Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Etablering og karakterisering af UTI og CAUTI i en musemodel

Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52892
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Abstract

Urinvejsinfektioner (UTI) er meget udbredt, en væsentlig årsag til sygelighed og er i stigende grad resistente over for behandling med antibiotika. Hunner er uforholdsmæssigt ramt af UTI: 50% af alle kvinder vil have en UTI i deres levetid. Derudover 20-40% af disse kvinder, der har en indledende UTI vil lide en gentagelse med nogle lider hyppige gentagelser med alvorlig forværring af livskvaliteten, smerter og ubehag, afbrydelse af daglige aktiviteter, øget udgifter til sundhedsvæsenet, og få behandlingsmuligheder andre end langsigtede antibiotisk profylakse. Uropatogen Escherichia coli (UPEC) er den primære agens af fællesskab erhvervede UTI. Kateter-associeret UTI (CAUTI) er den mest almindelige hospital erhvervet infektion tegner sig for en million forekomster i USA årligt og dramatiske udgifter til sundhedsvæsenet. Mens UPEC er også den primære årsag til CAUTI, andre agenser er af øget betydning, herunder Enterococcusfaecalis. Her udnytter vi to veletablerede musemodeller, der rekapitule- mange af de kliniske karakteristika for disse menneskelige sygdomme. For UTI, en C3H / høne model sammenfatter mange af funktionerne i UPEC virulens observeret hos mennesker, herunder vært reaktioner, IBC dannelse og filamentering. For CAUTI, en model med C57BL / 6-mus, som bevarer kateter blære implantater, har vist sig at være modtagelige for E. faecalis blærebetændelse. Disse repræsentative modeller bliver brugt til at få markante nye indsigter i patogenesen af ​​UTI sygdom, der fører til udvikling af nye lægemidler og ledelse eller forebyggelsesstrategier.

Introduction

Urinvejsinfektioner (UVI) er en af ​​de mest almindelige bakterielle infektioner, og kan opdeles i to kategorier baseret på den mekanisme af erhvervelse, fællesskab og nosokomiel erhvervet UTI. Erhvervet uden urinvejsinfektioner ofte forekommer i ellers raske kvinder og undersøgelser har vist, at ca. 50% af kvinder vil have mindst én UTI i deres levetid 1. Derudover gentagelse er et stort problem. En kvinde, der har en indledende akut infektion har en 25-40% chance for at få en anden infektion inden for seks måneder på trods af passende antibiotisk behandling og mange kvinder fortsat har hyppige gentagelser 2. De bakterier, der forårsager disse infektioner er også stadig mere antibiotikaresistente yderligere forstyrrende behandlingsprotokoller 3-6. UTI påvirke millioner af enkeltpersoner hvert år koster cirka 2,5 milliarder dollars i sundhedspleje relaterede udgifter i USA, understreger virkningen og forekomsten af ​​sygdommen1,7 .Nosocomial erhvervede urinvejsinfektioner er hovedsageligt forbundet med tilstedeværelsen af udenlandske organer såsom indlagte katetre. Kateter-associeret urinvejsinfektioner (CAUTI) fortsat den mest almindelige nosokomielle erhvervet UTI, der tegner sig for ~ 70-80% af sådanne infektioner 8. Endvidere er CAUTI forbundet med øget sygelighed og dødelighed, og det er den mest almindelige årsag til sekundære blodbanen infektioner 9.

UPEC associeret nosocomiel urinvejsinfektioner menes at være forårsaget af indførelsen af bakterier i blæren fra reservoirer i mavetarmkanalen via mekanisk manipulation under samleje, dårlig hygiejne eller andre mikrobielle populationsdynamik mellem forskellige vært nicher 10. Når du er inde i blæren, UPEC ansætte mange virulensfaktorer, herunder kapsel, erhvervelse jern systemer, toksiner, en virulensplasmid, tRNA'er, sygdomsfremkaldende evne øer og kolonisering faktorer, der har vist sig at spille en rolle i patogenesen <sup> 11-14. Afgørende for etableringen af UPEC kolonisering, UPEC også kode flere typer af selvklæbende chaperone indvarsle vejen (CUP) pili, der genkender receptorer med stereokemiske specificitet 15. Type 1 pili, tippet med FimH adhæsinet, udtrykkes af UPEC og binder mannosyleret uroplakins 16 og α-1, β-3 integriner 17, som er udtrykt på den luminale overflade af både menneskelige og mus blærer 18. Disse FimH-medierede interaktioner lette bakteriel kolonisering og invasion af de overfladiske epitelceller 19,20. Inde i cellen, kan UPEC undslippe ind i cytoplasmaet, hvor en enkelt bakterie kan hurtigt opdele til dannelse af en intracellulær bakteriel samfund (IBC), som ved modning, kan indeholde ~ 10 4 bakterier 21. IBC-dannelse er blevet påvist i mindst seks forskellige musestammer, C3H / HeN, C3H / HeJ, C57BL / 6, CBA, FVB / NJ og BALB / c, og med en lang række forskellige UPEC-stammer og andre Enterobacteriaceae 22-24. Men tidsmæssige og rumlige forskelle IBC-dannelse kan variere afhængigt af muse baggrund og den inficerende UPEC stamme. I C3H / HeN mus inficeret med den prototypiske UPEC stammerne UTI89 eller CFT073, IBC-dannelse kan visualiseres som små biomasser af bakterier så tidligt som 3 hpi (timer efter infektion). Dette fællesskab fortsætter med at udvide og når et "midtpunkt" af udviklingen ca. 6 hpi når stavformede bakterier optager en stor procentdel af det cytoplasmatiske rum af terminalt differentierede overfladiske paraply celler Disse tidlige IBC form i en forholdsvis synkron måde med de fleste viser lignende dimensioner og morfologier. ~ 8 hpi bakterierne i IBC ændringen fra en baciller til cocci morfologi. IBC er forbigående. Således IBC modning 12-18 HPI resulterer i fortsat udbygning af den bakterielle population, efterfulgt af deres filamentering og spredning ud af cellen with efterfølgende spredning til omkringliggende celler 23. Således IBC niche tillader hurtig bakteriel vækst i et miljø beskyttet mod værtens immunrespons og antibiotika 25. De forskellige stadier af UPEC infektion, der er set i mus er også observeret i mennesker, såsom IBC'er og filamentering, støtter musemodel for UTI som en gavnlig værktøj, der kan bruges til at modellere UTI hos mennesker 22,26-28.

Mens et flertal af kvinder oplever en UTI i deres liv, kan udfaldet af disse infektioner spænder fra akut selvbegrænsende infektion med ingen gentagelse, at hyppige tilbagevendende blærebetændelse. Endvidere har undersøgelser vist en stærk familiær forekomst af UTI, hvilket tyder på en genetisk komponent bidrager til UTI modtagelighed 29. Vi har fundet, at de forskellige UTI resultater set i klinikker kan spejles af de forskellige resultater af eksperimentel UPEC smitte blandt indavlede musestammer 30. F.eks C3H / høne, CBA, DBA, og C3H / HeOuJ mus er modtagelige, i en infektiøs dosis-afhængig måde, at langvarig, kronisk cystitis karakteriseret ved vedvarende, høj titer bakterier (> 10 4 kolonidannende enheder (CFU) / ml), høj titer bakterielle blære byrder på offer> 4 uger efter infektion (WPI), kronisk inflammation og urotelial nekrose. Disse mus viser også forhøjede serumniveauer af IL-6, G-CSF, KC, og IL-5 inden for den første 24 hpi, der tjener som biomarkører for udvikling af kronisk blærebetændelse. Dette kan nøjagtigt repræsentere det naturlige forløb af UTI hos nogle kvinder, som placebo undersøgelser har vist, at en stor procentdel af kvinder oplever UTI bevarer høje niveauer af bakterier i deres urin i flere uger efter de første symptomer på blærebetændelse, hvis ikke givet antibiotisk behandling 31 , 32. Endvidere bruger C3H / HeN mus, fandt vi, at en historie af kronisk blærebetændelse er en væsentlig risikofaktor for efterfølgende svære tilbagevendende infektioner. Tilbagevendende UTI er det mest significant kliniske manifestation af UTI og C3H / høne mus er i øjeblikket den eneste undersøgte model, der rekapitulerer en øget disposition efter tidligere eksponering. En anden UTI resultatet er sammenfattet i C57BL / 6 mus, hvor akut UPEC infektion er selvbegrænsende, med opløsning på blære betændelse og bakteriuri inden for ca. en uge. Interessant i denne model, UPEC danner let hvilende intracellulære -reservoirer i blæren væv, hvorfra UPEC er i stand til at opstå fra en hvilende tilstand til reinitiere en aktiv UTI, potentielt forklare en mekanisme til samme stamme tilbagevendende UTI hos mennesker 33, 34.

Ud over genetiske indflydelser på UTI modtagelighed, indføring af et kateter i blæren øger sandsynligheden for at have en infektion samt øge udvalget af bakterier i stand til at forårsage en infektion. Det er blevet påvist, at human urin kateterisation forårsager histologiske ogimmunologiske forandringer i blæren på grund af mekanisk belastning, der resulterer i en robust inflammatorisk respons, delaminering, ødemer i lamina propria og submucusa, urotelial udtynding, og mucosale læsion i urinvejene og nyrer 35,36. Derudover kateteret tilvejebringer en overflade for bakteriel fastgørelse derved skabe et miljø udnyttet af flere arter at forårsage CAUTI. Mens UPEC er stadig en vigtig bidragyder, Enterococcus faecalis tegner sig for 15% af disse CAUTI 37. E. faecalis bliver mere og mere resistente over for antibiotika med vancomycinresistens fremkomst, hvilket udgør en alvorlig sundhedsmæssig bekymring 38. E. faecalis besidder mange virulensfaktorer, herunder toksiner og adhæsiner er nødvendige til fastgørelse til både kateteret og epitel 38. Under urin kateterisation, værten er sårbar over for mikrobiel vedhæftning, formering og spredning i urinvejene 39,40. E. faecalis danner en biofilm på kateteret som del af en mekanisme til at forblive i blæren og formidle til nyrerne, som er gengivet i en mus CAUTI model 41. For nylig er det blevet vist under blærekateterisation er fibrinogen (Fg) udsættes i blæren som en del af den inflammatoriske respons. Fg akkumuleres i blæren, frakker kateteret og er essentiel for E. faecalis biofilm dannelse, der fungerer som en vedhæftet fil stillads. I en C57BL / 6 musemodel for CAUTI, opdagede vi, at E. faecalis biofilmdannelse på katetret, og således persistens i blæren, var afhængig af EBP pilus, specielt dens spids adhæsin EbpA. Vi fandt, at det N-terminale domæne af EbpA specifikt binder til Fg-belægning af kateteret. Derudover blev det fundet, at E. faecalis udnytter Fg som metabolit kilde under infektion og dermed øge biofilmdannelse 42.

Musemodeller har vist sig afgørende for understanding samt forudsige kliniske manifestationer af UTI og CAUTI 41. I denne artikel demonstrerer vi forberedelse af blærebetændelse UPEC inokulum isolere UTI89 og transuretral podning af C3H / HeN mus. Derudover viser vi en protokol for kateter indsætning i C57BL / 6-mus og inokulering af E. faecalis OG1RF stamme. Begge disse teknikker fører til konsekvent og pålidelig UTI eller CAUTI i mus. Vi viser også teknikker, der anvendes til at observere IBC dannelse under akut blærebetændelse og urinopsamling til analyse af kroniske eller tilbagevendende blærebetændelse. C3H / HeN mus er blevet anvendt til at undersøge aspekter af UPEC patogenese herunder indledende bakteriel invasion, IBC dannelse, filamentering og udvikling af kronisk blærebetændelse 23,33,43. Disse virulens parametre er også blevet undersøgt i en række andre mus baggrunde 22,33. For CAUTI, C57BL / 6-modellen giver mulighed for fremmedlegeme implantation i blæren med efterfølgende bakteriel colonization, som kan opretholdes i 7 dage efter infektion 41. Disse modeller har været nyttige for vurderingen af ​​bakteriel virulens mekanismer, host reaktioner på UTI og mekanismer at undergrave vært reaktioner, hvoraf meget er efterfølgende gengivet eller observeret i kliniske befolkningsgrupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik erklæring: The Washington University Animal Studies Udvalget godkendte alle mus infektioner og procedurer som led i protokol nummer 20120216, der blev godkendt 2013/01/11 og udløber 2016/01/11. Samlet pasning af dyrene var i overensstemmelse med den vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr fra National Research Council og USDA Animal Care Resource Guide. Eutanasi procedurer er i overensstemmelse med de "AVMA retningslinjer for aflivning af dyr 2013 udgave."

1. UPEC UTI-protokollen, Podning Needle Forberedelse (figur S1)

  1. Tag hætten af ​​30 G nål. Tråd ca. 1 tomme af PE10 rør på akslen af ​​nålen. UV sterilisere nålen forsamlinger natten over. Kateteriseres nåle kan opbevares på ubestemt tid i sterile petriskåle.

2. UPEC Bakteriel Inoculum Forberedelse

  1. Forbered UTI89 inokulum (start 72 timer forud for inoculaning dag)
    1. Streak UTI89 på en LB (Luria-Bertani) agarplade fra en frossen stamopløsning. Inkuber natten over ved 37 ° C. Pick en koloni og pode den i 10 ml LB i en 125 ml kolbe. Der inkuberes ved 37 ° C i 24 timer, statisk.
    2. Inokulere 10 pi overnatskultur i 10 ml LB i en ny 125 ml kolbe i yderligere 24 timer ved 37 ° C, statisk.
    3. Transfer 3 ml (vil variere baseret på belastning og ønsket inokulum størrelse) til sterile 1,5 ml rør og centrifugeres ved 7.000 xg i 3 min og pellet resuspenderes i 1x PBS og centrifuger en anden gang. Resuspender den bakterielle pellet i 1 ml 1x PBS.
  2. Måle bakteriel optisk densitet og justere koncentrationen til det ønskede inokulum densitet. Standard koncentration af inokulum anvendte 10 7 bakterier; Dette kan dog variere på grund af udformningen af ​​undersøgelsen.

3. Bakteriel Inokulation

  1. Rengør arbejdsstation med 70% ethanol og cløbet område med absorberende papir (eller bruge sterile flow hætte).
  2. Trække op til 0,9 ml af den fremstillede bakterielle inokulum i en 1 ml (TB) injektionssprøjte (fjerne luftbobler). Vedhæft en forberedt steril podning nål med PE10 rør, på sprøjten med inokulum, så sterilt trimme polyethylen slange.
    BEMÆRK: Lad 1 mm slange over spidsen af ​​nålen for at undgå punktering blæren.
  3. Skær en 1 inch firkantet stykke parafilm og sætte en DAB af kirurgisk smøremiddel (ca. på størrelse med en dime) på toppen.
  4. Bedøver kvindelige C3H / HeN mus ved at sætte dem i en 32 ounce glaskrukke indeholder en te-infusionsenheden bolden med vatkugler gennemvædet med 3 ml isofluran eller vaporizer kammer (efter fremstiller protokol), indtil bevidstløs, men stadig trækker vejret normalt (1 åndedrag / sek) .
    BEMÆRK: Nogle IACUC udvalg ikke godkende anvendelsen af ​​en krukke eller vaporizer. Følg angivelse af IACUC udvalg din institution.
    BEMÆRK: Hvis glaskrukkemed te-ball og / eller næse kegle med isofluran-soakd bomuld bolde anvendes, skal dyret observeres nøje for at undgå bedøvende overdosis og død. Fordelen ved at bruge en vaporizer og anæstesi kammer er, at den tilvejebringer kontrolleret isofluran administration, der undgår utilsigtede overdoser. ADVARSEL: Isofluran er en indånding bedøvelsesmiddel. Anvendelse i et godt ventileret område og minimere indånding.
  5. Fjern musen fra krukken / fordamper og placere den på ryggen på et stykke køkkenrulle og sprede benene.
  6. Dæk næsen af ​​mus med en næse kegle (et rør forbundet til forstøveren, der tilvejebringer en kontrolleret isoflurance dosis, der er udstyret på nogle vaporizer enheder) eller 50 ml konisk rør med et stykke vat indeholdende en lille mængde (ca. 1-2 ml ) af isofluran.
  7. Palpitate forsigtigt blæren til at inducere vandladning og sikre en annullerede blære. Tør periuretrale område med 100% ethanol tørre. Dup podning kanyle / sprøjte, punkt først, ind i denkirurgisk smøremiddel.
  8. Inokulere hver mus med 50 pi af bakterier opløsning ved at indsætte nålen podning transurethralt, ca. 12 mm, og trykke ned på sprøjtestemplet forsigtigt at dispensere inokulum i blæren forsigtigt (10 pl / sek). Fjern podning nålen fra mus.
    BEMÆRK: Umiddelbar tilbagevenden inokulum på urethrae åbning, når begynder at pode angiver forkert eller ufuldstændig indføring af nålen.
  9. Fjern musen fra næse kegle og returnere det til sit bur. Gentag trin 3,3-3,8 for hver mus. Når / hvis du skifter inokulumniveauer betingelser / stammer, bortskaffe sprøjten og podning nål i en godkendt beholder til skarpe genstande og start igen trin 3.2.
    BEMÆRK: Podning med uropatogene organismer generelt ikke forårsage alvorlige smerter symptomer. Men i sjældne tilfælde, administrere store doser af patogener kan forårsage feber, reduktion i mad og vand indtag og unormal adfærd. EnNimal sundhed bør overvåges under hele forsøget. Hvis åbenlyse smerter symptomer er meddelelse, et analgetikum, såsom buprenorphin (0,05-0,1 mg / kg indgivet subkutant), kan anvendes. Procedurer bør være i overensstemmelse med den enkelte institutions IACUC.

4. Bestemmelse af Bakterielle byrder

  1. Forbered separate 5 ml rør for hver blære og nyrer par til at blive høstet. Tilføj 1 ml 1x PBS / rør / mus blære at blive høstet. Tilføj 0,8 ml 1x PBS / rør / par mus nyrerne til at blive høstet. Label hvert rør for at svare til en bestemt mus. Forberede en plade med 96 brønde indeholdende 180 pi 1x PBS i hver brønd til 01:10 serielle fortyndinger.
  2. Rens arbejdsområde med 70% ethanol og dække området med et absorberende dæksel eller køkkenrulle.
  3. Bedøver musen med isofluran (se trin 3.4), indtil musen stopper vejrtrækning i ca. 1 min, derefter placere den på det absorberende dæksel eller køkkenrulle. Andre metoder til euthanasia er også accepteret af IACUC udvalg, såsom kuldioxid, og kan erstatte isofluran overdosis.
  4. Sacrifice musen ved hurtig cervikal dislokation, der består af fastholdende halsen ved basis af hovedet og trække halen vandret væk fra kroppen, indtil dislokation opstår.
    BEMÆRK: De fleste IACUC udvalg kræver et ekstra system til eutanasi og cervikal dislokation er en fælles metode. Imidlertid kan der anvendes andre metoder, hvis godkendt af IACUC udvalget.
  5. Placer døde mus på ryggen og spray 70% ethanol på maven. Dissekere mus, høste blære og nyrer i nævnte rækkefølge for at minimere potentiel forurening fra blodet efter nyrerne dissektion. Placer organer uafhængigt i den forberedte 5 ml rør indeholdende 1x PBS (se trin 4.1).
    BEMÆRK: Brug forskellige saks for den eksterne dissektion og for orgel høst for at minimere forureningen.
  6. Trykke røret for at sikre organerne er i than 1x PBS. Gentag trin 4,3-4,5 for hver mus. En ren saks og pincet i 70% ethanol efter hver mus.

5. Bakteriel Recovery

  1. Homogenisere harvested blære og nyrer i de 5 ml rør med en vævshomogenisator, 15 sek pr nyre og 30 sek pr blæren. Skyl homogenisator sekventielt i 1x PBS, 70% ethanol og 1 x PBS mellem prøverne.
  2. Gør serielle 1:10 fortyndinger ud til 10 -8 og plade hver fortynding for CFU (kolonidannende enheder) på LB-agarplader. Pladerne inkuberes ved 37 ° C natten over og tælle kolonier næste dag.

6. IBC Enumeration

  1. Aseptisk fjerne blæren og placere den i 1x PBS i en 6-brønds plade med en silikone bund. Plader kan fremstilles ved anvendelse af en silikoneelastomer kit og hælde ca. 1 cm af silicone i hver brønd, se producentens instruktioner. Skær blæren i halve med en saks.
  2. Ved hjælp af små metal ben forsigtigt splay det bladder så blæren lumen vender opad. Vær sikker på at placere benene på den yderste kanter af blære sektioner for at sikre den maksimale mængde urothelium er udsat for.
  3. Efter splaying, forsigtigt vaske blæren gang med 1x PBS. Fjern 1x PBS med pipette. Fastgør blæren ved at tilføje nok 3% paraformaldehyd at dække hele spredte blæren. ADVARSEL: Paraformaldehyd er kræftfremkaldende. Korrekt værnemidler, herunder handsker, bør der på alle tidspunkter. Bortskaffelse bør følge institutionelle retningslinier.
  4. Der inkuberes ved stuetemperatur i 1 time. Fjern paraformaldehydopløsning. Der vaskes én gang med 1x PBS.
  5. Vask med LacZ vaskeopløsning (2 mM MgCl2, 0,01% natriumdeoxycholat og 0,02% nonidet-p40in 1x PBS) tre gange i 5 minutter per vask.
  6. Fjern vaskeopløsningen og tilsæt nok LacZ farvning (9,5 ml LacZ vaskeopløsning, 0,4 ml 25 mg / ml X-gal og 0,1 ml 100 mM K-ferrocyanid / K-ferricyanid) til dækning blærerne. Der inkuberes ved 30 ° C overniGHT beskyttet mod lys.
  7. Fjern spredte blærer fra inkubatoren og observere IBC'er, der vises som blå puncta som visualiseret med en dissekering omfang, 40-60X forstørrelse.
    BEMÆRK: Nogle gange en mus kan urinere før placeringen af ​​røret under urinrøret. I dette tilfælde vente 15-20 minutter før forsøg på at indsamle urin igen.

7. urinopsamling for bakteriuri CFU Optælling (Gælder ikke for CAUTI)

  1. At indsamle urin pre eller efter infektion forsigtigt begrænse musen ved at holde halen og placere den på en flad forhøjet overflade (toppen af ​​mus bur).
  2. Hold en steril 1,5 ml rør under musen urinrøret. Tryk forsigtigt ned på bagsiden af ​​musen nær halen at påføre tryk på blæren. Fange urinen i 1,5 ml rør.
  3. Foretag serielle 1:10 fortyndinger ud til 10 -7 og plade hver fortynding på passende LB. Pladerne inkuberes ved 37 ° C natten over og tælle kolonier næste dag.

8. CAUTI Model Protocol, Kateter Needle Forberedelse til CAUTI Model (figur S2)

  1. Tag hætten af ​​30 G nål. Skær en 7 mm stykke PE10 slange og 5 mm stykke silikoneslanger såsom RenaSIL. Tråd nålen med PE10 rør, indtil slangen rører bunden af ​​nålen.
  2. Så fodre 5 mm brik på PE10-holdige nål. UV sterilisere nåle forsamlinger natten over.
    BEMÆRK: Når silikoneslanger Opdaterer, forlader ca. 1 mm af slangen strækker forbi nålespidsen.

9. E. faecalis OG1RF Bakteriel Inoculum Forberedelse

  1. Forbered OG1RF inokulum startende 48 timer før inokuleringen dag. Streak OG1RF på en BHI (hjerne hjerte infusion) plade fra en frossen lager.
  2. Pick en koloni og pode den i 10 ml BHI og dyrke det statisk i 18 timer ved 37 ° C. Centrifugeres kulturen og vask pellet (3 gange) i 1 ml volumener sterilt 1x PBS.
  3. Resuspender den bakterielle pellet i 1 x PBS. Mål bakteriel optisk tæthed og justere koncentrationen til den ønskede inokulum størrelse. Standard koncentration af inoculum er 10 7; Dette kan dog variere på grund af udformningen af ​​undersøgelsen

10. Kateter Implantation

  1. Rengør arbejdsstation med 70% ethanol og dække området med en absorberende låg (eller brug steril flow hætte).
  2. Vedhæfte kateter-nål til en tom 1 ml (TB) sprøjte. Skær en 1 inch firkantet stykke parafilm og sætte en DAB af kirurgisk smøremiddel (ca. på størrelse med en dime) på toppen.
    BEMÆRK: To forskellige nåle anvendes til aflejring af kateteret og for inokulum til minimeret utilsigtet inokulation på grund af den mekaniske manipulation er nødvendig for kateter implantation. Dette giver også mulighed for bekvemmelighed forberede færre podning nåle.
  3. Bedøver C57BL / 6 mus ved at sætte dem i en 32 ounce glaskrukke indeholder en te-infuser bolden med vatkugler dyppet i 3 ml isofluran eller vaporizer kammer (efter fremstiller protokol), indtil bevidstløs, men stadig trækker vejret normalt (1 åndedrag / sek).
  4. Derefter sætte musen på ryggen på et stykke køkkenrulle og sprede benene. Dæk næse af musen med en næse kegle eller 50 ml konisk rør med vatkugler indeholder en lille mængde (ca. 1-2 ml) af isofluran.
    ADVARSEL: Isofluran er en indånding bedøvelsesmiddel. Anvendelse i et godt ventileret område og minimere indånding af forsker.
  5. Palpitate forsigtigt blæren til at inducere vandladning og sikre en annullerede blære. Tør periurethral område med en 100% ethanol tørre.
  6. Desinficere periuretrale område med 10% povidon-jodopløsning ved hjælp af en bomuld-tip applikator. Dup inokulation nålen / sprøjten, punkt først, i det kirurgiske smøremiddel.
    BEMÆRK: povidin-jod anvendes til kateteret implantation, hvilket er en stærkere aseptisk opløsning end alkohol. Kateter implantation krævermere mekanisk manipulation at indsætte kateteret og dermed et større potentiale for forurening.
  7. Indsætte kateteret i urinrørets åbning. Når i, at betjene pincet skubbe (7 mm PE10) langt stykke hen mod blæren dermed skubbe (5 mm silikone) lille kateter og deponere den ind i blæren. Fjern nålen, med 7 mm slange stadig er fastgjort, med det samme.

11. Bakteriel Podning

  1. Følg den bakterielle podning protokollen i afsnit 3, ved hjælp af den forberedte inokulum fra § 9. Fjern musen fra næsekeglen og returnere det til sit bur

12. På hvert tidspunkt af Sacrifice

  1. Forbered 5 ml rør til blære og nyre (For organer følge trin 4.1) og 1,5 ml Eppendorf rør til katetre. Der tilsættes 1 ml 1x PBS i 1,5 ml Eppendorf-rør til kateter prøver
  2. Følg trin 4,3-4,5. Dissekere mus og høste blære, nyrer og kateter, placing vævene uafhængigt i 5 ml rør indeholdende 1 x PBS og kateteret ind i 1,5 ml Eppendorf (se trin 12.1).
    BEMÆRK: Brug forskellige saks for den eksterne dissektion og for orgel høst og kateter hentning for at minimere forurening
  3. Følg derefter trin 4.6.

13. Bakteriel Recovery

  1. For organer, følge trin 5.1 og 5.2. For bakteriel restitution fra katetre, vortex ved maksimal hastighed i 30 sek, sonikeres kateteret prøver i 5 min under anvendelse af en badsonikator, og derefter vortex ved maksimal hastighed i yderligere 30 sek.
  2. Foretag serielle 1:10 fortyndinger ud til 10 -8 og plade hver fortynding for CFU tælling på BHI-plader. Pladerne inkuberes ved 37 * C natten over og tælle kolonier næste dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De intravesikale modeller for ukompliceret og kateter forbundet UTI giver fleksible platforme for at belyse de molekylære mekanismer i bakteriel patogenese, virkningen af ​​disse sygdomme på værtsvævet, samt udvikling og afprøvning af nye tilgange til at håndtere disse fælles og dyre infektioner. Afhængigt af musestamme og patogen, kan intravesikal podning anvendes til at studere vært-patogen vekselvirkninger at belyse faktorer, der er nødvendige for at iværksætte eller modulering akutte (figur 1 og 3), kronisk eller recidiverende (figur 2) blærebetændelse. De i figur 1 data er repræsentative for akutte fase (24 hpi) urinveje kolonisering med den prototypiske UPEC cystitis isolere UTI89 44. Efter inokulering infektioner lov at udvikle sig i 24 timer, på hvilket tidspunkt musene aflivet, og blæren og nyrevæv homogeniseret. De vævshomogenisater er serielt diluted og belagt til tælling af koloniserende bakterier. Kan etableres og vedligeholdes i nogle mus linjer (især C3H / høne) i en smitsom dosis og uropathogen afhængig måde Kronisk UPEC kolonisering og blære betændelse. Kronisk cystitis defineres som vedvarende høj titer bacteriuria (> 10 4 CFU / ml), blærebetændelse og høj titer bakterielle blære byrder (> 10 4 CFU / blære) ved aflivning 33. De i figur 2 data er repræsentative CFU'er forekommende 4 uger efter inokulation af C3H / HeN mus med 2 x 10 7 CFU'er af UTI89. Under disse forsøgsbetingelser, 20-50% af inficerede mus udvikler kronisk cystitis, mens de resterende 50-80% af musene løse infektionen. Denne dobbelthed af resultat er afhængig af et host-patogen checkpoint, der er fastsat under den første 24 hpi. Aktivering (eller ikke) af de checkpoint resultater i den observerede bimodal fordeling af bakterielle titre, som begynder at manifestere iurinen ved 3 dpi (dage efter infektion) og i blæren ved aflivning 28 dpi (figur 2) 33. Mus med en historie af kronisk blærebetændelse er signifikant disponeret for tilbagevendende kronisk blærebetændelse efter udfordring efter den indledende infektion er ryddet med antibiotikabehandling 33. Ligeledes en historie af UTI er en kendt risikofaktor for tilbagevendende UTI hos mennesker. Dette er således den eneste kendte model anvendt til at undersøge patogenesen af ​​tilbagevendende urinvejsinfektioner. Når eksperimentelt modellering UTI i alternative muse baggrunde, er det vigtigt at bestemme, om musestamme er modtagelige for UTI, tilbagevendende UTI eller CAUTI, da visse stammer er mere eller mindre modstandsdygtige over for udvikling af disse syndromer 33.

En yderligere måling af akut blærebetændelse er IBC tælling. IBC-dannelse er begrænset til de terminalt differentierede overfladiske paraply celler. IBC kvantificering er en informativ mål for bakteriel belastning under akut cysteitis og høje niveauer af IBC korrelerer med risikoen for at udvikle kronisk blærebetændelse 21. IBC-dannelse forekommer kun i de akutte faser af sygdommen. Efter eksfoliering af de overfladiske paraply celler, IBC ikke længere overholdes. I C3H / HeN UTI model, kan måles IBC 6 timer efter podning ~ 1 x 10 7 CFU af UTI89 ind i blæren transurethralt. Blærer spredte med metalstifter på silikone plader og farves til ekspression af LacZ. LacZ, β-galactosidase, er et almindeligt udtryk bakterielt enzym, som spalter β kobling mellem galactose og andet sukker. Dette enzym kan anvendes til at detektere bakterier ved tilførsel af X-gal, et β-galactosid-analog, som frembringer en blå farve efter spaltning. Efter farvning, er blærerne afbildes under et dissektionsmikroskop med IBC'er optræder som punctae blå / lilla prikker på urothelium og IBC kan opregnes ved at tælle prikkerne (figur 3A). Mens antallet af IBCs dannet pr dyr varierer i C3H / HeN baggrund gennemsnit ~ 50 IBC'er ses pr blære (figur 3B). IBC stigning på en dosisafhængig måde. Antallet af IBC'er, der danner varierer mellem UPEC og mus baggrund stammer. For eksempel i C57BL / 6, et inokulum på ~ 1 x 10 7 UTI89 resulterer i dannelsen af flere hundrede IBC'er pr blæren.

Ud over den ukomplicerede nosocomiel UTI modelleret ovenfor, hede pleje associeret urinvejsinfektioner udgør en væsentlig byrde for sundhedssystemet. Urinvejsinfektioner udgør ca. 40% af alle sundheds-infektioner forbundet og op til 95% af al sundhedspleje forbundet urinvejsinfektioner er kateter forbundet 45. Her demonstrerer vi en blære implantat musemodel for CAUTI der repræsenterer et kraftfuldt system til eksperimentel analyse af dette vanskelige klinisk problem. Data præsenteret i figur 4 er repræsentative for 24 timers infektioner med modellen E. faecalis s træne OG1RF. Når 1 x 10 7 CFU OG1RF er intravesikalt inokuleret i en unimplanted blære, infektionen begynder at klare med 24 hpi (figur 4A) og ved 3 dpi infektionen er overstået 41. Omvendt podning af OG1RF i en implanteret blære resulterer i kolonisering af både kateteret og blæren, med 10 gange højere blære kolonisering niveauer på 24 hpi end observeret i de unimplanted blærer (figur 4A og 4B). Derudover er denne infektion holdt ved> 10 6 CFU i blæren, indtil kateteret tab ca. 7 dpi 41. Alle de beskrevne eksperimentelle modeller er egnede til en høj grad af eksperimentel fleksibilitet, herunder, men ikke eksklusivt til forskellige tilgange til den makroskopiske og mikroskopiske billeddannelse af de inficerede væv og overflader, ændrede inokulumniveauer størrelser og sygdomstilstande gange, konkurrencedygtige infektioner og vært immunologiske analyser .

ve_content "> Figur 1
Figur 1:. 24 hr urinveje kolonisering Kvinde, 7-8 uger gamle C3H / HeN mus blev transurethralt inokuleret med ~ 2 x 10 7 CFU af den prototypiske UPEC cystitis isolere UTI89 i 24 timer. Repræsentative CFU'er udvundet fra de høstede blære og nyrevæv er vist, n = 5. Stiplet linje angiver den nedre detektionsgrænse (20 CFU).

Figur 2
Figur 2:. 28 dage urinveje kolonisering Kvinde, 7-8 uger gamle C3H / HeN mus blev transurethralt inokuleret med ~ 2 x 10 7 CFU UTI89. Urin var indsamle på angivne dage efter infektion (dpi) og belagt for CFU tælling. Repræsentant 28 dage blære og nyre titere vises også, n = 8. Urin CFU nedre detektionsgrænse (1.000 CFU / ml) er angivet ved den stiplede linie. Stiplet linje repræts vævet nedre detektionsgrænse, 20 CFU / væv.

Figur 3
Figur 3:. IBC tælling Kvinde, 7-8 uger gamle C3H / HeN mus blev transurethralt inokuleret med ~ 1 x 10 7 CFU UTI89. Blærer blev høstet 6 hpi og spredte til IBC farvning. (A) Billede af spredte blæren efter LacZ farvning. IBC er repræsenteret som blå prikker. Det indsatte billede er en digital forstørrelse af den del af billedet i den sorte boks. (B) Repræsentative antal IBC dannet i C3H / HeN mus 6 hpi, n = 10.

Figur 4
Figur 4: E. faecalis kateter-associeret UTI. C57BL / 6-mus blev inokuleret med eller uden katetere med ~ 1 x 10 7 CFU af (A) E. faecalis blære kolonisering i nærvær eller fravær af kateteret. (B) E. faecalis kateter kolonisering. Mann-Whitney U test blev anvendt til mus eksperimenter blev p <0,05 betragtet som statistisk signifikant. **, P <0,005.

Figur S1
Figur S1:. UTI podning nål forberedelse Diagram viser podning nål fremstillingstrin herunder nødvendige materialer (1), gevindskæring af kateteret på nålen (2) og trimning slangen før podning (3).

Figur S2
Figur S2:. CAUTI podning nål forberedelse Diagram viser podning nål forberedelse materialer, der er nødvendige (1), gevindskæring af podning kateter (2) og implantation kateter påtil nålen (3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ukompliceret erhvervet uden UTI er en almindelig og dyrt infektion tegner sig for flere millioner primær pleje besøg hvert år 46. Desuden Cautis er et fælles sundhedsvæsen erhvervet infektion, der er blevet ekstremt dyrt at leverandører af sundhedsydelser som Centers for Medicare og Medicaid Services ikke længere refunderer udbydere for den ekstra udgifter til behandling som følge af hospitalet erhvervet CAUTI 45. De musemodeller for UTI, både ukompliceret blærebetændelse og CAUTI, der er beskrevet i disse protokoller giver uvurderlige værktøjer til at forstå det molekylære grundlag for værten og patogen interaktioner, der er nødvendige for at indlede, vedligeholde, og modulerende resultatet af flere former for UTI. Disse modeller giver mulighed for at anvende kraftige bakterie- og mus genetik, immunologiske, mikroskopiske, biokemiske og kemiske genetiske værktøjer til analyse af UTI 23,47-49. Derudover protokoller skitseret her har givet en platformfor udvikling og afprøvning af nye terapeutiske og forebyggende strategier, herunder småmolekyleinhibitorer af bakteriel virulens og nye vaccination mål og strategier 50-55.

Der er flere kritiske forhold, som skal vedligeholdes for en vellykket gennemførelse af den ukomplicerede blærebetændelse model. Som med alle mus bedøvelse procedurer, skal der drages omsorg for at forebygge dødelighed musen på grund af over-bedøvelse. Ved udarbejdelsen af ​​podning kateteret, skal siliconeslangerne være tilstrækkelig lang til at dække spidsen af ​​nålen, men ikke så lang, at skade væggen af ​​blæren på kateterisation. Derudover, på grund af nærheden og størrelsen af ​​den vaginale åbning, skal der drages omsorg for at indsætte inokulerende kateter i urinrøret og ikke vagina. Under blære splaying for IBC tælling, er det vigtigt, at de blærer der spredte så hurtigt som muligt efter dissektion og vævet fastsættes for hensigtsximately 1 time, men ikke natten over. For IBC tælling af LacZ-farvning, er det også nødvendigt, at bakterien pågældende producere LacZ under urotelial celle kolonisering. Når du bruger stammer hvor LacZ enzymet ikke er produceret, er det stadig muligt at opregne IBC hjælp immunfluorescensmikroskopi med anti E. coli antistoffer eller GFP udtrykkende bakterier. Et særligt træk ved denne model er de forskellige mønstre af sygdomsprogression og sværhedsgraden præsenteret af forskellige indavlede mus linjer og den varierende patogene potentiale prototypisk UPEC stammer 33,56. Disse forskelle er både en styrke og begrænsning af denne teknik, da de rekapitulere den naturlige variation af vært modtagelighed og patogen mangfoldighed, som er blevet observeret i kliniske og fænotypiske studier, mens komplicerende eksperimentelle design og fortolkning 57,58. Disse variationer giver kilder til sammenligning giver mulighed for belysning af værten og bakteriel mechanismer modulere patogenesen af ukompliceret UTI 33,56. Men de betyder også, at på grund af den varierende grad af mus linje UTI modtagelighed, skal yderste omhu i at vælge den rigtige mus linje og UPEC stamme til tage fat på særlige spørgsmål en undersøger spørger. F.eks C57BL / 6-mus er en glimrende model af akut infektion, præsenterer sig med høje bakterielle titere og et stort antal IBC på tidlige tidspunkter. Denne stamme derefter hurtigt løser infektionen mellem 3 og 7 dpi med den eneste vedvarende kolonisering følge af kraftige nyre infektioner og hvilende intracellulære reservoirer 33,34. Den C57BL / 6-modellen kan præcist repræsentere den mest almindelige resultat for mange UTI patienter, hvor symptomerne er til stede, og derefter løse. Omvendt C3H / HeN mus baggrund udviser en høj grad af følsomhed over for kronisk cystitis gør dem til et ideelt stamme til undersøgelse tilbagevendende urinvejsinfektioner. Der er også blevet etableret andre UTI modelleri CBA, DBA og C3H / HeJ mus baggrund bevise nyttigt til at studere særlige aspekter af UTI 33,59. Den primære eksperimentelle ulempe udvist af den ukomplicerede blærebetændelse model er eksistensen af flere infektion flaskehalse begrænser anvendelsen af store skala genetisk screening metoder til opdagelsen af nye bakterielle faktorer, der er nødvendige for akut, kronisk og tilbagevendende blærebetændelse 60.

De kritiske overvejelser for ukompliceret cystitis-modellen alle gælder implantatet baseret CAUTI model med to yderligere bekymringer. Først skal der drages omsorg for at sikre, at indsættelsen af ​​implantatet finder sted i en steril måde, på grund af den øgede modtagelighed for blære infektion følger af implantatet. For det andet er det vigtigt, at der afholdes kateteret på plads under fjernelse af implanterende nål. De vigtigste begrænsninger af CAUTI model er, at det har en reduceret række tilgængelige vært genetiske baggrunde, PRopensity for kateter tab over tid og den manglende evne til at indsamle urin på grund af blære dysfunktion som følge af implantation. For at kompensere for implantat tab og den manglende evne til at overvåge infektion via langsgående urinanalyse, denne model kræver generelt højere antal kateter mus til senere tidspunkter og grupper af mus skal aflives hvert ønsket tidspunkt. De begrænsede vært genetiske baggrunde resultater fra uoverkommelige frekvens, hvor nogle musestammer, såsom C3H / høne, mister implantatet (P. Guiton, Personlig Kommunikation 2010). Som følge heraf har de CAUTI protokollerne beskrevet ovenfor udelukkende blevet optimeret i C57BL / 6 mus stamme. Men mens begrænsningen af ​​tilgængelige musestammer for CAUTI er uheldigt, mange genomiske variationer er blevet etableret i C57BL / 6 baggrund og CAUTI model udvider bakteriologiske mangfoldighed tilgængelig for undersøgelse under UTI ved at ændre blæren miljø at lette kolonisering af organismer, erellers ikke-patogen i den murine model af UTI. Et eksempel på dette, er den nylige opdagelse af den rolle, Fg frigivet under kateter induceret betændelse i blæren i E. faecalis vækst, biofilm dannelse, og vedholdenhed under CAUTI 42. Dette eksempel illustrerer strømmen af ​​implantatet model af CAUTI til belysning ikke blot bakteriel molekylære mekanismer i patogenese, men også den rolle, værtfaktorer under infektionen. Alle disse træk bidrager til at forstå denne relevante klinisk infektion, som tidligere er blevet dublerede.

Ud over de eksperimentelle metoder, der er beskrevet ovenfor, musemodeller for ukompliceret cystitis og CAUTI kan underkastes en lang række metodologiske ændringer. I tilfælde af den ukompliceret cystitis-modellen, kan disse modifikationer indbefatter reduktion af podning volumen og kraften påført under instillation af inoculum at reducere antallet af bakterierindføres i nyrerne 61, at variere varigheden af infektionen, ofrer på tidspunkter så tidligt som 1 hpi og ved anvendelse af gentamicin beskyttelse assays for at vurdere den grad, i hvilken uropathogen har invaderet blæren epitelceller 62. De spredte blærer fra mus aflivet mellem 6 og 24 hpi kan også sektioneret og farvet med antistoffer mod forskellige vært og / eller bakterielle epitoper og observeret under fluorescerende eller konfokal mikroskopi til at observere IBC struktur, bakteriel flusmiddel og filamentering og værtsvæv betingelse 25,33 , 63,64. Virkningen af uropathogen infektion og / eller implantation på de lokale og systemiske immunreaktioner hos værten kan vurderes ved hjælp af den Bioplex cytometrisk bead system eller ELISA baserede assays til bestemmelse cytokinniveauer i urin eller serum henholdsvis 33,65. Endelig er betingelsen af ​​blæren væv, placering og morfologi af koloniserende bakterier og strukturen af ​​biofilmen aflejret påkateteret kan vurderes ved forskellige billeddannelsesteknikker, herunder elektronmikroskopi 25,41.

Disse grundlæggende modeller af infektion kan også tilpasses til at efterligne andre klinisk relevante fænomener herunder tilbagevendende UTI og udviklingen af ​​en respons via flere infektioner adaptive immunrespons. I denne sammenhæng gentagen infektion af C57BL / 6-mus resulterer i forøget resistens over for akut blærebetændelse, mens i C3H / HeN model, den forudgående udvikling af kronisk cystitis, efterfulgt af clearance af infektionen via administration af antibiotika sensibiliserer disse mus til at udvikle kronisk blærebetændelse tilbagevendende podninger 66. Derudover kan undersøges de molekylære mekanismer i risikofaktorer for udvikling af UTI. Diabetes og fedme har begge vist sig at øge hyppigheden og sværhedsgraden af ​​urinvejsinfektioner. Type 2-diabetes kan være genetisk modelleres i mus i FVB / NJ baggrund og en kemisk induceret model af type 1 diabetes har forudeksisterendey blevet vist at forøge sværhedsgraden af urinvejsinfektioner forårsaget af både UPEC og K. pneumophila 67,68.

Endelig udgør disse modelsystemer en ideel bevise grundlag for udvikling og optimering af terapeutiske modaliteter sigte på behandling eller forebyggelse af urinvejsinfektioner og Cautis. Den molekylære forståelse af værten patogen interaktioner, som disse modeller har allerede lettet udviklingen af effektive vaccinationsstrategier tager sigte på at målrette vigtige virulensfaktorer 51-55. Derudover har småmolekyleinhibitorer af UPEC adhæsion vist sig at være effektiv i behandlingen af ukompliceret akut og kronisk UTI samt Cautis forårsaget af UPEC 12,69,70. Både ukomplicerede UTI og CAUTI modeller, der er beskrevet i disse protokoller giver de eksperimentelle redskaber til at dissekere de molekylære detaljer værten-patogen interaktioner i urinvejene. Disse værktøjer kan udnyttes på mange måder til at udvide vores understanding af dette komplekse sæt betingelser og lette udviklingen af ​​mere effektive terapeutiske indgreb.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Midler til dette arbejde blev leveret af ORWH SCOR P50 DK064540, RO1 DK 051406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101171, og F32 DK 104516-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles BD Precision Glide 305106 30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing BD 427400 Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing Braintree Scientific, Inc SIL 025 inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia Butler Schein 29405 250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar Kimble Chase 5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser Schefs-Amazon Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls Fisherbrand 22-456-880
50 ml Falcon tubes VWR 89039-660
Isotec 3 -vaporizer Ohmeda 1224478
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201 (when necessary)
Betadine solution Betadine solution 10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips Fisher Scientific 22-037-924 6 inches
Diapers for bench Fisherbrand 14206 63 Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant Surgilube 0281-0205-36
Dissecting scissor Fine Science tools, INC 14084-08
Micro-Adson Forceps Fine Science tools, INC 11018-12
1 ml syringe BD 309659 Tuberculin slip tip
Parafilm Bemis PM996 4 inches x 125 FT
Eppendorf rack Fisherbrand 05-541-1
Eppendorf tubes MIDSCI AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer PRO Scientific INC Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube BD 352063 for organ homogenization
Paper towel Georgia-Pacific
Ethanol Pharmco-AAPER 11100020S 200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates Corning 3788
1x Phosphate sodium saline Sigma-Aldrich P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210 Branson Ultrasonics Corporation 1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate Techno Plastic Products 92006
Pins Fine Science Tools 26002-20
Sylgard 184 Dow Corning 3097358-1004 Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) Invitrogen 15520-034 Ultrapure
N, N-Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
MgCl2 (Magnesium chloride) Sigma Aldrich M8266
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750
Nonidet-P40 Roche 11754599001 Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide) Sigma Aldrich P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide) Sigma Aldrich 60299

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Dis Mon. 49, 53-70 (2003).
  2. Foxman, B., et al. Risk factors for second urinary tract infection among college women. American journal of epidemiology. 151, 1194-1205 (2000).
  3. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Increasing antimicrobial resistance and the management of uncomplicated community-acquired urinary tract infections. Annals of internal medicine. 135, 41-50 (2001).
  4. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Isolation of fluoroquinolone-resistant rectal Escherichia coli. after treatment of acute uncomplicated cystitis. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 56, 243-246 (2005).
  5. Gupta, K., Sahm, D. F., Mayfield, D., Stamm, W. E. Antimicrobial resistance among uropathogens that cause community-acquired urinary tract infections in women: a nationwide analysis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 89-94 (2001).
  6. Gupta, K., Scholes, D., Stamm, W. E. Increasing prevalence of antimicrobial resistance among uropathogens causing acute uncomplicated cystitis in women. Jama. 281, 736-738 (1999).
  7. Jarvis, W. R. Selected aspects of the socioeconomic impact of nosocomial infections: morbidity, mortality, cost, and prevention. Infect Control Hosp Epidemiol. 17, 552-557 (1996).
  8. Lo, E., et al. Strategies to prevent catheter-associated urinary tract infections in acute care hospitals: 2014 update. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America. 35, 464-479 (2014).
  9. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature reviews Urology. 7, 653-660 (2010).
  10. Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11, 551-581 (1997).
  11. Hannan, T. J., et al. LeuX tRNA-dependent and -independent mechanisms of Escherichia coli. pathogenesis in acute cystitis. Molecular microbiology. 67, 116-128 (2008).
  12. Cusumano, C. K., Hung, C. S., Chen, S. L., Hultgren, S. J. Virulence plasmid harbored by uropathogenic Escherichia coli. functions in acute stages of pathogenesis. Infection and immunity. 78, 1457-1467 (2010).
  13. Dhakal, B. K., Mulvey, M. A. The UPEC pore-forming toxin alpha-hemolysin triggers proteolysis of host proteins to disrupt cell adhesion, inflammatory, and survival pathways. Cell host & microbe. 11, 58-69 (2012).
  14. Garcia, E. C., Brumbaugh, A. R., Mobley, H. L. Redundancy and specificity of Escherichia coli. iron acquisition systems during urinary tract infection. Infection and immunity. 79, 1225-1235 (2011).
  15. Bergsten, G., Wullt, B., Svanborg, C. Escherichia coli., fimbriae, bacterial persistence and host response induction in the human urinary tract. International journal of medical microbiology : IJMM. 295, 487-502 (2005).
  16. Zhou, G., et al. Uroplakin Ia is the urothelial receptor for uropathogenic Escherichia coli.: evidence from in vitro FimH binding. J Cell Sci. 114, 4095-4103 (2001).
  17. Eto, D. S., Jones, T. A., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Integrin-mediated host cell invasion by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 3, e100 (2007).
  18. Taganna, J., de Boer, A. R., Wuhrer, M., Bouckaert, J. Glycosylation changes as important factors for the susceptibility to urinary tract infection. Biochemical Society transactions. 39, 349-354 (2011).
  19. Mulvey, M. A., et al. Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science. 282, 1494-1497 (1998).
  20. Mysorekar, I. U., Mulvey, M. A., Hultgren, S. J., Gordon, J. I. Molecular regulation of urothelial renewal and host defenses during infection with uropathogenic Escherichia coli. The Journal of biological chemistry. 277, 7412-7419 (2002).
  21. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  22. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli. from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and immunity. 75, 52-60 (2007).
  23. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 1333-1338 (2004).
  24. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae. urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and immunity. 76, 3337-3345 (2008).
  25. Anderson, G. G., et al. Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections. Science. 301, 105-107 (2003).
  26. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli. recurrent urinary tract infections. Pathogens and disease. 68, 78-81 (2013).
  27. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4, e329 (2007).
  28. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PloS one. 8, e83637 (2013).
  29. Hopkins, W. J., Uehling, D. T., Wargowski, D. S. Evaluation of a familial predisposition to recurrent urinary tract infections in women. American Journal of Medical Genetics. 83, 422-424 (1999).
  30. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli. urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and immunity. 66, 2798-2802 (1998).
  31. Mabeck, C. E. Treatment of uncomplicated urinary tract infection in non-pregnant women. Postgraduate medical journal. 48, 69-75 (1972).
  32. Ferry, S., Holm, S., Stenlund, H., Lundholm, R., Monsen, T. The natural course of uncomplicated lower urinary tract infection in women illustrated by a randomized placebo controlled study. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 36, 296-301 (2004).
  33. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli. predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathog. 6, (2010).
  34. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. persistence and eradication from the urinary tract. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 14170-14175 (2006).
  35. Glahn, B. E., Braendstrup, O., Olesen, H. P. Influence of drainage conditions on mucosal bladder damage by indwelling catheters. II. Histological study. Scandinavian journal of urology and nephrology. 22, 93-99 (1988).
  36. Goble, N. M., Clarke, T., Hammonds, J. C. Histological changes in the urinary bladder secondary to urethral catheterisation. British journal of urology. 63, 354-357 (1989).
  37. Ronald, A. The etiology of urinary tract infection: traditional and emerging pathogens. Dis Mon. 49, 71-82 (2003).
  38. Arias, C. A., Murray, B. E. The rise of the Enterococcus.: beyond vancomycin resistance. Nature reviews. Microbiology. 10, 266-278 (2012).
  39. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. The New England journal of medicine. 291, 215-219 (1974).
  40. Warren, J. W. Catheter-associated urinary tract infections. Infect Dis Clin North Am. 11, 609-622 (1997).
  41. Guiton, P. S., Hung, C. S., Hancock, L., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcal biofilm formation and virulence in an optimized murine model of foreign body-associated urinary tract infections. Infection and immunity. 78, 4166-4175 (2010).
  42. Flores-Mireles, A. L., Pinkner, J. S., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. EbpA vaccine antibodies block binding of Enterococcus faecalis. to fibrinogen to prevent catheter-associated bladder infection in mice. Science translational medicine. 6, 254ra127 (2014).
  43. Martinez, J. J., Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Pinkner, J. S., Hultgren, S. J. Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells. The EMBO Journal. 19, 2803-2812 (2000).
  44. Hultgren, S. J., Schwan, W. R., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Regulation of production of type 1 pili among urinary tract isolates of Escherichia coli. Infection and immunity. 54, 613-620 (1986).
  45. Chenoweth, C. E., Gould, C. V., Saint, S. Diagnosis, Management, and Prevention of Catheter-Associated Urinary Tract Infections. Infect. Dis. Clin. North Am. 28, 105-+ (2014).
  46. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7, 653-660 (2002).
  47. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (1988).
  48. Song, J., et al. TLR4-mediated expulsion of bacteria from infected bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14966-14971 (2009).
  49. Wang, H., Min, G., Glockshuber, R., Sun, T., Kong, X. P. Uropathogenic E. coli. adhesin-induced host cell receptor conformational changes: implications in transmembrane signaling transduction. Journal of molecular biology. 392, 352-361 (2009).
  50. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science translational medicine. 3, 109-115 (2011).
  51. Langermann, S., Ballou, W. R. Vaccination utilizing the FimCH complex as a strategy to prevent Escherichia coli. urinary tract infections. J Infect Dis. 183, S84-S86 (2001).
  52. Langermann, S., et al. Vaccination with FimH adhesin protects cynomolgus monkeys from colonization and infection by uropathogenic Escherichia coli. J Infect Dis. 181, 774-778 (2000).
  53. Langermann, S., et al. Prevention of mucosal Escherichia coli. infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination. Science. 276, 607-611 (1997).
  54. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. Plos Pathogens. 5, (2009).
  55. Russo, T. A., et al. The siderophore receptor IroN of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. is a potential vaccine candidate. Infect. Immun. 71, 7164-7169 (2003).
  56. Schwartz, D. J., et al. Positively selected FimH residues enhance virulence during urinary tract infection by altering FimH conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15530-15537 (2013).
  57. Czaja, C. A., et al. Prospective cohort study of microbial and inflammatory events immediately preceding Escherichia coli. recurrent urinary tract infection in women. J Infect Dis. 200, 528-536 (2009).
  58. Chen, S. L., et al. Genomic Diversity and Fitness of E. coli. Strains Recovered from the Intestinal and Urinary Tracts of Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Science Translational Medicine. 5, 2013 (2013).
  59. Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli. through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 166, 1148-1155 (2001).
  60. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  61. Chan, C. Y., St John,, L, A., Abraham, S. N. Mast Cell Interleukin-10 Drives Localized Tolerance in Chronic Bladder Infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  62. Justice, S. S., Lauer, S. R., Hultgren, S. J., Hunstad, D. A. Maturation of intracellular Escherichia coli. communities requires SurA. Infect. Immun. 74, 4793-4800 (2006).
  63. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19884-19889 (2006).
  64. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1333-1338 (2004).
  65. Guiton, P. S., Hannan, T. J., Ford, B., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcus faecalis. Overcomes Foreign Body-Mediated Inflammation To Establish Urinary Tract Infections. Infect. Immun. 81, 329-339 (2013).
  66. Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. Journal of Immunology. 176, 3080-3086 (2006).
  67. Rosen, D. A., Hung, C. -S., Kline, K. A., Hultgren, S. J. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect. Immun. 76, 4290-4298 (2008).
  68. Daneshgari, F., Leiter, E. H., Liu, G., Reeder, J. Animal Models of Diabetic Uropathy. Journal of Urology. 182, S8-S13 (2009).
  69. Guiton, P. S., et al. Combinatorial Small-Molecule Therapy Prevents Uropathogenic Escherichia coli. Catheter-Associated Urinary Tract Infections in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56, 4738-4745 (2012).
  70. Totsika, M., et al. A FimH Inhibitor Prevents Acute Bladder Infection and Treats Chronic Cystitis Caused by Multidrug-Resistant Uropathogenic Escherichia coli. ST131. Journal of Infectious Diseases. 208, 921-928 (2013).

Tags

Medicin , UPEC, Uropatogen kateter urinvejsinfektion IBC kronisk cystitis

Erratum

Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 08/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.
Etablering og karakterisering af UTI og CAUTI i en musemodel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conover, M. S., Flores-Mireles, A.… More

Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (100), e52892, doi:10.3791/52892 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter