Summary
Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) representam uma fonte de tecidos específicos do paciente para aplicações clínicas e de pesquisa básica. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reprogramar células humanas mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados em iPSCs virais-livre usando não-integração plasmídeos epissomais.
Abstract
Células somáticas pode ser reprogramada em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), forçando a expressão de quatro fatores de transcrição (Oct-4, Sox-2, Klf-4 e c-Myc), normalmente expressa por células-tronco embrionárias humanas (hESCs) . Devido à sua semelhança com hESCs, iPSCs tornaram-se uma ferramenta importante para o potencial de medicina regenerativa específica para cada paciente, evitando questões éticas associadas com hESCs. De modo a obter células adequadas para a aplicação clínica, iPSCs livre de transgenes precisam de ser gerado para evitar a reactivação do transgene, a expressão do gene alterada e diferenciação errada. Além disso, um método de reprogramação altamente eficiente e de baixo custo é necessário derivar iPSCs suficientes para fins terapêuticos. Tendo em conta esta necessidade, uma abordagem eficiente não-integração episomal plasmídeo é a melhor escolha para iPSC derivação. Actualmente, o tipo celular mais comum utilizado para fins de reprogramação são fibroblastos, o que requer o isolamento de biopsia de tecido, um invasive procedimento cirúrgico para o paciente. Portanto, sangue periférico humano representa o tecido mais acessível e menos invasivo para a geração da IPSC.
Neste estudo, um protocolo eficaz e viral livre usando não integrando plasmídeos epissomais é relatado para a geração de iPSCs a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados após a centrifugação de sangue total e sem separação de gradiente de densidade.
Introduction
Em 2006, o grupo de Shinya Yamanaka 1 demonstraram pela primeira vez que as células somáticas de ratos e seres humanos adultos pode ser convertido para um estado pluripotente pela expressão ectópica de quatro factores de reprogramação (Oct-4, Sox-2, 4-Klf, e c-Myc), gerando as chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) 2. IPSCs específica para cada paciente se assemelham células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em termos de morfologia, proliferação e capacidade de se diferenciarem em tipos de células germinativas (três mesoderme, endoderme e da ectoderme), enquanto falta as preocupações de ordem ética associados à utilização de hESCs e ignorando possível rejeição imunológica 3. Assim, iPSCs aparecer como uma das mais importantes fontes de células específicas do paciente para a pesquisa básica, a seleção da droga, modelagem de doença, avaliação de toxicidade e efeitos de medicina regenerativa 4.
Várias abordagens têm sido utilizadas para a geração de iPSC: vectores de integração virais(Retrovírus 5, lentivírus 6), viral não-integração de vetores (adenovírus 7), Sendai-vírus 8, 9 BAC transposons, vetores epissomais 10, proteínas 11 ou 12 RNA entrega. Embora o uso de métodos mediada por vírus pode levar a uma alta eficiência de reprogramação, os vectores virais integrar-se no genoma das células hospedeiras e, por conseguinte, mutagénese de inserção aleatória potencial, alteração permanente da expressão do gene, e reactivação de transgenes silenciados durante a diferenciação não pode ser excluído 13.
Para fazer iPSCs mais seguro para a medicina regenerativa, foram feitos esforços para derivar iPSCs sem a integração de DNA exógeno em genomas celulares. Embora os vectores virais ele sujeitos e transposões foram desenvolvidos, ainda não é claro se as sequências de vector, o que inevitavelmente curtas permanecem nas células transduzidas após excisão, e expressão de transposase, poderia induzir alteração na célulaular funcionar 13. Apesar da sua alta eficiência de reprogramação, vírus Sendai representa uma abordagem caro e preocupações atingem-through de licenciamento com a empresa que desenvolveu este sistema tem o potencial de limitar a sua aplicação em estudos translacionais. Além disso, a necessidade de introdução directa de proteínas e RNA requer entrega múltiplo de reprogramação moléculas com as limitações técnicas inerentes Isso introduz e eficiência global de reprogramação é muito baixa 14. De nota, métodos virais livres e não-integração eficaz em termos de custos com base no uso de plasmídeos epissómicos têm sido relatadas com sucesso para a reprogramação de fibroblastos da pele 15. Especificamente, no presente trabalho, decidimos usar plasmídeos epissomais livre de integração disponíveis comerciais, conforme relatado anteriormente 10,15.
Até à data, os fibroblastos da pele representam o mais popular tipo de célula doadora 5. No entanto, outras fontes de células foram successfully reprogramado em iPSCs incluindo queratinócitos 16, medula óssea células-tronco mesenquimais, células do estroma 17 adiposo 18, 19 folículos pilosos e as células da Polpa Dentária 20. O isolamento destas células requer procedimentos cirúrgicos, e várias semanas são necessários para a expansão in vitro de células, a fim de estabelecer uma cultura de células primárias.
Neste contexto, a selecção do tipo de células de partida é crítica e é igualmente importante ser capaz de produzir a partir de tecidos iPSCs facilmente acessíveis e menos invasivas, tais como sangue. Ambas as células mononucleares do sangue do cordão umbilical (CBMNCs 21,22) e células mononucleares de sangue periférico (14,22-24) PBMNCs representam fontes adequadas de células para a derivação de iPSCs.
Embora a eficiência do adulto PBMNC reprogramação é 20-50 vezes mais baixa do que a de CBMNCs 22, eles continuam a ser o tipo de célula mais conveniente para efeitos de amostragem. Emfato, a amostragem PBMNC tem a vantagem de ser minimamente invasivo, e, além disso, estas células não necessitam de grande expansão in vitro antes de experiências de reprogramação. Até à data, os protocolos diferentes têm relatado que PBMNCs após separação por gradiente de densidade pode ser congelado e descongelado dias a vários meses após a congelação e expandido por poucos dias antes de reprogramação em iPSCs 22,23. No entanto, tanto quanto nós estamos cientes há relatos têm descrito a reprogramação da PBMNCs de crostas inflamatórias congelados. Importante, cremes leucocitários congelados recolhidos sem separação por gradiente de densidade representam as amostras de sangue mais comuns armazenadas em bancos de recursos biológicos de grande escala a partir de estudos populacionais, representando, assim, uma piscina facilmente acessível de material para a produção iPSC que evita ainda a coleta de amostras.
Aqui nós relatamos pela primeira vez a geração de iPSCs virais-livre de cremes leucocitários humanos congelados, com base em um protocolo previamente descrito 22. EmAdicionalmente, foram gerados a partir iPSCs PBMNCs congelados obtidos após separação por gradiente de densidade, tal como um protocolo de controlo para os resultados PBMNC gradiente de densidade não-purificadas.
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Protocol
Células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) foram isolados a partir de amostras de sangue periférico humano de dadores saudáveis após assinados consentimento informado e aprovação do Comitê de Ética da província do sul do Tirol. Os experimentos foram conduzidos de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. Todos os dados foram coletados e analisados de forma anônima.
1. Isolamento de Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMNCs)
- PBMNCs obtido a partir de crostas inflamatórias após centrifugação de sangue total, sem separação por gradiente de densidade.
- Recolhe 8 mL de sangue venoso periférico em um citrato de sódio tamponado tubo de plástico, e armazenar a temperatura ambiente (25 ° C). Processo de sangue dentro de 12 horas após a coleta.
- Centrifuga-se o tubo a 2.000 xg durante 15 min a 4 ° C num rotor basculante, de comutação de desligar os freios de centrífuga.
- Recolhe-se o creme leucocitário nublado (a camada entre a fase de plasma superior e a inferiorfase que contém a maior parte dos eritrócitos), contendo a fracção enriquecida PBMNC (500 ul) para um tubo de criotubo.
- Ressuspender 500 ul de buffy coat com 500 ul de meio de congelação 2x contendo 90% de FBS e 20% de DMSO, de modo a obter um volume total de 1 ml com 10% de concentração de DMSO.
- Congelar o frasco dentro de um recipiente de congelamento de taxa controlada a -80 ° C. Células da loja em nitrogênio líquido por períodos mais longos.
- PBMNCs obtida após separação por gradiente de densidade
- Coletar 12 ml de sangue venoso periférico em um citrato de sódio tamponado tubo de plástico, e armazenar a RT. Processo de sangue dentro de 12 horas após a coleta.
- Dilui-se o sangue com PBS estéril para um volume final de 35 ml.
- Cuidadosa e lentamente, camada de 35 ml de sangue diluído em 15 ml de solução de polissacarose (utilizado para separação por gradiente de densidade) (p = 1,077) em um tubo de 50 ml (razão 3: 1).
- Centrifuga-se o tubo a 800 xg durante 30 min à temperatura ambiente emum rotor basculante, comutação-off os freios de centrífuga.
- Aspirar o superior, fase amarela contendo plasma e descartá-lo. Cuidadosamente, transferir a fase interfase branco opaco contendo PBMNCs para um novo tubo de 50 ml.
- Levar o volume total a 30 ml com PBS estéril e centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender as células com 30 ml de PBS. Contar o número de células viáveis, com base na exclusão de azul de tripano 25.
- PBMNCs centrifugue-as a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante e descartá-lo.
- Ressuspender o sedimento de células em uma quantidade apropriada de meio de congelamento contendo 90% de FBS e 10% de DMSO, de modo a obter uma concentração de 5 x 10 6 células / ml.
- Aliquota de 1 ml por frasco (cerca de 5 X 10 6 células / ml) e congelar o frasco em um recipiente de congelamento taxa controlada a - 80 ° C. Células da loja em nitrogênio líquido por períodos mais longos.
2. O descongelamento e chapeamento de PBMNCs (dia 0)
- PBMNCs obtido a partir de crostas inflamatórias após centrifugação de sangue total, sem separação por gradiente de densidade.
- Para iniciar o protocolo utilizando PBMNCs de cremes leucocitários congelados, descongelar uma ampola de células em banho-maria a 37 ° C e dilui-se o creme leucocitário com PBS estéril para um volume final de 2 ml.
- Transferir a buffy coat diluída em um tubo de 50 ml, adicionar 10 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
- Para preparar 500 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos, adicionar 0,5 g de bicarbonato de potássio, 4,145 g de cloreto de amónio, 100 mL de uma solução 0,5 M de EDTA a 500 ml de água ultrapura, pH 7,2-7,4.
- Levar o volume total a 50 ml com PBS estéril e centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
- Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com 50 ml de PBS estéril, centrifugar a buffy coat a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
- Ressuspender as células em1 ml de meio de PBMNC, como anteriormente descrito 22, composto por: IMDM e de Ham F-12 (proporção de 1: 1), concentrado de Lípido 1% de insulina-transferrina-selênio-etanolamina (ITS-X), 1% de Quimicamente Definido (CDL), 1% Penicilina / Estreptomicina, 0,005% de ácido L-ascórbico, 0,5% de Albumina de Soro Bovino (BSA), 1-tioglicerol (concentração final de 200 uM), Stem Cell Factor de SCF (100 ng / ml), interleucina -3 IL-3 (10 ng / mL), eritropoietina EPO (2 U / ml), Insulin-like Growth Factor de IGF-1 (40 ng / ml), dexametasona (1 uM) e de holo-transferrina (100 jig / ml ).
- Transferi-los para um poço de uma placa de 12 poços com a superfície tratada de cultura de tecidos padrão, sem revestimento, a uma densidade de 2 x 10 6 células / ml. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO2 num incubador humidificado durante 48 horas, até que a mudança de passo médio (ver secção 3).
- PBMNCs obtida após separação por gradiente de densidade
- Para iniciar o protocolo utilizando PBMNCs congelados depoisseparação por gradiente de densidade, descongelar uma ampola de células em banho-maria a 37 ° C, transferir as células em 5 ml de meio de PBMNC. Centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
- Ressuspender as células em 1 ml de meio de PBMNC e transferi-los para um poço de uma placa de 12 poços, a uma densidade de 2 x 10 6 células / ml. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO2 num incubador humidificado durante 48 horas, até que a mudança de passo médio (ver secção 3).
3. Cultura e Expansão da PBMNCs (DIA 13/02)
- Recolhe PBMNCs em cultura em suspensão, utilizando uma pipeta com uma ponta de 1 ml, em um tubo de 15 ml e centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio fresco PBMNC.
- Transferir as células em um poço de placa de 12 poços com a superfície tratada de cultura de tecidos padrão, sem revestimento, e incubar a 37 ° C, 5% de CO2 numa incubadora humidif içada.
4. A transfecção de PBMNCs com epissomais plasmídeos (DIA 14)
Nota: Realizar o isolamento dos quatro plasmídeos epissómicos comercial livre de intergation, transportando os genes de pluripotência usando um kit comercial para a purificação de plasmídeo e avaliar a qualidade dos plasmídeos purificados utilizando uma análise em gel de agarose, de acordo com as instruções do fabricante.
- Recolhe PBMNCs em tubo de 15 ml e contar o número de células viáveis (com base na exclusão de azul de tripano) 25.
- Centrifugar 2 x 10 6 células a 300 xg durante 10 min à TA.
- Ressuspender 2 x 10 6 células na mistura de transfecção contendo 100 ul de tampão T Resuspension e 1 ug de cada plasmídeo de DNA (um plasmídeo portador OCT3 / 4 e shRNA contra p53, SOX2 transportando um plasmídeo e KLF4, umplasmídeo portador L-MYC e LIN28, e um plasmídeo portador EGFP, para verificar a eficiência de transfecção).
- Aspirar a mistura de transfecção contendo as células em 100 ul de uma ponta e inserir a pipeta com a amostra verticalmente para dentro do tubo, cheio com 3 ml de Tampão electrolítico E2, colocado na estação de pipeta de máquina de electroporação, de acordo com as instruções do fabricante.
- Células de forma eficiente electroporate usando o seguinte programa: 1.650 V, 10 ms, 3 pulsos.
- Ressuspender as células electroporadas (2 x 10 6 células) em 2 ml de meio de PBMNC pré-aquecido, adicionando 0,25 mM de butirato de sódio (NaB) e contar o número de células viáveis após o protocolo de electroporação (com base na exclusão de azul de tripano) 25.
- Transferir as células em um poço de uma placa de 6 poços sem revestimento, balançar suavemente a placa e incubar as células a 37 ° C, 5% de CO2 numa incubadora humidif içada.
- O dia após eletroporação, count o número de células positivas para GFP sob microscopia de fluorescência 8-10 campos aleatórios, a fim de avaliar a eficácia de transfecção.
- Manter as células transfectadas sem divisão por 3 dias, até plaqueamento em MEFs (ver secção 6).
- Substitua 2 ml de meio PBMNCs fresco, além de 0,25 mM NAB a cada dois dias.
5. Prepare-Pratos com células alimentadoras para o Co-cultura (DIA 16)
- Revestir os poços de uma placa de 6 poços com 1 ml de matriz de membrana basal durante 15 min a 37 ° C e a placa de rato embrionários fibroblastos (MEFs) a uma densidade de 2 x 10 5 células / poço com 2 ml de 10% de FBS contido DMEM (meio de MEF), um dia antes passagem das PBMNCs electroporadas em células alimentadoras MEF-.
6. Galvanização transfectadas PBMNCs Onto MEFs (DIA 17-19)
- Recolhe PBMNCs em cultura em suspensão, utilizando uma pipeta de 1 ml com ponta, em 15 ml de tubos de centrífuga cónico e transfectadas PBMNCs a 300 xg durante 10 minà TA.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 2 ml de meio fresco PBMNC, mais 0,25 NaB mM.
- Placa as células nas MEF-revestido 6 bem-placa e incubar as células a 37 ° C, 5% de CO2 numa incubadora humidif içada.
- Após dois dias, aspirar o meio e substitui-la com 2 ml de meio iPSC composto por DMEM nocaute (KO-DMEM), 20% KO-substituição Serum (KOSR), NEAAs 1 mM, 1% de Penicilina / Estreptomicina, 20 mM de L- A glutamina, 0,1 mM de β-mercaptoetanol, 10 FGF ng / ml (bFGF básico) e NaB 0,25 mM.
- Substitua 2 ml de meio iPSC fresco todos os dias e verificar as células diariamente.
Nota: A cerca de 22-25 dias, as primeiras colônias de iPSCs deve ser visível.
7. colheita e de expansão de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) Clones (DIA 30-35)
Nota: A cerca de 30-35 dias após a transfecção, as colónias IPSC deve estar pronto para a colheita e repique. A eficiência de reprogramação deve ser estiacoplado como a percentagem do número de colónias de IPSC / número total de células electroporadas, tal como relatado anteriormente 26.
- O dia antes passaging colónias IPSC, preparar o alimentador MEF numa placa de 12 poços (1,25 x 10 5 células / poço).
- Aspirar o meio e MEF mudar com 1 mL de meio de iPSC com 10 ng / mL de bFGF e 10 pM Y-27632. Dissecar manualmente com uma agulha de uma colónia de cada vez sob o microscópio de dissecação na apanha-capa, a fim de obter uma rede, recolher aglomerados mais pequenos por pipetagem e transferi-las uma a uma para um poço de placa de 12 poços revestida com MEFs.
- Passagem e expandir-se cada placa de 12 poços para uma placa de 6 cavidades em uma proporção de 1: 2, em seguida, cada placa de 6 cavidades em uma proporção de 1: 4 para posterior multiplicação. Dissecar e expandir iPSCs manualmente para os primeiros 2-3 passagens (como completamente descrito no passo 7.2), em seguida, usar um procedimento de dissociação enzima (iniciar a partir do passo 7.4).
- Para um protocolo de dissociação enzimática, Coloni iPSC limpoes por aspiração porções diferenciadas, sob o microscópio de dissecação na apanha-hood.
- Incubar iPSCs com 1 ml de colagenase IV (1 mg / ml) durante 10 min a 37 ° C.
- Aspirar a solução de enzima, lavar as células com 1 ml de KO-DMEM e recolher as colônias em um tubo de 15 ml. Centrifugar a 100 xg durante 2 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante, ressuspender as colónias em 2 ml de meio iPSC com 10 ng / mL de bFGF e 10 pM Y-27632 e placa-los no MEF-revestido placa de 6 poços (razão 1: 4).
8. Caracterização de iPSCs (entre 5-15 passagens)
- Fosfatase Alcalina Coloração
- Cultura das colónias IPSC para 3-5 dias em meio iPSC com 10 ng / ml bFGF.
- Para iniciar um protocolo de coloração da fosfatase alcalina, lavar iPSCs uma vez com PBS e depois fixá-los com 1 ml de PFA a 4% durante 20 min à TA.
- Lavam-se as células três vezes com PBS, para remover PFA residual.
- Mancha fixo células usandoum kit de fosfatase alcalina comercial de coloração de acordo com as instruções do fabricante.
- Imunofluorescência
- Cultura das colónias IPSC para 3-5 dias em meio iPSC com 10 ng / ml bFGF.
- Para iniciar um ensaio de imunofluorescência, lavar iPSCs uma vez com PBS e depois fixá-los com 1 ml de PFA a 4% durante 20 min à TA.
- Lavam-se as células três vezes com PBS, para remover PFA residual.
- Tratar iPSCs fixas com 1 ml de permeabilização / solução contendo 4% de soro de cabra, 0,1% de BSA, 0,1% de Triton X-100 e 0,05% de azida de sódio (NaN 3 de bloqueio) durante 1 hora à TA.
- Aspirar a solução de bloqueio e incubar as células fixadas com anticorpos primários em 3% de BSA e 0,05% de NaN3 solução o / n a 4 ° C (veja a tabela de materiais para a lista de anticorpo primário e anticorpo sugerido factor de diluição).
- No dia seguinte, lavam iPSCs três vezes com PBS, depois incubar as células com Alexa Fluor 488 anticorpo de cabra anti-ratinho e Alexa FlOs anticorpos anti-coelho de cabra 555 uor, diluído 1: 1000 em 3% de BSA e 0,05% de NaN3 solução, durante 1 hora a 37 ° C.
- Manchar os núcleos com DAPI (1 ug / ml) durante 10 min à temperatura ambiente no escuro, seguido por lavagem três vez com PBS.
- Diferenciação das iPSCs em corpos embrióides (EB)
- Cultura das colónias IPSC para 5-6 dias em meio iPSC com 10 ng / ml bFGF.
- Remover partes diferenciadas de colónias IPSC por aspiração, sob o microscópio de dissecação na apanha-hood.
- Incubar iPSCs com 1 ml de colagenase IV (1 mg / ml) durante 10 min a 37 ° C.
- Aspirar a solução de enzima, lavar as células com 1 ml de KO-DMEM e recolher as colônias em um tubo de 15 ml. Centrifugar a 100 xg durante 2 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as colónias em 2 ml de soro de meio EB composto de KO-DMEM, 20% definido fetal de bovino (FBS), NEAAs 1 mM, 1% de Penicilina / Estreptomicina, 20 mM de L-glutamina, 0,1 mM46; -mercaptoetanol.
- Placa IPSC colónias em suspensão, durante 6 dias de fixação para placas de 6 poços ultra-baixos, a fim de permitir a formação de corpos embrióides esferoidais tridimensionais (EBS). Mudar 2 ml de meio EB fresco a cada dois dias.
- No dia 7, recolher EB e placa-los em 0,1% de gelatina revestidas placas de 6 poços em 2 ml de meio EB EB e manter na diferenciação durante 20 dias.
- Mudar 2 ml de meio EB fresco a cada dois dias.
- qRT-PCR para Análise de Expressão Gênica
- Cultura das colónias IPSC para 5-6 dias em meio iPSC com 10 ng / ml bFGF.
- Extrair o ARN total a partir de PBMNCs, iPSCs ou EB utilizando 1 mL de reagente comercial de acordo com as instruções do fabricante.
- Avaliar a concentração de RNA e pureza através de métodos adequados, tais como o uso de um espectrofotômetro (RNA de alta qualidade com A 260 / A 280 e A 260 / A 230 rácios> 1,8) 27.
- VerificaIntegridade do RNA usando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante (RNA de alta qualidade RQI> 9,5) 28.
- Executar uma reacção de transcrição reversa, 1 ug de ARN total utilizando um kit comercial da transcriptase inversa de acordo com as instruções do fabricante.
- Preparar as misturas qPCR contendo 5 ng de molde de ADNc, 7,5 ul de SYBR Green Supermix, 2 ul de 5 uM (iniciadores forward: 1 ul e reverso: 1 ul) e 6 uL de RNase / água isenta de ADNase para cada reacção 29.
- Realizar a qRT-PCR utilizando o seguinte programa: um passo de desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos divididos em um passo de desnaturação a 95 ° C durante 15 seg e emparelhamento do iniciador e extensão do passo de 60 ° C durante 45 sec 29.
- Normalizar a expressão de outros genes utilizando GAPDH como gene de arrumação 28 (ver os iniciadores listados na Tabela 1).
- qPCRpara Transgene Exclusão
- Extrair DNA de PBMNCs ou iPSCs utilizando 1 mL de tampão de lise contendo Tris 50 mM, EDTA 100 mM, NaCl 100 mM, 1% de sulfato dodecil de sódio (SDS) e 20 ug / ml de Proteinase K.
- Adicionar um volume igual (1 ml) de isopropanol a 100%, misturar por inversão três vezes, a fim de permitir a precipitação de ADN e de centrifugação a 10000 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Descartar o sobrenadante, lava-se a pelete de ADN com 1 ml de etanol a 70% e centrifuga-se a 10.000 xg durante 5 min à TA. Aspirar e desprezar o sobrenadante e ressuspender em que RNase / água isenta de ADNase.
- Avaliar a concentração de DNA e pureza através de métodos adequados, tais como o uso de um espectrofotômetro (RNA de alta qualidade com A 260 / A 280 e A 260 / A 230 rácios> 1,8) 27.
- Preparar as misturas qPCR contendo 5 ng de ADN molde, 7,5 ul de SYBR Green Supermix, 2 ul de 5 uM (iniciadores forward: 1 ul e reverso: 1 ul) e 6 &# 181; l de RNase / água sem ADNase para cada reação 29.
- Normalizar o plasmídeo epissomal de expressão específico do gene EBNA-1 usando FBX-15 como gene de arrumação 29 (ver os iniciadores listados na Tabela 1).
- A análise do cariótipo
- Cultura das colónias IPSC para 5-6 dias Onto matriz da membrana basal livre de alimentador de placa revestida com, um meio de manutenção comercial definido livre de alimentador para iPSCs, seguindo as instruções do fabricante.
- Para iniciar o protocolo de análise de cariótipo, separar colónias IPSC com 1 ml de solução de desprendimento de células durante 5 min a 37 ° C, até se obter a dissociação de uma única célula.
- Recolher as células e centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Ressuspender iPSCs em 2 ml de um meio especificamente desenvolvido para a cultura de células para técnicas de diagnóstico pré-natal. IPSCs de célula única placa para uma membrana basal da matriz revestido pratos de vidro e incube-as em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO 2 </ Sub> incubadora.
- Após 2-4 dias, adicionam-se 10 uL / mL de colchicina directamente para as culturas e incubar durante 3 horas a 37 ° C, 5% de CO2 numa incubadora humidif içada.
- Aspirar o meio e incubar iPSCs em 1 ml de uma solução hipotónica (citrato de sódio 0,6% e cloreto de potássio a 0,13%) durante 10 min à TA.
- Lavar as células com 1 ml de solução de ácido acético a 5% e fixar iPSCs com solução metanol / ácido acético (razão de 3: 1) num aparelho com controlo de temperatura e humidade (28 ° C, 42% HR).
- Mergulhe e células mancha fixa com solução Quinacrine para 15-20 min a RT no escuro (para obter Q-borda) 30.
- Adquirir metáfases de células sob um microscópio de fluorescência a ampliação 100X 29.
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Representative Results
Neste estudo, um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs-virais livre por reprogramação da PBMNCs isoladas a partir de crostas inflamatórias congelados após a centrifugação de sangue total e comparação com a reprogramação da PBMNCs obtidos após separação por gradiente de densidade é relatado. A Figura 1A mostra uma representação esquemática de o protocolo detalhado. Após a descongelação, os PBMNCs isolado, que mostram uma forma típica arredondada, são expandidas em meio de cultura de sangue específico durante 14 dias (Figura 1B) e, em seguida, transfectadas com os plasmídeos epissomais. Após 10-15 dias após a transfecção, pequenas colônias brilhantes arredondados com margens definidas e tronco embrionárias morfologia celular como começar a aparecer (Figura 1C). Aproximadamente 20-30 dias após a transfecção, as colónias tornam-se altamente compacto IPSC, com arestas vivas, aumentar o seu tamanho e estão prontas para a colheita e de expansão (Figura 1D). Após as etapas primeiro Passaging (2-3 passagens),colónias IPSC manter seu estado indiferenciado e mostram uma morfologia humana típica de células estaminais embrionárias. Durante as primeiras passagens, colheita manual é uma maneira de expansão mais eficiente em comparação com a dissociação da enzima, a fim de seleccionar completamente indiferenciado, compacto e firmemente embalada colónias (Figuras 2A). Maior ampliação das colónias IPSC mostra células individuais dentro das colónias e o núcleo de alta citoplasma é mais facilmente observado (Figura 2B). Após a colheita mecânica inicial, clones selecionados IPSC são expandidas com dissociação enzima usando colagenase IV. Depois de 10-15 passagens de expansão in vitro, análise citogenética é realizado em colónias IPSC. Cerca de 20 células em metafase a partir de pelo menos duas culturas independentes, a aproximadamente 300-400 nível de banda, e são analisadas todas as amostras mostram uma cariograma normal (Figura 2C). Esta observação sugere que iPSCs são geneticamente estáveis.
À réer in vitro de expansão (passagens 5-10), iPSCs são caracterizadas para a expressão de marcadores stemness e o seu potencial de pluripotência. As Figuras 3A, B mostram que iPSCs são positivas para a coloração da fosfatase alcalina. Usando a análise de qRT-PCR, verificámos que iPSCs expressar genes pluripotentes endógenos (SOX-2, OCT3 / 4, NANOG) em níveis significativamente mais elevados do que PBMNCs partida, enquanto os níveis de endógeno C-MYC e KLF-4 expressão são semelhantes antes e após iPSC reprogramação (Figura 3C). Depois de apenas cinco passagens em cultura, a expressão de transgenes epissomais exógenos não pode ser detectada em iPSCs, indicando, assim, a activação bem sucedida de genes endógenos pluripotentes. PBMNCs 5 dias após a transfecção, com elevado nível de expressão do transgene, avaliadas por iniciadores específicos epissomais para EBNA-1, são usados como controle positivo. PBMNCs que nunca são expostas a plasmídeos transportando os quatro genes de pluripotência exógenos, são utilizados como controlo negativo (Fifigura 3D). Finalmente, a análise de imunofluorescência revela que iPSCs expressam marcadores de pluripotência, tais como OCT3 / 4, SOX-2, SSEA-4, TRA-1-60, e TRA-1-81 (Figura 4).
iPSCs se diferenciam em corpos embrióides (EBS) utilizando um protocolo de diferenciação espontânea, como mostrado na Figura 5A, a fim de avaliar a sua potencial in vitro pluripotência. experimentos de qRT-PCR revelam que iPSCs são capazes de se diferenciar em células de as três camadas germinais; de fato, o EBS obtido após 20 dias de exibição diferenciação significativa sobre-regulação de marcadores de linhagem representante da endoderme (SOX-7, AFP), mesoderme (CD31, ACTA-2, CDH-5, RUNX-1) e ectoderma (KTR- 14, TH, GABRR-2) (Figura 5B). Análise de microscopia confocal mostra que uma única célula dissociada aglomerados batendo expressam marcadores típicos de cardiomiócitos, tais como troponina I (Tn-I) e α-Actinina, organizado em um padrão sarcomérica claro (Figura6A). Além disso, a análise de imunof luorescência de EBs mostra uma coloração positiva para o marcador de classe III específica dos neurónios β-tubulina (TUJ1), bem como para o marcador neuronal dopaminérgica tirosina hidroxilase (TH) (Figura 6B).
Figura 1. Protocolo para a geração de iPSCs a partir de sangue periférico e células de alterações morfológicas humanos durante o protocolo. (A) Diagrama do protocolo utilizado para gerar iPSCs obtidos a partir PBMNCs congelados após DGS e PBMNCs isolado a partir de crostas inflamatórias congeladas, utilizando uma única transfecção de não integração plasmídeos epissomais. (B) Imagens representativas de proliferando PBMNCs obtidos a partir DGS e crostas inflamatórias após o descongelamento e expansão em cultura durante 14 dias, antes de ser transfectadas. A barra de escala 100? M. (C) Exemplos de colónias IPSC uma semana após as células são plated em MEFs. A barra de escala 500? M. (D) Imagens representativas de colónias IPSC em 30-35 dias após a re-plaqueamento em um alimentador de camada MEF. A barra de escala 500? M. iPSCs = células-tronco pluripotentes induzidas; DGS = densidade separação por gradiente; PBMNCs = Células mononucleares do sangue periférico; MEFs = fibroblastos de rato embrionárias; Factores de crescimento; FG = bFGF = factor de crescimento de fibroblastos básico; NaB = butirato de sódio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Morfologia e análise do cariótipo. (A) Imagens representativas de colónias IPSC após 2-3 passos Passaging manuais. A barra de escala 500? M. (B) Aumentar a ampliação das colônias da IPSC. A barra de escala 200? M. (C) represecariogramas normais ntative de iPSCs após 10-15 passagens de expansão in vitro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. iPSC caracterização: a actividade da fosfatase alcalina, a re-expressão de genes endógenos de pluripotência iPSCs e avaliação de silenciamento do transgene (A) e (B) Imagens representativas que mostram a coloração positiva para a fosfatase alcalina.. A barra de escala 500? M. (C) O gráfico de barras que mostra a re-expressão de genes endógenos de pluripotência (C-MYC, KLF-4, SOX-2, OCT3 / 4 e NANOG) em ambos os iPSCs obtidos a partir de crostas inflamatórias e DGS, usando análise de qRT-PCR ( n = 4, teste t de Student: * p <0,05, § p <0,005 vs PBMNCs correspondentes). (D) qRT-PCR com iniciadores específicos para o epissomais (EBNA-1) (relativo ao controlo iniciadores FBOX15) não mostra nenhum genoma-integração de vectores epissomais. (N = 4, teste t de Student: * p <0,001 vs PBMNCs correspondente 5-dia transfecção). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Análise de imunofluorescência de células-tronco embrionárias marcadores de pluripotência. Imunofluorescência Representante mostrando a expressão significativa de proteínas de pluripotência SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, OCT3 / 4 e SOX-2. Os núcleos são contrastadas com DAPI. Barra de escala de 200 mm para iPSC DGS (A) e casaco iPSC Buffy (B). Barra de escala de 100 mm para revestimento iPSC Buffy (A), iPSC DGS (B strong>) e (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Protocolo para a diferenciação de iPSCs e expressão de três genes camada germinativa em EBs obtido a partir de iPSCs. (A) Representação esquemática do protocolo de indução de diferenciação espontânea de iPSCs de PBMNCs após DGS e Buffy casacos em EBS. Experiências (B) qRT-PCR que mostra a expressão de todos os genes de três camadas germinais: endoderme (SOX-7, AFP), mesoderme (CD31, ATOS-2, 5-CDH, RUNX-1), e ectoderme (KRT-14, TH, GABRR-2) em EBS após 20 dias de diferenciação (n = 4, Student t-test: * p <0,05 vs iPSCs contrapartida correspondente). EBs = corpos embrióides."Target =" _ blank /52885/52885fig5large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. análise de microscopia confocal de proteínas cardíacas e neuronais em EBs no dia 20 de diferenciação obtido a partir PBMNCs após DGS e casacos derivadas buffy iPSCs. (A) (Imagens representativas projeção máxima de pilha de imagens confocal) para proteínas do sarcômero cardíaco α-Actinina e Troponina I (TN-I) em uma única célula dissociada batendo áreas (barra de escala de 10 um) e (B) para a classe de marcador específico para neurónios β III-tubulina (TUJ1) e o marcador neuronal dopaminérgica hidroxilase de tirosina (TH) (escala barra 20 um). Os núcleos são contrastadas com DAPI. Por favor clique aqui para ver uma versão maioreste valor.
| Cartilha | Seqüência | ||
| C-MYC fw | 5'-AGAAATGTCCTGAGCAATCACC-3 ' | ||
| C-MYC rev | 5'-AAGGTTGTGAGGTTGCATTTGA-3 ' | ||
| KLF 4-fw | 5'-ATAGCCTAAATGATGGTGCTTGG-3 ' | ||
| KLF-4 rev | AACTTTGGCTTCCTTGTTTGG 5'-3 ' | ||
| SOX-2 fw | GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG 5'-3 ' | ||
| SOX-2 rev | 5'-3 TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG | ||
| OCT3 / 4 fw | GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG 5'-3 ' | ||
| OCT3 / 4 rev | CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC 5'-3 ' | ||
| NANOG fw | 5'-TGCAAGAACTCTCCAACATCCT-3 ' | ||
| NANOG rev | 5 &# 8242; -ATTGCTATTCTTCGGCCAGTT-3 ' | ||
| SOX-7 fw | 5'-TGAACGCCTTCATGGTTTG-3 ' | ||
| SOX-7 rev | 5'-AGCGCCTTCCACGACTTT-3 ' | ||
| AFP fw | 5'-GTGCCAAGCTCAGGGTGTAG -3 ' | ||
| AFP rev | 5'-CAGCCTCAAGTTGTTCCTCTG-3 ' | ||
| CD31 fw | 5'-ATGCCGTGGAAAGCAGATAC-3 ' | ||
| CD31 rev | 5'-CTGTTCTTCTCGGAACATGGA-3 ' | ||
| ACTA-2 fw | 5'-GTGATCACCATCGGAAATGAA-3 ' | ||
| ACTA-2 rev | 5'-TCATGATGCTGTTGTAGGTGGT-3 ' | ||
| CDH-5 fw | 5'-GAGCATCCAGGCAGTGGTAG-3 ' | ||
| CDH-5 rev | 5'-CAGGAAGATGAGCAGGGTGA-3 ' | ||
| RUNX-1 FW | CCCTAGGGGATGTTCCAGAT-3 ' | RUNX-1 rev | TGAAGCTTTTCCCTCTTCCA-3 ' |
| KRT-14 fw | 5'-CACCTCTCCTCCTCCCAGTT-3 ' | ||
| KRT-14 rev | 5'-ATGACCTTGGTGCGGATTT-3 ' | ||
| TH fw | 5'-TGTACTGGTTCACGGTGGAGT-3 ' | ||
| Rev TH | 5'-TCTCAGGCTCCTCAGACAGG-3 ' | ||
| GABBR-2 FW | 5'-CTGTGCCTGCCAGAGTTTCA-3 ' | ||
| GABBR-2 rev | 5'-ACGGCCTTGACGTAGGAGA-3 ' | ||
| EBNA-1 FW | 5'-ATCAGGGCCAAGACATAGAGATG-3 ' | ||
| EBNA-1 rev | 5'-GCCAATGCAACTTGGACGTT-3 ' | ||
| FBX-15 fw | 5'-GCCAGGAGGTCTTCGCTGTA-3 ' | ||
| FBX-15 fw | 5'-AATGCACGGCTAGGGTCAAA-3 ' | ||
| GAPDH fw | 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3 ' | ||
| GAPDH rev | 5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTG-3 ' |
Tabela 1: Lista de iniciadores de qRT-PCR As sequências dos iniciadores utilizados para a avaliação da expressão do gene endógeno pluripotência, silenciamento do transgene e da expressão de marcadores de três camadas germinativas..
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Discussion
No passado, a única forma de obter células-tronco pluripotentes humanas portadores de uma mutação genética particular foi recrutar pais submetidos a um diagnóstico genético pré-implantação e gerar células-tronco embrionárias a partir de suas blastocistos descartados 31,32. Usando uma abordagem de reprogramação, os pesquisadores podem agora gerar iPSCs de pacientes portadores de virtualmente qualquer genótipo. A possibilidade de iniciar a partir de uma linha de células específica para cada paciente e uma fonte facilmente acessível é muito importante uma vez que permite uma investigação da patofisiologia de distúrbios e subsequente identificação de novas abordagens terapêuticas.
No presente estudo, nós combinamos uma abordagem plasmídeo 15 com um método já aplicado para produzir iPSCs de PBMNCs previamente congelados após a separação em gradiente de densidade 22 e iPSCs livres de vírus gerados com sucesso a partir de congelados PBMNCs creme leucocitário. O uso de cremes leucocitários em vez de gradiente de densidade PBMNCs separados todosuxos-nos a reduzir os custos, tempo de trabalho e etapas manuais para os operadores durante o processamento da amostra. O set-up de um protocolo de baixo custo usando PBMNCs de crostas inflamatórias congelados é essencial para estudos com número elevado de participantes e para coletas de amostras em estudos multicêntricos. É importante ressaltar que a capacidade de produzir iPSCs de crostas inflamatórias congelados permite o acesso a numerosas biosamples congelados já armazenados em bancos de sangue, usando um método simples, o tempo rentável e não tão demorado para coleta de amostras.
Este método de indução pode ser útil para a derivação de iPSCs livre de integração específicos do paciente, onde as colónias são caracterizadas pela ausência de epissomal transgene depois de apenas algumas passagens (≥5 passagens), em ambos os materiais de partida. Notavelmente, observou-se que todas as colónias IPSC selecionados obtidos a partir de ambos os tipos de exibição a partir de material características de pluripotência comparáveis ea preservação das semelhanças celulares e moleculares para hESCs, indicating uma derivação iPSC de sucesso e uma reprodutibilidade consistente do protocolo.
IPSCs Além disso, têm gerado com êxito a partir de mais do que 10 fibroblastos de pele humana e 3 linhas de células do estroma mesenquimal cardíacas (tanto de dadores saudáveis e pacientes com doenças do músculo esquelético e cardíaco) utilizando este método (dados não apresentados), sugerindo assim que o protocolo descrito pode ser usado para a reprogramação de diferentes tipos de células. No entanto, a escolha de sangue como material de partida é vantajoso comparado com os fibroblastos, especialmente quando se considera que a grande expansão de fibroblastos in vitro pode afectar a eficiência de reprogramação, com base no número e taxa de proliferação de fibroblastos de passagem 33,34. Nosso protocolo também permite a geração de iPSCs livre de transgenes a partir de crostas inflamatórias congelados após um tempo de cultura mínimo, reduzindo, assim, de cerca de 3-4 semanas, o tempo necessário para a derivação de iPSCs em comparação com outras fontes, tais como fifibroblastos. Além disso, estudos recentes revelaram que iPSCs derivadas de células sanguíneas exibir uma assinatura epigenética que se assemelha mais estreitamente hESCs do que aqueles obtidos a partir de células estaminais mesenquimais (MSC) / fibroblastos 14,35.
Apesar de a geração bem sucedida de iPSCs de cremes leucocitários congelados, algumas limitações devem ser consideradas no presente protocolo. Antes de reprogramação de indução, a amplificação de PBMNCs de crostas inflamatórias congelados poderia representar um passo fundamental do protocolo. A qualidade do material de partida pode influenciar fortemente a selecção e isolamento de PBMNCs, a fim de alcançar os números de células suficientes para o procedimento de reprogramação (pelo menos 2 x 10 6 células para electroporação). Isto é principalmente devido à variabilidade biológica intrínseca das amostras, mas também a questões técnicas. Com efeito, a amplificação de PBMNCs de cremes leucocitários congelados é menos eficiente em comparação com PBMNCs obtidos a partir de separação por gradiente de densidade, devido a uma forte dependence sobre a variabilidade do operador manual. A fim de melhorar a reprodutibilidade e a eficiência de amplificação a partir de crostas inflamatórias PBMNC congelados sem separação por gradiente de densidade, a utilização de sistemas automáticos é fortemente recomendada para recolher fracções de camada leuco-plaquetária. Embora seja mais difícil para expandir um número suficiente de PBMNCs de crostas inflamatórias que PBMNCs após separação por gradiente de densidade, a eficiência de reprogramação (cerca 0,001-0,0005%) dos dois materiais de partida é comparável, de acordo com a eficiência de reprogramação sangue previamente relatada 14, 23. Uma vez que a eficiência de reprogramação é baixa para fins de medicina regenerativa, a utilização de melhorado EBNA1 / OriP (a partir de vírus de Epstein-Barr, EBV) vectores epissomais podem aumentar o número de colónias de células IPSC para futuro desenvolvimento da terapia 22,36. Além disso, uma camada de alimentação MEF para a geração e manutenção iPSC é usado no nosso protocolo. A fim de obter iPSCs de grau clínico, uma cultura livre de alimentador pode ser uma alternative método para estudos posteriores.
Em conclusão, este protocolo representa um método válido para gerar iPSCs a partir de uma fonte facilmente acessível de células do paciente com a grande vantagem de usar um sistema de não-integrativo que pode, potencialmente, ser utilizados para a derivação de iPSCs de grau clínico, não só para a modelagem doença mas também para um futuro medicina personalizada.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
| Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
| Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
| Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
| Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
| Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
| Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
| Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
| Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µl Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
| NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
- Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
- Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
- Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
- Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
- Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
- Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
- Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
- Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
- Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
- Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
- Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).
