (KTR- 14, TH, GABRR-2) (figur 5B). Konfokalmikroskopi analys visar att encelliga dissocieras slå kluster uttrycker typiska cardiomyocyte markörer såsom Troponin I (Tn-I) och α-actinin, organiserade i en klar sarcomeric mönster (figur6A). Dessutom visar immunofluorescensanalys av EBS en positiv färgning för neuronspecifik markör klass III β-tubulin (TUJ1) såväl för dopaminerga neuronala markören tyrosinhydroxylas (TH) (Figur 6B).

Figur 1
Figur 1. Protokoll för generering av iPSCs från humant perifert blod och cell morfologiska förändringar under protokollet. (A) Diagram över det protokoll som används för att generera iPSCs erhållits från frysta PBMNCs efter DGS och PBMNCs isolerade från frysta gula hinnor, med hjälp av en enda transfektion icke-integrerande episomala plasmider. (B) Representativa bilder av prolifererande PBMNCs erhållits från DGS och gula hinnor efter upptining och expansion i odling under 14 dagar, innan de transfekteras. Skalstreck 100 | im. (C) Exempel på IPSC kolonier en vecka efter det att cellerna är plated på MEF. Skalstreck 500 um. (D) Representativa bilder av IPSC kolonier på 30-35 dagar efter åter plätering på en MEF matare lager. Skalstreck 500 um. iPSCs = inducerade pluripotenta stamceller; DGS = densitetsgradient separation; PBMNCs = perifera blodmononukleära celler; MEF = mus embryonala fibroblaster; GF = tillväxtfaktorer; bFGF = basisk fibroblast tillväxtfaktor; NaB = natriumbutyrat. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. morfologi och karyotyp analysen. (A) Representativa bilder av IPSC kolonier efter 2-3 manuella passage steg. Skalstreck 500 um. (B) Större förstoring av IPSC kolonier. Skalstreck 200 um. (C) Representative normala karyograms från iPSCs efter 10-15 passager in vitro expansion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. iPSC karakterisering: alkalisk fosfatasaktivitet, återuttryck av endogena pluripotens gener av iPSCs och utvärdering av transgen tyst (A) och (B) Bilderna visar positiv färgning för alkalisk fosfatas.. Skalstreck 500 um. (C) Den stapeldiagram som visar återuttryck av endogena pluripotens gener (C-Myc, KLF-4, SOX-2, OCT3 / 4 och NANOG) i båda iPSCs erhållits från DGS och gula hinnor, med hjälp av QRT-PCR-analys ( n = 4, Students t-test: * p <0,05, § p <0,005 vs motsvarande PBMNCs). (D) QRT-PCR med episomala specifika primers (EBNA-1) (i förhållande till kontroll FBOX15 primers) visar ingen genomet integrering av episomala vektorer. (N = 4, Students t-test: * p <0,001 mot motsvarande PBMNCs 5-dagars transfektion). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Immunofluorescensanalys av embryonala stamceller pluripotens markörer. Representant immunofluorescensfärgning visar betydande uttryck av pluripotens proteiner SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, OCT3 / 4 och SOX-2. Kärnor motfärgades med DAPI. Skala bar 200 pm för iPSC DGS (A) och iPSC Buffy coat (B). Skala bar 100 pm för iPSC Buffy coat (A), iPSC DGS (B strong>) och (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Protokoll för differentieringen av iPSCs och uttryck av tre GRODDBLAD gener i EBS erhållits från iPSCs. (A) Schematisk bild av protokollet inducera spontan differentiering av iPSCs från PBMNCs efter DGS och gula hinnor i EBS. (B) QRT-PCR-experiment som visar uttrycket av alla tre GRODDBLAD gener: endoderm (SOX-7, AFP), mesoderm (CD31, Acta-2, CDH-5, RUNX-1), och ektoderm (KRT-14, TH, GABRR-2) i EBS efter 20 dagar av differentiering (n = 4, Student t-test: * p <0,05 vs motsvarande iPSCs motsvarighet). EBS = embryoidkroppar./52885/52885fig5large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Konfokalmikroskopi analys av hjärt- och neuronala proteiner i EB på dag 20 av differentiering som erhållits från PBMNCs efter DGS och buffy rockar-härledda iPSCs. (A) Representativa bilder (max projektion av konfokala bildstapel) för hjärt sarcomeric proteiner α-actinin och Troponin I (Tn-I) i encelliga dissocieras slå områden (skalfältet 10 ^ m) och (B) för neuronspecifik markör klass III β-tubulin (TUJ1) och det dopaminerga neuronala markören tyrosinhydroxylas (TH) (skala bar 20 ^ m). Kärnor motfärgades med DAPI. Klicka här för att se en större version avdenna siffra.

Primer Sekvens
C-MYC fw 5'-AGAAATGTCCTGAGCAATCACC-3 '
C-MYC rev 5'-AAGGTTGTGAGGTTGCATTTGA-3 '
KLF-4 fw 5'-ATAGCCTAAATGATGGTGCTTGG-3 '
KLF-4 varv 5'- AACTTTGGCTTCCTTGTTTGG-3 '
SOX-2 fw 5'- GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG-3 '
SOX-2 rev 5'- TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG-3
OCT3 / 4 fw 5'- GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3 '
OCT3 / 4 varv 5'- CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3 '
NANOG fw 5'-TGCAAGAACTCTCCAACATCCT-3 '
NANOG rev 5 &# 8242; -ATTGCTATTCTTCGGCCAGTT-3 '
SOX-7 fw 5'-TGAACGCCTTCATGGTTTG-3 '
SOX-7 rev 5'-AGCGCCTTCCACGACTTT-3 '
AFP fw 5'-GTGCCAAGCTCAGGGTGTAG -3 '
AFP-rev 5'-CAGCCTCAAGTTGTTCCTCTG-3 '
CD31 fw 5'-ATGCCGTGGAAAGCAGATAC-3 '
CD31 rev 5'-CTGTTCTTCTCGGAACATGGA-3 '
ACTA-2 fw 5'-GTGATCACCATCGGAAATGAA-3 '
ACTA-2 rev 5'-TCATGATGCTGTTGTAGGTGGT-3 '
CDH-5 fw 5'-GAGCATCCAGGCAGTGGTAG-3 '
CDH-5 varv 5'-CAGGAAGATGAGCAGGGTGA-3 '
RUNX-1 fw CCCTAGGGGATGTTCCAGAT-3 ' RUNX-1 rev- TGAAGCTTTTCCCTCTTCCA-3 '
KRT-14 fw 5'-CACCTCTCCTCCTCCCAGTT-3 '
KRT-14 rev 5'-ATGACCTTGGTGCGGATTT-3 '
TH fw 5'-TGTACTGGTTCACGGTGGAGT-3 '
TH rev 5'-TCTCAGGCTCCTCAGACAGG-3 '
GABBR-2 fw 5'-CTGTGCCTGCCAGAGTTTCA-3 '
GABBR-2 rev 5'-ACGGCCTTGACGTAGGAGA-3 '
EBNA-1 fw 5'-ATCAGGGCCAAGACATAGAGATG-3 '
EBNA-1 rev- 5'-GCCAATGCAACTTGGACGTT-3 '
FBX-15 fw 5'-GCCAGGAGGTCTTCGCTGTA-3 '
FBX-15 fw 5'-AATGCACGGCTAGGGTCAAA-3 '
GAPDH-fw 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3 '
GAPDH-rev 5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTG-3 '

Tabell 1: Förteckning över QRT-PCR-primers Primersekvenser används för utvärdering av endogen pluripotens genuttryck, transgen tysta och uttryck av tre GRODDBLAD markörer..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Förr i tiden, det enda sättet att få mänskliga pluripotenta stamceller som bär en viss genetisk mutation var att rekrytera föräldrar som genomgår preimplantatorisk genetisk diagnostik och skapa embryonala stamceller från sina kasserade blastocyster 31,32. Med hjälp av en omprogrammering tillvägagångssätt, kan forskarna nu generera iPSCs från patienter som bär nästan alla genotyp. Möjligheten att starta från en patientspecifik cellinjen och en lättillgänglig källa är mycket viktigt eftersom det tillåter en undersökning av patofysiologin av störningar och efterföljande identifiering av nya terapeutiska metoder.

I den aktuella studien, vi kombinerat en plasmid strategi 15 med en metod som redan tillämpas för att åstadkomma iPSCs från PBMNCs tidigare frysts efter densitetsgradient separation 22 och framgångsrikt genererade virusfria iPSCs från frysta buffy coat PBMNCs. Användningen av buffy coats stället för densitetsgradient separerade PBMNCs allaöden oss att minska kostnaderna, arbetstid och manuella steg för operatörer under provbearbetning. Är av avgörande betydelse för studier med förhöjda antalet deltagare och för provsamlingar i multicenterstudier Upplägget av en låg kostnad protokollet använder PBMNCs från frysta gula hinnor. Viktigt förmågan att producera iPSCs från frysta gula hinnor ger tillgång till ett stort antal frysta biosamples redan finns lagrade i blodbanker, med hjälp av en enkel, kostnadseffektiv och inte så tidskrävande metod för provtagning.

Denna induktion metod kan vara användbar för härledning av patientspecifika integrationsfria iPSCs, där kolonier kännetecknas av frånvaron av episomala transgen efter endast några få passager (≥5 passager), i båda utgångsmaterialen. Anmärkningsvärt, observerade vi att alla valda IPSC kolonier som erhållits från båda typerna av utgångsmaterialet display jämförbara pluripotens funktioner och bevarandet av cellulära och molekylära likheter med hESCs, indicating en framgångsrik iPSC härledning och en konsekvent reproducerbarhet av protokollet.

Dessutom har vi framgångsrikt alstrade iPSCs från mer än 10 mänsklig hud fibroblast och tre hjärt mesenkymala stromacellinjer (både från friska givare och patienter med hjärt- och skelettmuskel sjukdomar) med användning av denna metod (data ej visade), vilket tyder på att den beskrivna protokollet kan användas för en framgångsrik omfördelning av olika celltyper. Emellertid är valet av blod som utgångsmaterial fördelaktig jämfört med fibroblaster, särskilt när man beaktar att omfattande utbyggnad av fibroblaster in vitro kan påverka effektiviteten av omprogrammering, baserat på fibroblast passagenummer och proliferationshastighet 33,34. Vår protokoll kan också generering av transgen fria iPSCs från frysta gula hinnor efter en minimal odlingstiden, vilket minskar med cirka 3-4 veckor den tid som behövs för härledning av iPSCs jämfört med andra källor, såsom fibroblasts. Vidare senare studier avslöjade att blodcellhärledda iPSCs uppvisar en epigenetisk signatur som mer liknar hESCs än de som erhållits från mesenkymala stamceller (MSC) / fibroblaster 14,35.

Trots den framgångsrika generationen iPSCs från frysta gula hinnor, några begränsningar måste beaktas i detta protokoll. Innan omprogrammering induktion, kan förstärkningen av PBMNCs från frysta gula hinnor utgör ett kritiskt steg i protokollet. Kvaliteten på utgångsmaterialet kan starkt påverka valet och isolering av PBMNCs, i syfte att uppnå tillräckliga cellantal för omprogrammering förfarande (minst 2 x 10 6 celler för elektroporering). Detta är främst på grund av inneboende biologiska variationer av proverna, men också av tekniska problem. I själva verket är förstärkningen av PBMNCs från frysta gula hinnor mindre effektiva jämfört med PBMNCs erhållits från densitetsgradient separation, tack vare en stark deroende på manuell operatör variabilitet. För att öka reproducerbarhet och effektivitet PBMNC förstärkning från frysta gula hinnor utan densitetsgradient separation, är användningen av automatiserade system rekommenderas starkt att samla buffy coat fraktioner. Även om det är svårare att expandera ett tillräckligt antal PBMNCs från buffy coats än PBMNCs efter densitetsgradient separation, är verkningsgraden hos omprogrammering (ca 0,001-0,0005%) av de två utgångsmaterialen är jämförbar, med ledning av blod omprogrammering effektivitet tidigare rapporterade 14, 23. Eftersom omprogrammering effektivitet är låg för regenerativ medicin ändamål, användning av förbättrade EBNA1 / OriP (från Epstein-Barr-virus, EBV) episomala vektorer kan öka antalet IPSC kolonier för framtida cellterapi utveckling 22,36. Dessutom är en MEF matarskikt för iPSC generering och underhåll som används i våra protokoll. För att erhålla klinisk kvalitet iPSCs kan en matare fritt odlings vara en alternative metod för fortsatta studier.

Sammanfattningsvis innebär detta protokoll en giltig metod för att generera iPSCs från ett lättillgängligt patienten cellkälla med den stora fördelen med att använda en icke-integrerande system som potentiellt kan användas för härledning av klinisk kvalitet iPSCs, inte bara för sjukdom modellering men även för en framtida personlig medicin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube Terumo VF-054SBCS07
Ammodium chloride Sigma-Aldrich A9434
Potassium bicarbonate Sigma-Aldrich 60339
EDTA disodium powder Sigma-Aldrich E5134 0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium  GE Healthcare Life Sciences 17-5442-02 Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)  Gibco 21056-023 No phenol red
Ham's F-12 Mediatech 10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) Gibco 51500-056  1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate Gibco 11905031 1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) PeproTech 300-07 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) 
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) PeproTech 200-03 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) PeproTech 100-11 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO) R&D Systems  287-TC-500 2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone  Sigma-Aldrich D2915 1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin R&D Systems  2914-HT 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II Gibco 11269016 Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1 StemCell Technologies 5850 Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM Gibco 10829-018
Knockout Serum Replacement Gibco 10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140-050
2-Mercaptoethanol  Gibco 31350-010 0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate Sigma-Aldrich B5887 0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa  R&D Systems  4114-TC 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride Sigma-Aldrich Y0503  10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum Hyclone SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution Merck-Millipore ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced BD Biosciences 354230
Collagenase, Type IV Gibco 17104-019 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007 Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) Global Stem GSC-6201G 1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F Addgene  27077 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK Addgene  27078 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL Addgene  27080 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP Addgene  27082 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit Stemgent 00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody Merck-Millipore MAB4304 1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody Merck-Millipore MAB4360 1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody Merck-Millipore MAB4381 1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-9081 1/500
Anti-Nanog Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-33759 1/500
Anti-Troponin I Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-15368 1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody Sigma-Aldrich A7732 1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody Covance Research Products Inc  MMS-435P-100 1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody Calbiochem 657012 1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse  Molecular Probes A-11029 1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit Molecular Probes A-21429 1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate Corning 3471
Trizol Reagent Ambion 15596-018  reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754050 Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 185-5195
Experion Automated Electrophoresis System Bio-Rad 700-7000 Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit Bio-Rad 7007105 Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) Zeiss 495007
NeonTransfection System 100 µl Kit Invitrogen MPK10025 Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System Invitrogen MPK5000 Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  3. Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
  4. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  9. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  10. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  11. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  12. Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
  13. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
  14. Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
  15. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  16. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  17. Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
  18. Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
  19. Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
  20. Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
  21. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  24. Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
  25. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
  26. Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
  27. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
  28. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
  29. Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
  30. Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
  31. Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
  32. Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
  33. Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
  34. Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
  35. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  36. Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).

Tags

Utvecklingsbiologi stamcellsbiologi cellbiologi molekylärbiologi inducerade pluripotenta stamceller perifera mononukleära blodceller omprogrammering episomala plasmider.
Generering av inducerade pluripotenta stamceller från Frozen Buffy Coats använder icke-integrerande Episomalt plasmider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meraviglia, V., Zanon, A., Lavdas,More

Meraviglia, V., Zanon, A., Lavdas, A. A., Schwienbacher, C., Silipigni, R., Di Segni, M., Chen, H. S. V., Pramstaller, P. P., Hicks, A. A., Rossini, A. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids. J. Vis. Exp. (100), e52885, doi:10.3791/52885 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter