Summary
Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) rappresentano una fonte di tessuti paziente-specifici per le applicazioni cliniche e di ricerca di base. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per riprogrammare le cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati in iPSCs-virali gratuito utilizzando non integrano plasmidi episomiale.
Abstract
Cellule somatiche possono essere riprogrammate in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) forzando l'espressione di quattro fattori di trascrizione (ottobre-4, Sox-2, KLF-4, e c-Myc), tipicamente espressa da cellule staminali embrionali umane (hESC) . A causa della loro somiglianza con hESC, iPSCs sono diventati uno strumento importante per il potenziale di medicina rigenerativa paziente-specifici, evitando questioni etiche connesse con hESC. Al fine di ottenere cellule adatte per l'applicazione clinica, iPSCs senza transgene devono essere generati per evitare transgene riattivazione, alterata espressione genica e differenziazione sbagliata. Inoltre, un metodo di riprogrammazione molto efficiente e conveniente è necessario ricavare iPSCs sufficienti a fini terapeutici. Tenuto conto di questa esigenza, un approccio efficiente non integrando episomiale plasmide è la scelta preferibile per IPSC derivazione. Attualmente il tipo di cella più comune utilizzato per scopi di riprogrammazione sono fibroblasti, l'isolamento dei quali richiede biopsia tissutale, un iprocedura chirurgica nvasive per il paziente. Pertanto, sangue periferico umano rappresenta il tessuto più accessibile e meno invasivo per la generazione IPSC.
In questo studio, un protocollo virale senza costo-efficacia e l'utilizzo non integrano plasmidi episomiale è segnalato per la generazione di iPSCs dal periferico cellule umane mononucleate del sangue (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati dopo centrifugazione del sangue intero e senza la densità di separazione gradiente.
Introduction
Nel 2006, il gruppo di Shinya Yamanaka 1 ha dimostrato per la prima volta che le cellule somatiche di topi adulti e gli esseri umani possono essere convertiti in uno stato pluripotente dall'espressione ectopica di quattro fattori di riprogrammazione (ottobre-4, Sox-2, KLF-4, e c-Myc), generando le cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) 2. IPSCs paziente-specifiche sono molto simili a cellule staminali embrionali umane (hESC) in termini di morfologia, la proliferazione e la capacità di differenziarsi in tipi di cellule germinali (tre mesoderma, endoderma ed ectoderma), mentre mancano le preoccupazioni etiche legate all'uso di hESC e bypass possibile rigetto immunitario 3. Così, iPSCs appaiono come una delle più importanti fonti di cellule paziente-specifiche per la ricerca di base, lo screening di stupefacenti, modelli di malattia, la valutazione della tossicità, e fini di medicina rigenerativa 4.
Diversi approcci sono stati utilizzati per la generazione iPSC: vettori virali integrazione(Retrovirus 5, lentivirus 6), virale non integrando vettori (adenovirus 7), Sendai-virus 8, BAC trasposoni 9, vettori episomiale 10, proteine 11 o consegna RNA 12. Sebbene l'uso di metodi di virus-mediata può portare ad alta efficienza riprogrammazione, vettori virali integrano nel genoma delle cellule ospiti e quindi potenziale casuale mutagenesi inserzionale, alterazione permanente di espressione genica, e la riattivazione di transgeni tacere durante la differenziazione non può essere esclusa 13.
Per rendere più sicuro iPSCs per la medicina rigenerativa, sono stati compiuti sforzi per derivare iPSCs senza l'integrazione di DNA esogeno in genomi cellulari. Sebbene siano stati sviluppati vettori virali soggetti ad accisa e trasposoni, è ancora chiaro se sequenze vettore brevi, che inevitabilmente rimangono nelle cellule trasdotte dopo escissione e transposase espressione, potrebbero indurre alterazioni nella cellalare funzionano 13. Nonostante la sua alta efficienza riprogrammazione, virus Sendai rappresenta un approccio costoso e raggiungere, attraverso problemi di licenza con la società che ha sviluppato questo sistema di avere il potenziale per limitarne l'applicazione negli studi traslazionali. Inoltre, la necessità di introduzione diretta di proteine e RNA richiede consegna multiplo di riprogrammazione molecole con le limitazioni tecniche insite questo introduce, e l'efficienza complessiva riprogrammazione è molto bassa 14. Di nota, metodi virali libere e non integrare convenienti basate sull'uso di plasmidi episomiale sono stati riportati con successo per la riprogrammazione dei fibroblasti cutanei 15. In particolare, in questo lavoro abbiamo deciso di utilizzare commerciali plasmidi episomiale senza integrazione disponibili, come riportato in precedenza 10,15.
Fino ad oggi, fibroblasti cutanei rappresentano il più popolare tipo di cellula donatrice 5. Tuttavia, altre fonti di cellule sono stati successfully riprogrammato in iPSCs compresi cheratinociti 16, del midollo osseo cellule staminali mesenchimali 17, cellule stromali adipose 18, follicoli piliferi 19, e le cellule della polpa dentale 20. L'isolamento di queste cellule richiede procedure chirurgiche, e diverse settimane sono necessari per l'espansione delle cellule in vitro allo scopo di stabilire una coltura cellulare primaria.
In questa luce, la selezione del tipo di cellula di partenza è critico ed è altrettanto importante essere in grado di produrre iPSCs dai tessuti facilmente accessibili e meno invasive come sangue. Entrambe le cellule mononucleate del sangue del cordone (CBMNCs) 21,22 e cellule mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) 14,22-24 rappresentano idonee fonti di cellule per la derivazione di iPSCs.
Sebbene l'efficienza di adulti PBMNC riprogrammazione è 20-50 volte inferiore a quella del CBMNCs 22, rimangono il tipo di cella più conveniente per scopo campionamento. InInfatti, campionamento PBMNC ha il vantaggio di essere minimamente invasiva, e in aggiunta, queste cellule non richiedono vasta espansione in vitro prima degli esperimenti di riprogrammazione. Fino ad oggi, i protocolli differenti hanno riferito che PBMNCs dopo la separazione gradiente di densità possono essere congelati e scongelati giorni a diversi mesi dopo il congelamento e ampliato per alcuni giorni prima della riprogrammazione in iPSCs 22,23. Tuttavia, per quanto a nostra conoscenza segnalazioni hanno descritto una riprogrammazione della PBMNCs da buffy coats congelati. È importante sottolineare che, buffy coats congelati raccolti senza separazione gradiente di densità rappresentano i campioni di sangue più comuni memorizzati nella biobanche di grandi dimensioni provenienti da studi di popolazione, rappresentando così una piscina facilmente accessibile di materiale per la produzione di IPSC che evita ulteriormente la raccolta dei campioni.
Qui riportiamo per la prima volta la generazione di iPSCs-virali privi di buffy coats congelati umani, sulla base di un protocollo precedentemente descritto 22. InInoltre, sono stati generati da iPSCs PBMNCs congelati ottenuti dopo la separazione gradiente di densità, come un protocollo di controllo per i risultati PBMNC gradiente di densità non depurati.
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Protocol
Cellule mononucleari del sangue periferico (PBMNCs) sono stati isolati da campioni di sangue periferico di donatori sani, dopo firmato il consenso informato e l'approvazione del Comitato Etico della Provincia di Bolzano. Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki. Tutti i dati sono stati raccolti e analizzati in modo anonimo.
1. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMNCs)
- PBMNCs ottenuti da buffy coats dopo centrifugazione del sangue intero, senza separazione gradiente di densità.
- Raccogliere 8 mL di sangue periferico venoso in un citrato di sodio tamponata tubo di plastica, e conservare a RT (25 ° C). Sangue di processo entro 12 ore dal prelievo.
- Centrifugare la provetta a 2.000 xg per 15 min a 4 ° C in un rotore secchio oscillante, i freni centrifuga spegnimento.
- Raccogliere nuvoloso buffy coat (strato tra la fase di plasma superiore e quella inferioreFase contenente la maggior parte degli eritrociti), contenente la frazione PBMNC arricchito (500 microlitri) in una provetta esageratamente.
- Risospendere 500 ml di buffy coat con 500 pl di mezzo 2x congelamento contenente 90% FBS e 20% DMSO, in modo da ottenere un volume totale di 1 ml con concentrazione DMSO 10%.
- Blocca il flacone in un contenitore di congelamento a velocità controllata a -80 ° C. Cellule Conservare in azoto liquido per periodi più lunghi.
- PBMNCs ottenuti dopo la separazione gradiente di densità
- Raccogliere 12 ml di sangue periferico venoso in citrato di sodio tamponata tubo di plastica, e conservare a temperatura ambiente. Sangue di processo entro 12 ore dal prelievo.
- Diluire il sangue con PBS sterile fino ad un volume finale di 35 ml.
- Cautela e lentamente, strato 35 ml di sangue diluito su 15 ml di soluzione di polysucrose (utilizzata per la separazione gradiente di densità) (p = 1.077) in una provetta conica da 50 ml (rapporto 3: 1).
- Centrifugare la provetta a 800 xg per 30 min a RTun rotore bucket oscillante, i freni centrifuga spegnimento.
- Aspirare la parte superiore, la fase gialla contenente plasma ed eliminarla. Cautela, trasferire lo strato interfase bianco opaco contenente PBMNCs in una nuova provetta conica da 50 ml.
- Portare il volume totale di 30 ml con PBS sterile e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT.
- Eliminare il surnatante e risospendere le cellule con 30 ml di PBS. Contare il numero di cellule vitali, sulla base di trypan esclusione blu 25.
- PBMNCs centrifuga a 300 xg per 10 minuti a temperatura ambiente, aspirare il surnatante e gettarlo.
- Risospendere il pellet di cellule in una quantità appropriata di medie congelamento contenente 90% FBS e 10% DMSO, in modo da ottenere una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml.
- Aliquotare 1 ml per flacone (circa 5 x 10 6 cellule / ml) e congelare la fiala in un tasso controllato congelamento contenitore a - 80 ° C. Cellule Conservare in azoto liquido per periodi più lunghi.
2. di scongelare e placcatura di PBMNCs (DAY 0)
- PBMNCs ottenuti da buffy coats dopo centrifugazione del sangue intero, senza separazione gradiente di densità.
- Per avviare il protocollo utilizzando PBMNCs di buffy coat congelati, scongelare 1 fiala di cellule in un bagno d'acqua a 37 ° C e diluire il buffy coat con PBS sterile fino ad un volume finale di 2 ml.
- Trasferire il buffy coat diluito in una provetta da 50 ml, aggiungere 10 ml di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Per preparare 500 ml di tampone di lisi dei globuli rossi, aggiungere 0,5 g di bicarbonato di potassio, 4.145 g di cloruro di ammonio, 100 ml di soluzione 0,5 M EDTA a 500 ml di acqua ultrapura, pH 7,2-7,4.
- Portare il volume totale di 50 ml con PBS sterile e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT.
- Eliminare il supernatante e lavare il pellet con 50 ml di PBS sterile, centrifugare il buffy coat a 300 xg per 10 min a RT.
- Risospendere le cellule in1 ml di PBMNC media, come precedentemente descritto 22, composto da: IMDM e di Ham F-12 (rapporto 1: 1), 1% di insulino-transferrina-selenio-Etanolammina (ITS-X), l'1% di chimica definita Concentrato Lipid (CDL), 1% penicillina / streptomicina, 0,005% di acido L-ascorbico, lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA), 1-thioglycerol (concentrazione finale 200 micron), Stem Cell Factor SCF (100 ng / ml), interleuchina -3 IL-3 (10 ng / ml), eritropoietina EPO (2 U / ml), Insulin-like Growth Factor IGF-1 (40 ng / ml), desametasone (1 pM) e holo-transferrina (100 ug / ml ).
- Trasferirli in un pozzetto di una piastra 12 pozzetti con superficie trattata coltura tissutale standard senza rivestimento, ad una densità di 2 x 10 6 cellule / ml. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato per 48 ore, fino a quando il cambiamento passo medio (vedere Sezione 3).
- PBMNCs ottenuti dopo la separazione gradiente di densità
- Per avviare il protocollo utilizzando PBMNCs congelati dopoDensità separazione in gradiente, disgelo 1 fiala di cellule in un bagno d'acqua a 37 ° C, trasferire le cellule in 5 ml di PBMNC media. Centrifugare a 300 xg per 10 min a RT.
- Risospendere le cellule in 1 ml di PBMNC medio e trasferirli in un pozzetto di una piastra 12 pozzetti, ad una densità di 2 x 10 6 cellule / ml. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato per 48 ore, fino a quando il cambiamento passo medio (vedere Sezione 3).
3. Cultura ed espansione di PBMNCs (DAY 2-13)
- Raccogliere PBMNCs in coltura in sospensione, con una pipetta con una punta 1 ml, in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT.
- Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno PBMNC fresco.
- Trasferire le cellule in 1 pozzetto della piastra 12 pozzetti con superficie trattata coltura tissutale standard senza rivestimento, e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato.
4. La trasfezione di PBMNCs con episomiale plasmidi (DAY 14)
Nota: Eseguire l'isolamento dei quattro plasmidi episomiale senza intergation commerciali, portando i geni pluripotenziali utilizzando un kit commerciale di purificazione plasmide e valutare la qualità dei plasmidi purificati utilizzando un'analisi gel di agarosio, secondo le istruzioni del produttore.
- Raccogliere PBMNCs in tubo da 15 ml e contare il numero di cellule vitali (sulla base del trypan blue) 25.
- Centrifuga 2 x 10 6 cellule a 300 xg per 10 min a RT.
- Risospendere 2 x 10 6 cellule in mix trasfezione contenente 100 ml di Resuspension Buffer T e 1 mg di ciascun DNA plasmide (una plasmide portando Oct3 / 4 e shRNA contro p53, un plasmide portando SOX2 e Klf4, unoplasmide portando L-MYC e LIN28, e un plasmide portando EGFP, per verificare l'efficienza di trasfezione).
- Aspirare il mix trasfezione contenente le cellule in una punta microlitri 100 e inserire la pipetta con il campione verticalmente nel tubo, riempito con 3 ml di tampone elettrolitica E2, nella stazione pipetta di macchina elettroporazione, secondo le istruzioni del produttore.
- Le cellule in modo efficiente l'elettroporazione utilizzando il seguente programma: 1.650 V, 10 msec, 3 impulsi.
- Risospendere le cellule elettroporate (2 x 10 6 cellule) in 2 ml di pre-riscaldato medio PBMNC, aggiungendo 0,25 mM sodio butirrato (NaB) e contare il numero di cellule vitali dopo protocollo elettroporazione (sulla base del trypan blue) 25.
- Trasferire le cellule in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti senza rivestimento, agitare delicatamente la piastra e incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato.
- Il giorno dopo elettroporazione, Count il numero di cellule GFP-positive al microscopio a fluorescenza 8-10 campi casuali, al fine di valutare l'efficienza di trasfezione.
- Mantenere le cellule transfettate senza suddivisione per 3 giorni, fino a quando li placcatura sul MEF (vedi Sezione 6).
- Sostituire 2 ml di PBMNCs fresco medio, più 0,25 NAB mM ogni due giorni.
5. Preparare Piatti con Feeder cellule per la co-coltura (DAY 16)
- Coat i pozzetti di una piastra da 6 pozzetti con 1 ml di matrice membrana basale per 15 min a 37 ° C e la piastra di fibroblasti embrionali di topo (MEF) ad una densità di 2 x 10 5 cellule / pozzetto con 2 ml di 10% FBS conteneva DMEM (MEF medio) un giorno prima passaging le PBMNCs elettroporate sul feeder cellule MEF.
6. placcatura trasfezionati PBMNCs sul MEF (DAY 17-19)
- Raccogliere PBMNCs in coltura in sospensione, con una pipetta con 1 ml punta, in tubo da 15 ml e centrifugare transfettate PBMNCs a 300 xg per 10 mina RT.
- Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di terreno PBMNC fresco, più lo 0,25 NaB mm.
- Piastra le cellule su MEF rivestite 6 pozzetti e incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato.
- Dopo due giorni, aspirare il terreno e sostituirlo con 2 ml di IPSC medio composto da knockout DMEM (KO-DMEM), il 20% KO-siero sostituzione (KOSR), 1 NEAAs mm, 1% penicillina / streptomicina, 20 mm L- glutammina, 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 10 ng FGF / ml (bFGF base) e 0,25 NaB mm.
- Sostituire 2 ml di fresco medio iPSC ogni giorno e controllare le celle al giorno.
Nota: A circa 22-25 giorni, le prime colonie di iPSCs dovrebbero essere visibili.
7. Raccolta e l'espansione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Clones (DAY 30-35)
Nota: A circa 30-35 giorni dopo la trasfezione, le colonie IPSC dovrebbero essere pronti per la raccolta e replating. L'efficienza riprogrammazione dovrebbe essere estiaccoppiato come la percentuale del numero di colonie IPSC / numero totale di cellule elettroporate, come riportato in precedenza 26.
- Il giorno prima passaging colonie IPSC, preparare l'alimentatore MEF in un 12-pozzetti (1,25 x 10 5 cellule / pozzetto).
- Aspirare il mezzo di MEF e cambiare con 1 ml di IPSC media con 10 ng / ml bFGF e 10 micron Y-27632. Sezionare manualmente con un ago una colonia in ogni volta sotto il microscopio da dissezione alla raccolta-cappa per ottenere una griglia, raccogliere piccoli grumi pipettando e trasferire singolarmente ciascuna in un pozzetto della piastra 12 pozzetti rivestiti con MEF.
- Passaggio ed espandere ciascuna piastra 12 pozzetti ad una piastra da 6 pozzetti in un rapporto 1: 2, allora ogni 6 pozzetti in un rapporto 1: 4 per ulteriore moltiplicazione. Sezionare e ampliare iPSCs manualmente per i primi 2-3 passaggi (come ben descritto nella fase 7.2), quindi utilizzare una procedura enzimatica dissociazione (iniziare dal punto 7.4).
- Per un protocollo enzima dissociazione, pulito iPSC colonies aspirando porzioni differenziati, al microscopio da dissezione alla raccolta cofano.
- Incubare iPSCs con 1 ml di collagenasi IV (1 mg / ml) per 10 minuti a 37 ° C.
- Aspirare la soluzione enzimatica, lavare le cellule con 1 ml di KO-DMEM e raccogliere le colonie in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare a 100 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare il surnatante, risospendere le colonie in 2 ml di COPSI media con 10 ng / ml bFGF e 10 pM Y-27632 e piatto su MEF rivestite 6 pozzetti (rapporto 1: 4).
8. Caratterizzazione di iPSCs (tra 5-15 Passages)
- Fosfatasi alcalina Colorazione
- Cultura colonie IPSC per 3-5 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF.
- Per iniziare un protocollo di fosfatasi alcalina di colorazione, sciacquare iPSCs una volta con PBS e poi fissarli con 1 ml di 4% PFA per 20 minuti a RT.
- Lavare le cellule tre volte con PBS per rimuovere residui di PFA.
- Macchia fisso celle usandoun kit commerciale alcalina fosfatasi colorazione in base alle istruzioni del produttore.
- Immunofluorescenza
- Cultura colonie IPSC per 3-5 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF.
- Per avviare un test di immunofluorescenza, lavare iPSCs una volta con PBS e poi fissarli con 1 ml di PFA 4% per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule tre volte con PBS per rimuovere residui di PFA.
- Trattare iPSCs fissate con 1 ml di permeabilizzazione / blocco soluzione contenente siero di capra 4%, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 e 0,05% di sodio azide (NaN 3) per 1 ora a RT.
- Aspirare la soluzione di saturazione e incubare le cellule fissate con anticorpi primari a 3% di BSA e 0.05% NaN 3 soluzione O / N a 4 ° C (controllare la tabella materiale per la lista anticorpo primario e ha suggerito di anticorpi fattore di diluizione).
- Il giorno dopo, lavare iPSCs tre volte con PBS, poi incubare le cellule con Alexa Fluor 488 capra anti-topo e Alexa Flanticorpi anti-coniglio di capra UOR 555, diluito 1: 1000 in 3% BSA e 0,05% NaN soluzione 3, per 1 ora a 37 ° C.
- Macchiare i nuclei con DAPI (1 ug / ml) per 10 minuti a RT in scuro, seguito da tre lavaggi con PBS tempo.
- Differenziazione dei iPSCs a corpi embrionali (EBS)
- Cultura colonie IPSC per 5-6 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF.
- Rimuovere parti differenziate da colonie IPSC aspirando, sotto il microscopio da dissezione alla raccolta-cappuccio.
- Incubare iPSCs con 1 ml di collagenasi IV (1 mg / ml) per 10 minuti a 37 ° C.
- Aspirare la soluzione enzimatica, lavare le cellule con 1 ml di KO-DMEM e raccogliere le colonie in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare a 100 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare il surnatante e risospendere le colonie in 2 ml di EB mezzo composto KO-DMEM, 20% definito di siero fetale bovino (FBS), 1 NEAAs mM, 1% di penicillina / streptomicina, 20 mM L-glutammina, 0,1 mM46; -mercaptoetanolo.
- Piatto colonie IPSC in sospensione per 6 giorni su fissaggio 6 pozzetti ultra-bassa, in modo da consentire la formazione di sferoidali corpi embrionali tridimensionali (EBS). Cambia 2 ml di fresco medio EB ogni due giorni.
- Il giorno 7, raccogliere EBs e piastra sul 0,1% di gelatina rivestito 6 pozzetti in 2 ml di EB medio e mantenere EBs nella differenziazione per 20 giorni.
- Cambia 2 ml di fresco medio EB ogni due giorni.
- qRT-PCR per l'espressione genica di analisi
- Cultura colonie IPSC per 5-6 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF.
- Estratto RNA totale da PBMNCs, iPSCs o EBs utilizzando 1 ml di reattivo commerciale in conformità con le istruzioni del produttore.
- Valutare la concentrazione di RNA e la purezza con metodi adatti come l'uso di uno spettrofotometro (RNA di alta qualità con A 260 / A 280 e A 260 / A 230 rapporti> 1.8) 27.
- ControllareIntegrità dell'RNA utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore (di alta qualità RNA RQI> 9.5) 28.
- Eseguire una reazione di trascrizione inversa in 1 mg di RNA totale utilizzando un kit trascrittasi inversa commerciale secondo le istruzioni del produttore.
- Preparare le miscele contenenti qPCR 5 ng di cDNA, 7,5 ml SYBR GREEN Supermix, 2 ml di 5 micron primer (forward: 1 ml e reverse: 1 ml) e 6 ml di / acqua priva di DNasi RNasi per ogni reazione 29.
- Eseguire la qRT-PCR utilizzando il seguente programma: una denaturazione iniziale a 95 ° C per 10 minuti, seguito da 40 cicli suddivisi in una fase di denaturazione a 95 ° C per 15 sec e di primer ricottura ed estensione fase a 60 ° C per 45 sec 29.
- Normalizzare l'espressione di altri geni che utilizzano GAPDH come le pulizie gene 28 (vedi i primer elencati nella tabella 1).
- qPCRper Transgene Esclusione
- Estrarre il DNA da PBMNCs o iPSCs utilizzando 1 ml di buffer di lisi contenente 50 mM Tris, EDTA 100 mm, NaCl 100 mm, 1% sodio dodecilsolfato (SDS) e 20 mg / ml proteinasi K.
- Aggiungere un volume uguale (1 ml) di 100% isopropanolo, miscelare capovolgendolo tre volte al fine di consentire la precipitazione del DNA e centrifugare a 10.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Eliminare il supernatante, lavare il pellet di DNA con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare a 10.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare e scartare il surnatante e risospendere in / acqua priva di DNasi RNasi.
- Valutare la concentrazione del DNA e la purezza con metodi adatti come l'uso di uno spettrofotometro (RNA di alta qualità con A 260 / A 280 e A 260 / A 230 rapporti> 1.8) 27.
- Preparare le miscele contenenti qPCR 5 ng di DNA stampo, 7,5 microlitri SYBR GREEN Supermix, 2 ml di 5 micron primer (forward: 1 ml e reverse: 1 ml) e 6 &# 181; l di / acqua priva di DNasi RNasi per ogni reazione 29.
- Normalizzare l'espressione di specifici plasmide episomiale EBNA-1 gene utilizzando FBX-15 come le pulizie gene 29 (vedere i primer elencati nella tabella 1).
- Analisi del cariotipo
- Cultura colonie IPSC per 5-6 giorni sulla piastra rivestita seminterrato matrice membrana senza alimentatore con uno spot definito, terreno di mantenimento senza alimentatore per iPSCs, seguendo le istruzioni del produttore.
- Per avviare il protocollo di analisi cariotipo, staccare colonie IPSC con 1 ml di soluzione di distacco cellulare per 5 min a 37 ° C, fino ad ottenere la dissociazione singola cellula.
- Raccogliere cellule e centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Risospendere iPSCs in 2 ml di un mezzo appositamente sviluppato per coltura di cellule per le tecniche di diagnosi prenatale. IPSCs Piatto monocellulari sulla membrana basale matrici rivestite piatti di vetro e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 </ Sub> incubatrice.
- Dopo 2-4 giorni, aggiungere 10 microlitri / ml colchicina direttamente alle culture e incubare per 3 ore a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato.
- Aspirare il mezzo e incubare iPSCs in 1 ml di una soluzione ipotonica (0,6% di citrato di sodio e cloruro di potassio 0,13%) per 10 minuti a RT.
- Risciacquare le cellule con 1 ml di soluzione di acido acetico al 5% e fissare con iPSCs / soluzione metanolica di acido acetico (rapporto 3: 1) in una macchina con temperatura controllata e umidità (28 ° C, 42% UR).
- Immergere e le cellule macchia fissa con la soluzione Quinacrine per 15-20 minuti a temperatura ambiente al buio (per ottenere Q-banding) 30.
- Acquisire metafasi di cellule al microscopio a fluorescenza ad ingrandimento 100X 29.
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Representative Results
In questo studio un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs-virali libero da riprogrammazione della PBMNCs isolati da buffy coat congelati dopo centrifugazione del sangue intero e confronto con riprogrammazione della PBMNCs ottenute dopo la separazione gradiente di densità è riportato. La figura 1A mostra una rappresentazione schematica di il protocollo dettagliato. Dopo lo scongelamento, i PBMNCs isolato, mostrando una tipica forma arrotondata, vengono espanse in specifico terreno di coltura del sangue per 14 giorni (Figura 1B) e poi trasfettate con plasmidi episomiale. Dopo 10-15 giorni dopo la trasfezione, piccole colonie luminose arrotondati con margini definiti e staminali embrionali morfologia cellulare come iniziare a comparire (Figura 1C). Circa 20-30 giorni dopo la transfezione, le colonie IPSC diventano altamente compatto, con bordi taglienti, aumentano le loro dimensioni e sono pronti per la raccolta e l'espansione (Figura 1D). Dopo i primi passi passaging (2-3 passaggi),colonie IPSC mantengono il loro stato indifferenziato e mostrano una morfologia tipica cellula embrionale-staminali umane. Durante i primi passaggi, raccolta manuale è un modo più efficiente rispetto espansione enzimatica dissociazione per selezionare completamente indifferenziata, compatto e fitto colonie (Figure 2A). Ingrandita ingrandimento di colonie IPSC mostra le singole celle all'interno delle colonie e l'elevato rapporto nucleo citoplasma è più facilmente osservabile (Figura 2B). Dopo la raccolta meccanica iniziale, cloni IPSC selezionati vengono ampliati con la dissociazione enzimatica utilizzando Collagenasi IV. Dopo 10-15 passaggi di espansione in vitro, analisi citogenetica è condotta su colonie IPSC. Circa 20 metafasi di almeno due culture indipendenti, a circa 300-400 livello di banda, vengono analizzati e tutti i campioni mostrano una cariogramma normale (Figura 2C). Questa osservazione suggerisce che iPSCs sono geneticamente stabili.
A poppaer espansione in vitro (5-10 passaggi), iPSCs si caratterizzano per l'espressione di marcatori staminalità e il loro potenziale pluripotenza. Figure 3A, B mostrano che iPSCs sono positivi per alcalina fosfatasi colorazione. Utilizzando l'analisi qRT-PCR, abbiamo verificato che iPSCs esprimono geni pluripotenti endogeni (SOX-2, Oct3 / 4, Nanog) a livelli significativamente più elevati rispetto PBMNCs di partenza, mentre i livelli di espressione di endogena C-MYC e KLF-4 sono simili prima e dopo iPSC riprogrammazione (Figura 3C). Dopo soli 5 passaggi in cultura, espressione dei transgeni episomiale esogeni non può essere rilevato in iPSCs, indicando così l'avvenuta attivazione dei geni pluripotenti endogeni. PBMNCs 5 giorni dopo la transfezione, con un forte livello di espressione del transgene, valutati da primer specifici episomiale per EBNA-1, sono utilizzati come controllo positivo. PBMNCs che non sono mai esposti a plasmidi che trasportano i 4 geni pluripotenza esogeni, sono utilizzati come controllo negativo (Fifigura 3D). Infine, l'analisi di immunofluorescenza rivela che iPSCs esprimono marcatori pluripotenza quali Oct3 / 4, SOX-2, SSEA-4, TRA-1-60, e TRA-1-81 (Figura 4).
iPSCs sono differenziate in corpi embrionali (EBS) utilizzando un protocollo di differenziazione spontanea, come mostrato nella Figura 5A, al fine di valutare il loro potenziale vitro pluripotenza in. esperimenti di qRT-PCR rivelano che iPSCs sono in grado di differenziarsi in cellule dei tre foglietti embrionali; infatti, EBs ottenuta dopo 20 giorni di esposizione significativa differenziazione up-regolazione di marcatori lignaggio rappresentante del endoderma (SOX-7, AFP), mesoderma (CD31, ACTA-2, CDH-5, Runx-1) e ectoderma (KTR- 14, TH, GABRR-2) (Figura 5B). Microscopia confocale mostra che unicellulare dissociata cluster battendo esprimono marcatori cardiomiociti tipici come Troponina I (Tn-I) e α-actinina, organizzato in un modello sarcomerica chiaro (Figura6A). Inoltre, l'analisi di immunofluorescenza EBs mostra una colorazione positiva per il neurone-specifica classe marcatore III β-tubulina (TUJ1) nonché per la dopaminergica neuronale idrossilasi marcatore tirosina (TH) (Figura 6B).
Figura 1. Il protocollo per la generazione di iPSCs da sangue periferico e cellule cambiamenti morfologici umane durante il protocollo. (A) Schema del protocollo utilizzato per generare iPSCs ottenuti da PBMNCs congelati dopo DGS e PBMNCs isolati da buffy coat congelati, utilizzando un unico trasfezione di non integrare plasmidi episomiale. (B) Immagini rappresentative della proliferazione PBMNCs ottenuti da DGS e buffy coats dopo lo scongelamento e l'espansione in coltura per 14 giorni, prima di essere transfettate. Scala bar 100 micron. (C) Esempi di colonie IPSC una settimana dopo le cellule sono plated su MEF. Scala bar 500 micron. (D) Immagini rappresentative della colonie IPSC a 30-35 giorni dopo la ri-placcatura su un alimentatore MEF-layer. Scala bar 500 micron. iPSCs = pluripotenti indotte cellule staminali; DGS = densità separazione pendenza; PBMNCs = cellule mononucleari del sangue periferico; MEF = fibroblasti embrionali di topo; Fattori di GF = crescita; bFGF = fattore di crescita dei fibroblasti di base; NaB = sodio butirrato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Morfologia e analisi del cariotipo. (A) Immagini rappresentative della colonie IPSC dopo 2-3 passaggi passaging manuali. Scala bar 500 micron. (B) Larger ingrandimento delle colonie IPSC. Scala bar 200 micron. (C) RAPPRESEkaryograms normali ntative da iPSCs Dopo 10-15 passaggi di espansione in vitro. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. iPSC caratterizzazione: attività della fosfatasi alcalina, ri-espressione di geni endogeni di pluripotenziali iPSCs e valutazione di silenziamento transgenico (A) e (B) Immagini rappresentative che mostrano la positività per la fosfatasi alcalina.. Scala bar 500 micron. (C) Il grafico a barre che mostra la ri-espressione di geni endogeni pluripotenziali (C-MYC, KLF-4, SOX-2, Oct3 / 4 e Nanog) in entrambi i iPSCs ottenuti da DGS e buffy coats, utilizzando l'analisi qRT-PCR ( n = 4, Student t-test: * p <0.05, § p <0.005 vs PBMNCs corrispondenti). (D) qRT-PCR con primer specifici episomiale (EBNA-1) (relative al controllo primer FBOX15) non mostra genoma integrazione di vettori episomiale. (N = 4, Student t-test: * p <0,001 vs corrispondente PBMNCs 5 giorni trasfezione). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. analisi immunofluorescenza di cellule staminali embrionali marcatori pluripotenza. Immunofluorescenza Rappresentante colorazione mostra significativa espressione di proteine pluripotenza SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Oct3 / 4 e SOX-2. I nuclei sono di contrasto con DAPI. Bar Scala 200 micron per IPSC DGS (A) e IPSC Buffy coat (B). Bar Scala 100 micron per IPSC Buffy coat (A), iPSC DGS (B strong>) e (C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Protocollo per la differenziazione dei iPSCs e espressione dei tre geni strati germinali di EBs ottenuto da iPSCs. (A) Rappresentazione schematica del protocollo indurre la differenziazione spontanea di iPSCs da PBMNCs dopo DGS e Buffy cappotti in EBS. Esperimenti (B) qRT-PCR che mostra l'espressione di tutti i geni di livello tre germinali: endoderma (SOX-7, AFP), mesoderma (CD31, ACTA-2, CDH-5, Runx-1), e ectoderma (KRT-14 TH, GABRR-2) in EBS dopo 20 giorni di differenziazione (n = 4, Student t-test: * p <0.05 vs corrispondente iPSCs controparte). Ebs = corpi embrionali./52885/52885fig5large.jpg "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. analisi Microscopia confocale di proteine cardiache e neuronali in EBs al giorno 20 di differenziazione ottenuta da PBMNCs dopo DGS e cappotti-derivati buffy iPSCs. (A) Immagini rappresentative (proiezione massima di pila di immagini confocale) per le proteine sarcomeriche cardiaci α-actinina e Troponina I (Tn-I) in cella singola dissociate battendo aree (barra della scala 10 micron) e (B) per neurone-specifica classe marcatore III β-tubulina (TUJ1) e il idrossilasi dopaminergici neuronale marcatore tirosina (TH) (scala bar 20 micron). I nuclei sono di contrasto con DAPI. Clicca qui per vedere una versione più grandequesta cifra.
| Primer | Sequenza | ||
| C-MYC fw | 5'-AGAAATGTCCTGAGCAATCACC-3 ' | ||
| C-MYC rev | 5'-AAGGTTGTGAGGTTGCATTTGA-3 ' | ||
| KLF-4 fw | 5'-ATAGCCTAAATGATGGTGCTTGG-3 ' | ||
| KLF-4 rev | 5'AACTTTGGCTTCCTTGTTTGG-3 ' | ||
| SOX-2 fw | 5'GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG-3 ' | ||
| SOX-2 rev | 5'TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG-3 | ||
| Oct3 / 4 fw | 5'GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3 ' | ||
| Oct3 / 4 rev | 5'CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3 ' | ||
| NANOG fw | 5'-TGCAAGAACTCTCCAACATCCT-3 ' | ||
| NANOG rev | 5 &# 8242; -ATTGCTATTCTTCGGCCAGTT-3 ' | ||
| SOX-7 fw | 5'-TGAACGCCTTCATGGTTTG-3 ' | ||
| SOX-7 rev | 5'-AGCGCCTTCCACGACTTT-3 ' | ||
| AFP fw | 5'-GTGCCAAGCTCAGGGTGTAG -3 ' | ||
| AFP rev | 5'-CAGCCTCAAGTTGTTCCTCTG-3 ' | ||
| CD31 fw | 5'-ATGCCGTGGAAAGCAGATAC-3 ' | ||
| CD31 rev | 5'-CTGTTCTTCTCGGAACATGGA-3 ' | ||
| ACTA-2 fw | 5'-GTGATCACCATCGGAAATGAA-3 ' | ||
| ACTA-2 rev | 5'-TCATGATGCTGTTGTAGGTGGT-3 ' | ||
| CDH-5 fw | 5'-GAGCATCCAGGCAGTGGTAG-3 ' | ||
| CDH-5 giri | 5'-CAGGAAGATGAGCAGGGTGA-3 ' | ||
| Runx-1 fw | CCCTAGGGGATGTTCCAGAT-3 ' | Runx-1 giro | TGAAGCTTTTCCCTCTTCCA-3 ' |
| KRT-14 fw | 5'-CACCTCTCCTCCTCCCAGTT-3 ' | ||
| KRT-14 rev | 5'-ATGACCTTGGTGCGGATTT-3 ' | ||
| TH fw | 5'-TGTACTGGTTCACGGTGGAGT-3 ' | ||
| Rev TH | 5'-TCTCAGGCTCCTCAGACAGG-3 ' | ||
| GABBR-2 fw | 5'-CTGTGCCTGCCAGAGTTTCA-3 ' | ||
| GABBR-2 rev | 5'-ACGGCCTTGACGTAGGAGA-3 ' | ||
| EBNA-1 fw | 5'-ATCAGGGCCAAGACATAGAGATG-3 ' | ||
| EBNA-1 giro | 5'-GCCAATGCAACTTGGACGTT-3 ' | ||
| FBX-15 fw | 5'-GCCAGGAGGTCTTCGCTGTA-3 ' | ||
| FBX-15 fw | 5'-AATGCACGGCTAGGGTCAAA-3 ' | ||
| GAPDH fw | 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3 ' | ||
| GAPDH rev | 5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTG-3 ' |
Tabella 1: Elenco di primer qRT-PCR sequenze primer utilizzati per la valutazione dell'espressione genica pluripotenza endogena, transgene silenziamento e l'espressione di tre marcatori di livello germe..
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Discussion
In passato, l'unico modo per ottenere cellule staminali pluripotenti umane che trasportano una particolare mutazione genetica è stato quello di reclutare genitori sottoposti a diagnosi genetica pre-impianto e generare cellule staminali embrionali da loro blastocisti scartate 31,32. Utilizzando un approccio riprogrammazione, i ricercatori possono ora generare iPSCs di pazienti portatori di praticamente qualsiasi genotipo. La possibilità di partire da una linea cellulare paziente-specifica ed una fonte facilmente accessibile è molto importante in quanto permette un'indagine della fisiopatologia dei disturbi e la successiva identificazione di nuovi approcci terapeutici.
Nel presente studio, abbiamo combinato un approccio plasmide 15 con un metodo già applicato per produrre iPSCs da PBMNCs precedentemente congelati dopo gradiente di densità separazione 22 e iPSCs senza virus generati con successo da congelati PBMNCs buffy coat. L'uso di buffy coat anzichè il gradiente di densità PBMNCs separati tuttiOWS di ridurre costi, tempi di lavoro e di passaggi manuali per gli operatori durante l'elaborazione del campione. Il set-up di un protocollo a basso costo utilizzando PBMNCs da buffy coats congelate è essenziale per gli studi con elevata numero di partecipanti e per le collezioni di campioni negli studi multicentrici. È importante sottolineare che la capacità di produrre iPSCs da buffy coats congelati permette di accedere a numerosi biosamples congelati già conservati in banche del sangue, utilizzando un metodo semplice, tempo conveniente e non così consumare per la raccolta dei campioni.
Questo metodo di induzione può essere utile per la derivazione di iPSCs senza integrazione specifici del paziente, dove colonie sono caratterizzati dall'assenza di episomiale transgene dopo pochi passaggi (≥5 passaggi), in entrambi i materiali di partenza. Sorprendentemente, abbiamo osservato che tutte le colonie IPSC selezionati ottenuti da entrambi i tipi di partire visualizzazione materiale caratteristiche pluripotenza comparabili e la conservazione di somiglianze cellulari e molecolari di hESC, indicating una derivazione IPSC di successo e una riproducibilità consistente del protocollo.
IPSCs Inoltre, abbiamo generato con successo da più di 10 fibroblasti della pelle umana e 3 linee di cellule mesenchimali stromali cardiache (sia da donatori sani e pazienti affetti da malattie del muscolo cardiaco e scheletrico) utilizzando questo metodo (dati non riportati), suggerendo così che il protocollo descritto può essere utilizzato per la riprogrammazione successo di tipi di cellule differenti. Tuttavia, la scelta di sangue come materiale di partenza è vantaggioso rispetto ai fibroblasti, soprattutto se si considera che una vasta espansione di fibroblasti in vitro può influenzare l'efficienza di riprogrammazione, basata sul numero e la proliferazione dei fibroblasti passaggio tasso 33,34. Il nostro protocollo consente inoltre la generazione di iPSCs senza transgene di buffy coat congelati dopo un tempo di coltura minimo, riducendo di circa 3-4 settimane, il tempo necessario per la derivazione di iPSCs rispetto ad altre fonti, come fifibroblasti. Inoltre, studi recenti hanno rivelato che iPSCs derivati dalle cellule del sangue mostrano una firma epigenetico che assomiglia più da vicino hESC rispetto a quelli ottenuti da cellule mesenchimali staminali (MSC) / fibroblasti 14,35.
Nonostante il successo generazione di iPSCs da buffy coats congelati, alcune limitazioni devono essere considerati in questo protocollo. Prima di riprogrammazione di induzione, l'amplificazione di PBMNCs da buffy coats congelato potrebbe rappresentare un passo fondamentale del protocollo. La qualità del materiale di partenza può influenzare fortemente la selezione e l'isolamento di PBMNCs, al fine di ottenere il numero di cellule sufficiente per procedura riprogrammazione (almeno 2 x 10 6 cellule per elettroporazione). Ciò è dovuto principalmente alla intrinseca variabilità biologica dei campioni, ma anche per problemi tecnici. Infatti, l'amplificazione di PBMNCs di buffy coat congelati è meno efficiente rispetto a PBMNCs ottenute dalla separazione gradiente di densità, a causa di una forte dependenza sul manuale variabilità dell'operatore. Al fine di migliorare la riproducibilità e l'efficienza del PBMNC di amplificazione da buffy coats congelati senza separazione gradiente di densità, l'uso di sistemi automatizzati si consiglia vivamente di raccogliere frazioni buffy coat. Anche se è più difficile espandere un numero sufficiente di PBMNCs di buffy coat di PBMNCs dopo separazione in gradiente di densità, l'efficienza della riprogrammazione (circa 0,001-,0005%) dei due materiali di partenza è paragonabile, secondo il sangue efficienza riprogrammazione precedentemente riportato 14, 23. Dal momento che l'efficienza riprogrammazione è basso per scopi di medicina rigenerativa, l'uso di una migliore EBNA1 / OriP (da virus di Epstein-Barr, EBV) vettori episomiale può aumentare il numero di colonie IPSC per cella futuro sviluppo della terapia 22,36. Inoltre, uno strato alimentatore MEF per la generazione e la manutenzione COPSI è utilizzato nel nostro protocollo. Per ottenere iPSCs uso clinico, una cultura senza alimentatore potrebbe essere un alteMetodo rnative per ulteriori studi.
In conclusione, questo protocollo rappresenta un valido metodo per generare iPSCs da una fonte facilmente accessibile cella paziente con il grande vantaggio di utilizzare un sistema di non-integrazione che possono potenzialmente essere utilizzato per la derivazione di iPSCs ad uso clinico, non solo per la modellazione malattia ma anche per un futuro medicina personalizzata.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
| Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
| Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
| Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
| Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
| Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
| Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
| Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
| Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µl Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
| NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
References
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