Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ההקמה ואפיון של UTI וCAUTI במודל עכבר

Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52892
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Abstract

זיהומים בדרכי שתן (UTI) הם נפוצים ביותר, גורם משמעותי לתחלואה והם עמידים יותר ויותר לטיפול באנטיביוטיקה. נקבות נגועות באופן לא פרופורציונאלי על ידי דלקת בדרכי שתן: 50% מכלל הנשים יהיו UTI בחייהם. בנוסף, 20-40% מהנשים האלה שיש להם דלקת בדרכי שתן ראשוני יסבלו הישנות עם כמה הישנויות תכופות הסובלות מהידרדרות חמורה באיכות חיים, כאב ואי נוחות, שיבוש של פעילויות יומיומיות, גדלו עלויות בריאות, וכמה אפשרויות טיפול אחרים מטיפול מונע באנטיביוטיקה לטווח ארוך. coli Uropathogenic Escherichia (UPEC) הוא הסוכן סיבתי העיקרי של קהילה רכש UTI. הדלקת בדרכי השתן הקשורים צנתר (CAUTI) הוא הזיהום השכיח ביותר בבית החולים רכשו היווה מיליון התרחשויות בארה"ב מדי שנה, ועלויות בריאות דרמטיות. בעוד UPEC הוא גם הגורם העיקרי לCAUTI, סוכני סיבה אחרים הם בעלי חשיבות מוגברת כוללים אנטרוקוקוסfaecalis. כאן אנו מנצלים שני מודלים עכבר מבוססים היטב כי לשחזר רב של המאפיינים הקליניים של מחלות בבני אדם אלה. לדלקת בדרכי שתן, מודל C3H / חן משחזר רב מהתכונות של אלימות UPEC נצפו בבני אדם ובכלל זה תגובות מארחות, היווצרות מבני תעשייה וfilamentation. לCAUTI, מודל באמצעות C57BL / 6 עכברים, אשר שומרים על שתלי שלפוחית ​​השתן קטטר, הוכח להיות רגיש לE. faecalis דלקת בשלפוחית ​​השתן. מודלים נציג אלה נמצאים בשימוש כדי להשיג תובנות חדשות בולטות לפתוגנזה של מחלה בדרכי שתן, שמובילה לפיתוח תרופות חדשניות ואסטרטגיות ניהול או מניעה.

Introduction

זיהומים בדרכי שתן (זיהומים בדרכי שתן) הם אחד הזיהומים חיידקיים הנפוצים ביותר וניתן לחלק לשתי קטגוריות המבוססות על המנגנון של רכישה, קהילה וnosocomial רכש UTI. זיהומים בדרכי השתן מתרחשים לעתים קרובות בנשים ומחקרים בריאים נרכשה בקהילה הראה כי כ -50% מהנשים יהיו לפחות אחד UTI בחייהם 1. בנוסף, הישנות היא בעיה עיקרית. יש אישה שיש הדבקה ראשונית סיכוי 25-40% שיש לו זיהום שני בתוך שישה חודשים למרות טיפול אנטיביוטי מתאים, ונשים רבות ממשיכים להיות הישנויות תכופות 2. החיידקים הגורמים לזיהומים אלה גם הופכים יותר ויותר עמידים לאנטיביוטיקה פרוטוקולים נוספים של בלבול טיפול 3-6. דלקת בדרכי השתן משפיעים על מיליוני אנשים בכל שנה עולים כ -2.5 מליארד דולרים בהוצאות הקשורות בריאות בארה"ב, מה שמדגיש את ההשפעה והשכיחות של המחלה1,7 .Nosocomial רכש זיהומים בדרכי שתן קשורים בעיקר עם הנוכחות של גופים זרים כגון צנתרים שכינה. הזיהומים בדרכי השתן הקשורים צנתר (CAUTI) יישאר nosocomial הנפוץ ביותר רכש UTI, והיוו ~ 70-80% מזיהומים כגון 8. יתר על כן, CAUTI קשור עם תחלואה ותמותה מוגברות וזה הגורם הנפוץ ביותר לזיהומים בדם משניים 9.

הקהילה קשורה UPEC רכשה זיהומים בדרכי השתן הם חשבו להיגרם על ידי ההקדמה של חיידקים לשלפוחית ​​השתן ממאגרים במערכת העיכול באמצעות מניפולציה מכאנית במהלך קיום יחסי מין, היגיינה הלקויה או דינמיקת אוכלוסיית חיידקים אחרת בין מארח שונה נישות 10. ברגע שנכנס לשלפוחית ​​השתן, UPEC להעסיק גורמים ארסי רבים, כולל כמוסה, מערכות רכישת ברזל, רעלים, פלסמיד ארסיות, tRNAs, איי פתוגניות וגורמי התישבות שהוכחו לשחק תפקיד בפתוגנזה <sup> 11-14. קריטי להקמתה של התישבות UPEC, UPEC גם לקודד סוגים שונים של פילי מלווה דבק סדרן מסלול (CUP) שמכירים קולטנים עם סגוליות stereochemical 15. פילים מסוג 1, הטו עם adhesin FimH, באים לידי הביטוי על ידי UPEC ולאגד mannosylated uroplakins 16 וα-1, β-3 integrins 17, אשר באים לידי ביטוי על פני השטח luminal של שני שלפוחיות האדם ועכבר 18. אינטראקציות בתיווך FimH אלה להקל קולוניזציה ופלישה של תאי האפיתל השטחיים 19,20 חיידקים. פעם בתוך התא, UPEC יכול לברוח לתוך הציטופלסמה שבי חיידק בודד במהירות יכול לחלק ליצירת קהילה תאית חיידקים (IBC), אשר על התבגרות, יכול להכיל ~ 10 4 חיידקים 21. היווצרות IBC הודגמה בלפחות שישה זנים שונים עכבר, C3H / חן, C3H / HeJ, C57Bl / 6, CBA, FVB / ניו ג'רזי וBALB / ג, ועם מגוון רחב של UPE שונהזני C וEnterobacteriaceae 22-24 אחר. עם זאת הבדלי זמן ומרחב של היווצרות IBC יכולים להשתנות בהתאם לרקע העכבר ומתח UPEC הדבקה. בC3H / עכברי חן נגועים בUPEC הטיפוסי זני UTI89 או היווצרות CFT073, IBC ניתן דמיינו כbiomasses הקטן של חיידקים מוקדם ככל 3 HPI (לאחר זיהום שעות). קהילה זו ממשיכה להתרחב ומגיעה "נקודת אמצע" של הפיתוח כ -6 HPI כאשר חיידקי המוט בצורה לכבוש אחוז גדול של מרחב cytoplasmic של תאי מטרייה שטחיים סופני הבדיל צורת IBCs המוקדם אלה באופן יחסי סינכרוני עם הרוב בו מוצגות ממדים דומים ומורפולוגיות. ~ 8 HPI החיידקים בשינוי IBC מחיידקים לCocci מורפולוגיה. IBCs הם בעלת האופי ארעי. לפיכך, התבגרות IBC 12-18 תוצאות HPI בהמשך ההתרחבות של אוכלוסיית החיידקים, ואחריו filamentation ופיזורם מחוץ לתא with התפשטות לאחר תאים שכנים 23. כך, הנישה IBC מאפשרת התפתחות חיידקים מהירה בסביבה המוגנת מפני תגובה חיסונית מארח ואנטיביוטיקה 25. השלבים שונים של זיהום UPEC כי הם ראו בעכברים גם הם נצפו בבני אדם, כגון IBCs וfilamentation, התומכים במודל העכבר של UTI ככלי מועיל שיכול לשמש מודל UTI בבני האדם 22,26-28.

בעוד שרוב הנשים חווים UTI בחייהם, התוצאה של זיהומים אלה יכול לנוע בין זיהום הגבלה עצמית חריף ללא הישנות, לדלקת שלפוחית ​​השתן חוזרת ונשנית בתדירות גבוהה. יתר על כן, מחקרים הראו התרחשות משפחתית חזקה של דלקת בדרכי שתן, המצביע על מרכיב גנטי תורם לרגישות UTI 29. מצאנו כי תוצאות UTI השונות ראו במרפאות יכולות להיות שיקוף על ידי התוצאות השונות של זיהום UPEC הניסיוני בין זנים טהורים עכבר 30. לדוגמא, C3H / חן, CBA, עכברי DBA, וC3H / HeOuJ רגישים, באופן תלוי מינון זיהומיות, לדלקת שלפוחית ​​השתן לטווח ארוך, כרונית המאופיין על ידי חיידקים מתמשכים, גבוהים כייל (> 10 4 יחידות מושבה להרכיב (CFU) / מיליליטר), חיידקים גבוה כייל נטל שלפוחית ​​השתן בהקרבה> 4 שבועות לאחר זיהום (WPI), דלקת כרונית, ונמק urothelial. עכברים אלה גם להציג רמות גבוהות בסרום של IL-6, G-CSF, KC, וIL-5 בתוך 24 HPI הראשון המשמשות כסמנים ביולוגיים להתפתחות דלקת שלפוחית ​​השתן כרונית. זה עשוי לייצג במדויק את המהלך הטבעי של דלקת בדרכי שתן בנשים מסוימות, כמו מחקרי פלצבו הראו כי אחוז גדול של נשים חווים UTI ישמור על רמות גבוהות של חיידקים בשתן שלהם במשך כמה שבועות לאחר התסמינים הראשונים של דלקת שלפוחית ​​השתן אם לא ניתן טיפול אנטיביוטי 31 , 32. יתר על כן, שימוש בעכברי C3H / חן, מצאנו כי היסטוריה של דלקת שלפוחית ​​השתן כרונית מהווה גורם סיכון משמעותי לזיהומים חוזרים ונשנים חמורים שלאחר מכן. חוזר ונשנה בדרכי השתן הוא הכי siביטוי קליני gnificant של UTI ועכבר C3H / חן הוא כיום המודל למד רק שמשחזר נטייה מוגברת לאחר החשיפה קודמת. תוצאת UTI שנייה סכמה בC57Bl / 6 עכברים שבו זיהום UPEC החריף הוא הגבלה עצמית, עם רזולוציה של דלקת שלפוחית ​​השתן ובקטרוריה בתוך כשבוע. מעניין לציין, במודל זה, UPEC ליצור בקלות מאגרים תאיים שקטים בתוך רקמת שלפוחית ​​השתן ממנו UPEC מסוגל מתעורר ממצב רדום כדי לחדש את UTI פעיל, שעלול להסביר מנגנון אחד לדלקת בדרכי שתן חוזר אותו זן בבני אדם 33, 34.

בנוסף להשפעות גנטיות על רגישות UTI, הקדמה של קטטר לשלפוחית ​​השתן מגדילה מאוד את הסיכוי שיש זיהום, כמו גם להגדיל את הטווח של חיידקים מסוגלים לגרום לזיהום. הוכח כי צנתור שתן אנושי גורם היסטולוגית ושינויים חיסוניים בשלפוחית ​​עקב לחץ מכאני שגורם לתגובה דלקתית חזקה, קילוף, בצקת של propria lamina וsubmucusa, הדליל urothelial, ונגע ברירית של urothelium וכליות 35,36. בנוסף, קטטר מספק משטח לקובץ מצורף חיידקים ובכך ליצור סביבה מנוצלת על ידי כמה מינים לגרום CAUTI. בעוד UPEC עדיין תורם רב, אנטרוקוקוס faecalis מהווה 15% מCAUTI אלה 37. א faecalis הופך עמיד יותר ויותר לאנטיביוטיקה עם vancomycin הופעת התנגדות, שהתחזה לדאגה בריאותית רצינית 38. א faecalis להחזיק גורמים ארסי רבים, כולל רעלים וadhesins הכרחי לקובץ מצורף לשני קטטר ואפיתל 38. במהלך צנתור שתן, המארח הוא פגיע להידבקות של חיידקים, כפל והפצה ב39,40 בדרכי השתן. א faecaליס יוצר biofilm על קטטר כחלק ממנגנון להתמיד בשלפוחית ​​השתן ולהפיץ לכליות, אשר הוא לשחזר במודל עכבר CAUTI 41. לאחרונה, זה הוכח במהלך צנתור שתן, פיברינוגן (FG) הוא שוחרר לתוך שלפוחית ​​השתן כחלק מהתגובה הדלקתית. FG מצטבר בשלפוחית ​​השתן, מעילי קטטר וחיוני לE. faecalis היווצרות biofilm, מתפקד כפיגום מצורף. במודל C57BL / 6 עכבר של CAUTI, גילה שE. היווצרות faecalis biofilm על קטטר, ובכך ההתמדה בשלפוחית ​​השתן, הייתה תלוי בpilus EBP, במיוחד EbpA adhesin קצהו. מצאנו כי תחום N- המסוף של EbpA נקשר במיוחד לFG ציפוי קטטר. בנוסף, נמצא כי א faecalis מנצל FG כמקור המטבוליט במהלך זיהום, וכך לשפר את היווצרות biofilm 42.

מודלים של העכברים הוכיחו קריטיים לאחורייםtanding כמו גם חיזוי הקליני של דלקת בדרכי השתן וCAUTI 41. במאמר זה אנו מדגימים הכנת הבידוד של דלקת שלפוחית ​​השתן UPEC לבודד UTI89 וחיסון של עכברים דרך השופכה C3H / חן. בנוסף, אנחנו מדגימים פרוטוקול להכנסה קטטר בעכברי C57BL / 6 וחיסון של א ' זן faecalis OG1RF. שתי טכניקות אלו להוביל לדלקת בדרכי שתן עקבית ואמינים או CAUTI בעכברים. אנחנו גם להציג טכניקות המשמשות להתבונן היווצרות IBC בדלקת שלפוחית ​​השתן חריפה ואיסוף שתן לניתוח דלקת שלפוחית ​​השתן כרוני או חוזר ונשנה. עכברי C3H / חן שימשו ללמוד היבטים של הפתוגנזה UPEC כולל פלישה ראשונית חיידקים, היווצרות IBC, filamentation והפיתוח של דלקת שלפוחית ​​השתן כרוני 23,33,43. פרמטרים אלה גם ארסיות נחקרו במגוון רחב של רקעי עכבר אחרים 22,33. לCAUTI, C57BL / 6 המודל מאפשר להשתלת גוף זרה לתוך שלפוחית ​​השתן עם עמיתי חיידקים הבאיםlonization, שיכול להישמר במשך 7 ימים לאחר הזיהום 41. מודלים אלה היו שימושיים להערכת מנגנוני אלימות של חיידקים, תגובות מארחות לדלקת בדרכי השתן ומנגנונים לערער תגובות מארחות, הרבה מהם כבר סכמו או שנצפו באוכלוסיות אנושיות קליניות לאחר מכן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה: ועדת בעלי החיים באוניברסיטת וושינגטון המחקרים אישרה את כל זיהומי העכבר ונהלים כחלק מפרוטוקול מספר 20120216, אשר אושר על 2013/01/11 ויפוג 2016/01/11. טיפול כולל של בעלי החיים היה בקנה אחד עם הוראות לטיפול ושימוש בחי המעבדה מהמועצה הלאומית למחקר וטיפול במשאבי מדריך משרד החקלאות בעלי החיים. נהלי המתת חסד בקנה אחד עם "הנחיות AVMA להמתת החסד של בעלי חיים 2,013 מהדורה."

1. UPEC UTI פרוטוקול, הרכבה מחט הכנה (איור S1)

  1. הסר את מכסה מחט G 30. נושא כ 1 אינץ 'של צינור PE10 על הפיר של המחט. UV לעקר את מכלולי מחט לילה. ניתן לאחסן מחטי צינתור ללא הגבלת זמן בצלחות פטרי סטרילי.

2. UPEC קטריאלי הבידוד הכנה

  1. הכן הבידוד UTI89 (להתחיל 72 שעות לפני inoculaיום tion)
    1. פס UTI89 על צלחת אגר LB (לוריא-Bertani) ממניות קפוא. דגירה הלילה בשעה 37 מעלות צלזיוס. פיק מושבה ולחסן אותו לתוך 10 מיליליטר של LB בבקבוק 125 מיליליטר. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות, באופן סטטי.
    2. לחסן 10 μl של תרבות הלילה ל -10 מיליליטר של LB בבקבוק 125 מיליליטר חדש ל24 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, באופן סטטי.
    3. העברת 3 מיליליטר (משתנה בהתאם לזן וגודל הבידוד רצוי) לצינורות 1.5 מיליליטר סטרילי וצנטריפוגות ב 7000 XG במשך 3 דקות וresuspend גלולה ב1x PBS ו צנטריפוגות בפעם שנייה. Resuspend גלולה החיידקים ב 1 מיליליטר 1x PBS.
  2. למדוד צפיפות אופטית חיידקים ולהתאים ריכוז לצפיפות הבידוד הרצוי. הריכוז הסטנדרטי של הבידוד המשמש הוא 10 7 חיידקים; עם זאת, זה עשוי להשתנות בהתאם לעיצוב של המחקר.

3. בקטריאלי חיסון

  1. נקה את תחנת העבודה עם 70% אתנול ו גמעל האזור עם נייר סופג (או להשתמש בזרימת מכסה המנוע סטרילי).
  2. לצייר עד 0.9 מיליליטר של הבידוד החיידקים מוכן לתוך מזרק 1 מיליליטר (TB) (להסיר בועות אוויר). צרף מחט סטרילית חיסון מוכן עם צינור PE10, על המזרק המכיל את הבידוד, אז סטרילי לקצץ צינורות פוליאתילן.
    הערה: השאר 1 מ"מ של צינורות מעל קצה המחט כדי למנוע ניקוב שלפוחית ​​השתן.
  3. חותכי חתיכה מרובעת 1 אינץ 'של parafilm ולשים טיפה של חומר סיכה כירורגית (בערך בגודל של מטבע) על גבי.
  4. הרדימי עכברי C3H / חן נשיים על ידי לשים אותם בצנצנת זכוכית 32 אונקיה מכילה תה infuser כדור עם כדורי צמר גפן טבול עם 3 מיליליטר של isoflurane או תא אידוי (הבאות מייצר פרוטוקול) עד ​​מחוסר הכרה אך עדיין נושם באופן נורמלי (נשימת 1 / sec) .
    הערה: ועדות IACUC חלק לא לאשר את השימוש בצנצנת או מאדה. בצע את אינדיקציה לועדת IACUC של המוסד שלך.
    הערה: אם צנצנת זכוכיתעם תה-כדור ו / או חרטום עם כדורי צמר גפן isoflurane-soakd משמשים, בעלי החיים חייבים להיות שנצפו בזהירות למניעת מינון יתר ומות הרדמה. היתרון של שימוש בתא אידוי והרדמה הוא שהיא מספקת ממשל isoflurane מבוקר שימנע מינון יתר מקרי. זהירות: Isoflurane היא הרדמה משאיפת. השתמש באזור מאוורר היטב ולמזער שאיפה.
  5. הסר את העכבר מהצנצנת / מאדה ולמקם אותו על הגב שלה על מגבת נייר ולהפיץ את הרגליים.
  6. מכסה את האף של העכבר עם חרטום (צינור המחובר למכשיר האדים המספק מינון מבוקר isoflurance שמגיע מאובזר בכמה יחידות מאדה) או צינור חרוטי 50 מיליליטר עם כדור צמר גפן המכיל כמות קטנה (כ 1-2 מיליליטר ) של isoflurane.
  7. בעדינות פועם שלפוחית ​​שתן ולגרום להבטיח שלפוחית ​​השתן בטלה. נגב את אזור periurethral עם אתנול 100% לנגב. מורח את מחט חיסון / מזרק, הנקודה ראשונה, לחומר סיכה כירורגית.
  8. לחסן כל עכבר עם 50 μl של פתרון חיידקים על ידי החדרת מחט חיסון transurethrally, כ 12 מ"מ, ולחיצה על בוכנת המזרק בעדינות לוותר הבידוד לתוך שלפוחית ​​השתן בעדינות (10 μl / sec). הסר את מחט החיסון מהעכבר.
    הערה: תמורה מיידי של הבידוד בפתיחת השופכה כאשר מתחיל לחסן מציינת הכנסה תקינה או לא שלמה של המחט.
  9. הסר את העכבר מהחרטום ולהחזיר אותו לכלוב שלה. חזור על שלבים 3.3-3.8 עבור כל עכבר. כאשר / אם מיתוג תנאים / זני הבידוד, להשליך את המזרק ומחט חיסון במכל חדים אושר ומתחילים שלב 3.2 שוב.
    הערה: חיסון עם אורגניזמים uropathogenic בדרך כלל אינו גורם לתסמיני כאב חמורים. עם זאת, במקרים נדירים, מתן מינונים גדולים של פתוגנים עלול לגרום לחום, ירידה בצריכת מזון ומים והתנהגות חריגה.בריאות nimal צריכה להיות במעקב לאורך כל הניסוי. אם תסמיני כאב גלויים הם הודעה, משכך כאבים, כגון עצירות (0.05-0.1 מ"ג תת עורי / קילוגרם נתון), יכול להיות מיושם. נהלים צריכים להיות בהתאם לIACUC של כל מוסד.

4. קביעת הניטל בקטריאלי

  1. הכן 5 מיליליטר צינורות נפרדים לכל זוג בשלפוחית ​​השתן ובכליות להיות שנקטפו. הוסף 1ml של PBS / צינור / שלפוחית ​​השתן עכבר 1x להיות שנקטפו. להוסיף 0.8 מיליליטר של 1x PBS / צינור / זוג כליות עכבר כדי לקצור. תווית צינור אחד למתאים לעכבר נתון. הכן צלחת 96-היטב המכילה 180 μl של 1x PBS בכל טוב לדילולים 1:10 סדרתי.
  2. נקה את אזור העבודה עם אתנול 70% ולכסות את האזור עם מגבת או נייר סופג כיסוי.
  3. להרדים את העכבר עם isoflurane (ראה שלב 3.4) עד העכבר מפסיק לנשום למשך כ 1 דק ', ואז למקם אותו על מגבת כיסוי או נייר הסופג. שיטות אחרות של euthanaSIA גם מתקבלים על ידי ועדות IACUC, כגון פחמן דו חמצני, וניתן להחליף למנת יתר isoflurane.
  4. להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם מהיר שמורכב מריסון הצוואר בבסיס הראש ומושך את הזנב אופקי מהגוף עד פריקה מתרחשת.
    הערה: ועדות רוב IACUC דורשות אמצעים משניים של המתת חסד ונקע בצוואר הרחם היא שיטה נפוצה. עם זאת, ניתן להשתמש בשיטות אחרות אם אושרו על ידי ועדת IACUC.
  5. מניחים את העכבר המת על הגב שלה ולרסס אתנול 70% על הבטן. לנתח את העכבר, לקצור את שלפוחית ​​השתן וכליות, על מנת שכדי למזער אפשרות של זיהום מהדם לאחר נתיחת הכליות. מניחים את האיברים באופן עצמאי לתוך 5 מיליליטר הצינורות מוכנים המכילים 1X PBS (ראה שלב 4.1).
    הערה: השתמש במספריים שונים לנתיחה החיצונית ולקצירת איברים כדי למזער זיהום.
  6. הקש הצינור כדי להבטיח את האיברים נמצאים בtהוא 1X PBS. חזור על שלב 4.3-4.5 עבור כל עכבר. מספריים נקיים ומלקחיים באתנול 70% לאחר כל עכבר.

שחזור קטריאלי 5.

  1. Homogenize שלפוחית ​​השתן וכליות שנקטפו ב 5 מיליליטר הצינורות עם homogenizer רקמות, 15 שניות לכליות ושלפוחית ​​שתן 30 שניות ל. יש לשטוף ברצף homogenizer ב1x PBS, 70% אתנול ו 1x PBS בין דגימות.
  2. הפוך דילולים 1:10 סדרתי החוצה עד 10 -8 וצלחת כל דילול לCFU (יחידות מושבה להרכיב) על צלחות אגר LB. דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולספור מושבות למחרת.

6. IBC ספירה

  1. הסביבה נקיה מחיידקים להסיר את שלפוחית ​​השתן ולמקם אותו בPBS 1x בצלחת 6-היטב עם תחתית סיליקון. ניתן להכין צלחות באמצעות ערכת אלסטומר סיליקון ולשפוך כ 1 סנטימטר של סיליקון בכל טוב, לראות מייצר הוראות. חותך את שלפוחית ​​השתן במחצית באמצעות מספריים.
  2. באמצעות סיכות מתכת קטנות בעדינות פסוק את bladder כך שלומן שלפוחית ​​השתן פונה כלפי מעלה. הקפד למקם את הסיכות בקצוות החיצוניים של חלקי שלפוחית ​​השתן כדי להבטיח את הסכום המקסימאלי של urothelium חשוף.
  3. לאחר נתלכסנו, לשטוף בעדינות את שלפוחית ​​השתן פעם עם PBS 1x. הסר את PBS 1x ידי pipet. תקן את שלפוחית ​​השתן על ידי הוספת paraformaldehyde 3% מספיק כדי לכסות את שלפוחית ​​השתן פרושות כולו. זהירות: Paraformaldehyde הוא מסרטנת. ציוד מתאים מגן, כוללים כפפות, צריך להיות משוחק בכל העת. רשות צריכה לעקוב אחר הנחיות מוסדיות.
  4. דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. הסר פתרון paraformaldehyde. לשטוף פעם אחת עם 1X PBS.
  5. לשטוף עם פתרון לשטוף LacZ (2 מ"מ MgCl 2, 0.01% deoxycholate נתרן ושל 0.02% nonidet-p40in 1x PBS) שלוש פעמים במשך 5 דקות לכל לשטוף.
  6. הסר פתרון לשטוף ולהוסיף מספיק כתם LacZ (9.5 מיליליטר הפתרון לשטוף LacZ, 0.4 מיליליטר 25 מ"ג / מיליליטר X-gal ו 0.1 מיליליטר של 100 מ"מ K-ferrocyanide / K-ferrIcyanide) כדי לכסות את השלפוחיות. לדגור על 30 מעלות צלזיוס overnigHt מוגן מפני אור.
  7. הסר שלפוחיות פרושות מחממה ולבחון IBCs, המופיעים puncta הכחול כמו דמיין עם היקף לנתח, הגדלת 40-60X.
    הערה: לפעמים עכבר עשוי להשתין לפני המיקום של הצינור מתחת לשופכה. במקרה זה, לחכות 15-20 דקות לפני שתנסה לאסוף שתן שוב.

אוסף 7. תן לבקטרוריה CFU ספירה (לא ישים לCAUTI)

  1. לאסוף מראש שתן או לאחר זיהום בעדינות לרסן את העכבר על ידי לחיצה על הזנב ולמקם אותו על משטח מוגבה שטוח (החלק העליון של כלוב עכבר).
  2. החזק צינור 1.5 מיליליטר סטרילי תחת השופכה העכבר. לחץ בעדינות על הגב של העכבר ליד הזנב כדי להפעיל לחץ על שלפוחית ​​השתן. לתפוס את השתן בצינור 1.5 מיליליטר.
  3. הפוך דילולים 1:10 סדרתי אל 10 -7 וצלחת כל דילול על יטראות מתאימות דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולספור מושבות למחרת.

8. CAUTI דגם פרוטוקול, צנתר מחט ההכנה לCAUTI דגם (איור S2)

  1. הסר את מכסה מחט G 30. חותכי חתיכה של צינור PE10 ו -5 מ"מ חתיכה של צינורות סיליקון כגון RenaSIL 7 מ"מ. השחל את המחט עם צינור PE10 עד צינורות נוגעים הבסיס של המחט.
  2. לאחר מכן להאכיל את פיסת 5 מ"מ על המחט המכיל PE10. UV לעקר את מכלולי מחטי לילה.
    הערה: בעת טעינת צינורות סיליקון, להשאיר כ 1 מ"מ של צינורות הארכת עבר קצה המחט.

9. E. faecalis OG1RF קטריאלי הבידוד הכנה

  1. הכן הבידוד OG1RF מתחיל 48 שעות לפני יום החיסון. פס OG1RF על צלחת BHI (עירוי לב מוח) ממניות קפוא.
  2. פיק מושבה ולחסן אותו לתוך 10 מיליליטר של BHI ולגדל אותו באופן סטטי במשך 18 שעות על 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה התרבות ולשטוף את הכדור (3 פעמים) ב 1 מיליליטר כרכים של סטרילי 1X PBS.
  3. Resuspend גלולה חיידקים לתוך 1x PBS. למדוד צפיפות אופטית חיידקים ולהתאים את הריכוז לגודל הבידוד הרצוי. הריכוז הסטנדרטי של הבידוד המשמש הוא 10 7; עם זאת, זה עשוי להשתנות בהתאם לעיצוב של המחקר

10. צנתר השרשה

  1. נקה את תחנת העבודה עם 70% אתנול ולכסות את האזור עם כיסוי סופג (או להשתמש בזרימת מכסה המנוע סטרילי).
  2. צרף צנתר-מחט למזרק 1 מיליליטר ריק (שחפת). חותכי חתיכה מרובעת 1 אינץ 'של parafilm ולשים טיפה של חומר סיכה כירורגית (בערך בגודל של מטבע) על גבי.
    הערה: שתי מחטים שונות משמשות לתצהיר של הצנתר ולבידוד לחיסון מקרי ממוזער בשל המניפולציה המכנית הנדרשת להשתלת צנתר. זה גם מאפשר לנוחיות הכנת מחטי חיסון פחות.
  3. הרדימי עכברי C57BL / 6 על ידי לשים אותם בצנצנת זכוכית 32 אונקיה מכילה תהכדור -infuser עם כדורי צמר גפן טבול ב3 מיליליטר של isoflurane או תא אידוי (הבא מייצר פרוטוקול) עד ​​מחוסר הכרה אך עדיין נושם באופן נורמלי (נשימת 1 / sec).
  4. ואז לשים את העכבר על גבה על מגבת נייר ולהפיץ את הרגליים. מכסה את האף של העכבר עם חרטום או צינור חרוטי 50 מיליליטר עם כדורי צמר גפן המכילים כמות קטנה (כ 1-2 מיליליטר) של isoflurane.
    זהירות: Isoflurane היא הרדמה משאיפת. השתמש באזור מאוורר היטב ולמזער משאיפת על ידי חוקר.
  5. בעדינות פועם שלפוחית ​​שתן ולגרום להבטיח שלפוחית ​​השתן בטלה. נגב אזור periurethral עם אתנול 100% לנגב.
  6. לחטא את אזור periurethral עם 10% פתרון povidone- יוד באמצעות מוליך כותנה-טיפ. מורח את מחט חיסון / מזרק, הנקודה ראשונה, לחומר הסיכה כירורגית.
    הערה: Povidine-יוד משמשת להשתלת צנתר, שהוא פתרון ספטית חזק יותר מאלכוהול. השתלת צנתר דורשתמניפולציה מכאנית יותר להכניס את הצנתר ובכך פוטנציאל גדול יותר לזיהום.
  7. הכנס את קטטר לתוך הפתח השופכה. פעם אחת ב, פינצטה השימוש לדחוף (PE10 7 מ"מ) החתיכה הארוכה לכיוון שלפוחית ​​השתן, וכתוצאה מכך דוחפת (סיליקון 5 מ"מ) צנתר קטן והפקדתו לשלפוחית ​​השתן. הסר את המחט, עם צינורות 7 מ"מ עדיין מחוברים, באופן מיידי.

11. בקטריאלי חיסון

  1. בצע את פרוטוקול חיסון החיידקים בסעיף 3, באמצעות הבידוד מוכן מסעיף 9. הסר את העכבר מהחרטום ולהחזיר אותו לכלוב שלה

12. בכל נקודת זמן של קורבן

  1. הכן 5 מיליליטר צינורות לשלפוחית ​​שתן וכליות (לאיברים אחרי שלב 4.1) ו -1.5 מיליליטר צינור Eppendorf לצנתרים. הוסף 1 מיליליטר של 1x PBS לתוך 1.5 מיליליטר צינור Eppendorf לדגימות קטטר
  2. בצע את השלבים 4.3-4.5. לנתח את העכבר, קצירת שלפוחית ​​השתן, הכליות וקטטר, PLAcing הרקמות באופן עצמאי לצינורות 5 מיליליטר מכילים 1X PBS וקטטר לתוך 1.5 מיליליטר Eppendorf (ראה שלב 12.1).
    הערה: השתמש במספריים שונים לנתיחה החיצונית ולקצירת איברים ואחזור קטטר כדי למזער זיהום
  3. לאחר מכן בצע צעד 4.6.

שחזור קטריאלי 13.

  1. לאיברים, בצע את השלבים 5.1 ו -5.2. להתאוששות חיידקים מצנתרים, מערבולת במהירות המרבית למשך 30 שניות, sonicate דגימות קטטר למשך 5 דקות באמצעות sonicator אמבטיה, ולאחר מכן מערבולת במהירות המרבית ל30 שניות נוספות.
  2. הפוך דילולים 1:10 סדרתי החוצה עד 10 -8 וצלחת כל דילול לספירת CFU על צלחות BHI. דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולספור מושבות למחרת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המודלים השלפוחית ​​של UTI קשור מסובך וקטטר לספק פלטפורמות גמישות להבהרת המנגנונים המולקולריים של פתוגנזה של חיידקים, ההשפעה של מחלות אלה ברקמת מארח, והפיתוח ובדיקות של גישות חדשות לניהול הזיהומים הנפוצים ויקרים הללו. בהתאם לזן העכבר והפתוגן, חיסון שלפוחית ​​יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות מארח הפתוגן להבהיר גורמים הכרחיים לייזום או ויסות חריפה (איור 1 ו 3) (2 איור) דלקת שלפוחית ​​השתן, כרוני או חוזר ונשנה. הנתונים מוצגים באיור 1 הם נציג של שלב אקוטי (24 HPI) התישבות בדרכי שתן על ידי דלקת שלפוחית ​​השתן UPEC הטיפוסי לבודד UTI89 44. בעקבות חיסון, הזיהומים מותר לפתח עבור 24 שעות ובשלב העכברים הקריבו ורקמת שלפוחית ​​השתן וכליות הומוגני. Homogenates הרקמה היא סדרתי dilutאד ומצופה לספירה של חיידקי התיישבות. קולוניזציה UPEC הכרונית ודלקת שלפוחית ​​השתן יכולים להיות שהוקמו ומתוחזק בכמה שורות עכבר (בעיקר C3H / חן) במינון זיהומיות וuropathogen אופן תלוי. דלקת שלפוחית ​​השתן כרונית מוגדרת כבקטרוריה גבוהה כייל המתמשך (> 10 4 CFU / מיליליטר), דלקת שלפוחית ​​השתן ושלפוחית ​​שתן נטל חיידקים גבוה כייל (> 10 4 CFU / שלפוחית ​​השתן) בקרבה 33. הנתונים מוצגים באיור 2 הם CFUs נציג המתרחש 4 שבועות לאחר חיסון של עכברי C3H / חן עם 2 x 10 7 CFUs של UTI89. בתנאים אלה ניסיוניים, 20-50% של עכברים נגועים לפתח דלקת שלפוחית ​​השתן כרונית בעוד 50-80% הנותרים של עכברים לפתור את הזיהום. דואליות זו של תוצאה תלויה במחסום מארח הפתוגן שהחליט בתוך 24 HPI הראשון. הפעלה (או לא) של תוצאות המחסום בהפצה נצפתה bimodal של titers חיידקים, אשר מתחילה להתבטא בהשתן בשעה 3 dpi (לאחר זיהום ימים) ובשלפוחית ​​השתן בdpi הקרבת 28 (איור 2) 33. עכברים עם היסטוריה של דלקת שלפוחית ​​השתן כרוני נוטים באופן משמעותי לדלקת שלפוחית ​​השתן כרוני חוזרת ונשנית על אתגר לאחר ההדבקה הראשונית אינה מסומנת עם טיפול אנטיביוטי 33. כמו כן, היסטוריה של UTI היא גורם סיכון ידוע לדלקת בדרכי שתן חוזרות ונשנות בבני אדם. כך, זה הוא המודל הידוע רק לשמש כדי לחקור את היווצרות דלקת בדרכי השתן חוזרות ונשנות. כאשר הדוגמנות בניסוי UTI ברקע עכבר חלופי, חשוב לקבוע אם זן העכבר הוא רגיש לזיהומים בדרכי שתן, דלקת בדרכי שתן חוזר או CAUTI, בהתחשב בכך שחלק מהזנים הם פחות או יותר עמיד לפיתוח תסמונות אלה 33.

מדידה נוספת של דלקת שלפוחית ​​השתן חריף היא ספירת IBC. היווצרות IBC מוגבלת לתאי מטרייה השטחיים סופני המובחנים. כימות IBC הוא מדד אינפורמטיבי של נטל חיידקים במהלך ציסטה החריפהאיט איז ורמות גבוהות של IBCs לתאם עם הסיכון לפתח דלקת שלפוחית ​​השתן כרוני 21. היווצרות IBC מתרחשת רק בשלבים אקוטיים של מחלה. בעקבות הקילוף של תאי מטרייה השטחיים, IBCs כבר לא נצפה. במודל UTI C3H / חן, IBCs ניתן למדוד 6 שעות לאחר ייחס ~ 1 x 10 7 CFU של UTI89 לתוך שלפוחית ​​השתן transurethrally. שלפוחיות נפשטות עם סיכות מתכת על צלחות סיליקון ומוכתמות לביטוי של LacZ. LacZ, β-galactosidase, הוא אנזים חיידקים נפוץ הביע שדבק הצמדת β בין גלקטוז וסוכרים אחרים. אנזים זה יכול לשמש כדי לזהות חיידקים על ידי אספקת X-gal, אנלוגי β-galactoside, אשר מייצר צבע כחול על מחשוף. בעקבות צביעה, השלפוחיות הם צילמו תחת מיקרוסקופ לנתח עם IBCs מופיע כpunctae נקודות כחולות / סגולות על urothelium וIBCs אפשר למנות על ידי ספירת הנקודות (איור 3 א). בעוד שמספר אניBCS יצר לכל בעלי חיים משתנה, בC3H / רקע חן ממוצע של 50 ~ IBCs נראה לשלפוחית ​​שתן (איור 3). עליית IBCs באופן תלוי מינון. מספר IBCs היוצרים משתנה בין UPEC וזני רקע עכבר. לדוגמא, בC57Bl / 6, הבידוד של ~ 1 x 10 7 UTI89 תוצאות בהיווצרות של כמה מאה IBCs לשלפוחית ​​שתן.

מעבר לקהילה מסובכת רכשה UTI דגם לעיל, זיהומים בדרכי שתן טיפול הית קשורות מייצגים נטל משמעותי למערכת הבריאות. זיהומים בדרכי השתן מהווים כ -40% מכלל הזיהומים הקשורים לטיפול בבריאות ועד 95% מכל הזיהומים בדרכי שתן הטיפול בריאותי הקשורים הם קטטר קשור 45. כאן אנו מדגימים מודל עכבר שתל שלפוחית ​​השתן של CAUTI שמייצג מערכת רבת עוצמה לניתוח הניסיוני של בעיה קלינית קשה זו. הנתונים מוצגים באיור 4 הם נציג של 24 שעות עם זיהומי המודל E. faecalis של לאמן OG1RF. כאשר 1 x 10 7 CFU של OG1RF מחוסן intravesically לשלפוחית ​​שתן unimplanted, הזיהום מתחיל ברור על ידי 24 HPI (איור 4 א) ועל ידי 3 dpi הזיהום נפתר 41. לעומת זאת, חיסון של OG1RF לתוצאות מושתלות שלפוחית ​​השתן בקולוניזציה של שני קטטר ושלפוחית ​​השתן, עם 10 רמות קולוניזציה שלפוחית ​​השתן גבוהות פי 24 בHPI מאשר אלו שנצפו בשלפוחיות unimplanted (איור 4 א ו -4 ב). בנוסף, זיהום זה נשמר ב> 10 6 CFU בשלפוחית ​​השתן עד אובדן קטטר כ 7 dpi 41. כל הדגמים הניסיוניים שתוארו נוחות לרמה גבוהה של גמישות ניסיונית, לרבות, אך לא בלעדי לגישות שונות להדמיה מקרוסקופית ומיקרוסקופית של רקמות ומשטחים הנגועים, גדלי הבידוד שינו ופעמים מחלה, זיהומים תחרותיים, ולארח ניתוחים חיסוניים .

ve_content "> איור 1
איור 1:. קולוניזציה בדרכי שתן 24 שעות נקבה, C3H / עכברי חן ישנים 7-8 שבוע היו מחוסן transurethrally עם ~ 2 x 10 7 CFU של דלקת שלפוחית ​​השתן UPEC הטיפוסי לבודד UTI89 למשך 24 שעות. CFUs הנציג התאושש מרקמות שלפוחית ​​השתן וכליות שנקטפו מוצג, n = 5. קו מקווקו מציין את הגבול התחתון של זיהוי (20 CFU).

איור 2
איור 2:. 28 יום קולוניזציה בדרכי שתן נקבה, C3H הישן 7-8 שבוע / עכברי חן היו מחוסן transurethrally עם ~ 2 x 10 7 CFU UTI89. שתן היה לאסוף בפוסט ימי זיהום המצוין (dpi) ומצופה לספירת CFU. titers שלפוחית ​​השתן 28 יום נציג והכליות גם מוצגים, n = גבול CFU שתן 8. נמוך של זיהוי (1000 CFU / ml) הוא כונה על ידי הקו המקווקו. represen קו המקווקוTS גבול תחתון של רקמת זיהוי, 20 CFU / רקמה.

איור 3
איור 3:. IBC ספירה נקבה, C3H הישן 7-8 שבוע / עכברי חן היו מחוסן transurethrally עם ~ 1 x 10 7 CFU UTI89. שלפוחיות נקצרו 6 HPI ופרושות לצביעת מבני תעשייה. תמונה () של שלפוחית ​​השתן פרושות לאחר צביעת LacZ. IBCs מיוצגים כנקודות כחולות. תמונת הבלעה היא הגדלה דיגיטלית של הסעיף של התמונה בקופסא השחורה. (ב) מספרי נציג של IBCs נוצר בעכברי C3H / חן 6 HPI, n = 10.

איור 4
איור 4: א הקשורים קטטר faecalis UTI. C57BL / 6 עכברים מחוסן עם או בלי צנתרים עם ~ 1 x 10 7 CFU של ה faecalis קולוניזציה שלפוחית ​​השתן בנוכחות או עדר של קטטר. (ב) ה faecalis קולוניזציה קטטר. מבחן Mann-Whitney U שימש לניסויי עכבר, p <0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית. ** P <0.005.

איור S1
S1 איור:. הכנת מחט חיסון UTI תרשים מציג את שלבים הכנת מחט חיסון כוללים חומרים דרושים (1), השחלה של הצנתר למחט (2) וזמירת צינורות לפני החיסון (3).

איור S2
איור S2:. הכנת מחט חיסון CAUTI תרשים מציג חומרי הכנת מחט חיסון דרושים (1), השחלה של קטטר החיסון (2) וקטטר השתלה בלמחט (3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הקהילה מסובכת רכשה UTI הוא זיהום שכיח ויקר והיוו כמה מיליוני ביקורי טיפול ראשוני בכל שנה 46. בנוסף, Cautis הוא זיהום שנרכש בריאות משותפת שהפך יקר מאוד לספקי שירותי בריאות כמרכזים רפואיים Medicaid Services כבר לא משיב לספקי העלות הנוספת של טיפול וכתוצאה מבית החולים רכשו CAUTI 45. המודלים של העכברים של דלקת בדרכי שתן, דלקת שלפוחית ​​השתן הן מסובך וCAUTI, שתוארו בפרוטוקולים אלה מספקים כלים רבות ערך להבנת הבסיס המולקולרי של אינטראקציות המארח והפתוגן הכרחיות לייזום, שמירה, וויסות התוצאה של כמה צורות של דלקת בדרכי שתן. מודלים אלה מאפשרים ליישום של גנטיקה חזקה חיידקים ועכבר, חיסוני, מיקרוסקופי, כלים גנטיים ביוכימיים וכימיים לניתוח של UTI 23,47-49. בנוסף, הפרוטוקולים מתוארים כאן סיפקו פלטפורמהלפיתוח והבדיקה של אסטרטגיות טיפוליות ומניעתי רומן כוללים מעכבים קטנים מולקולה של אלימות חיידקים ומטרות חיסון חדשניות ואסטרטגיות 50-55.

ישנם כמה תנאים קריטיים שחייבות להישמר ליישום המוצלח של מודל דלקת שלפוחית ​​השתן לא מסובך. כמו בכל הליכי הרדמה העכבר, יש להקפיד כדי למנוע תמותת עכבר בשל-הרדמה מעל. בעת הכנת קטטר החיסון, צינורות סיליקון חייבים להיות ארוכים מספיק כדי לכסות את קצה המחט אבל לא כל כך הרבה זמן כמו לפגוע בקיר של שלפוחית ​​השתן בצנתור. בנוסף, בשל הקרבה והגודל של פתח הנרתיק, יש להקפיד להכניס את צנתר inoculating לתוך השופכה ולא הנרתיק. במהלך נתלכסנו שלפוחית ​​השתן לספירת IBC, זה חיוני כי השלפוחיות להיות פרושות במהירות לנתיחה הבאות אפשרית והרקמה להיות קבועות לapproximately שעה 1, אבל לא בין לילה. לIBC ספירה על ידי צביעת LacZ, זה גם הכרחי כי החיידק בשאלה לייצר LacZ במהלך הקולוניזציה תא urothelial. בעת שימוש בזנים שבו אנזים LacZ אינו מיוצר, זה עדיין אפשרי למנות IBCs באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence עם אנטי E. נוגדני coli או חיידקים להביע GFP. תכונה של מודל זה אחד מסוים היא הדפוסים השונים של התקדמות מחלה וחומרה שהוצגה על ידי קווי עכבר מולדת שונים ואת הפוטנציאל פתוגניים השונים של טיפוסי UPEC זני 33,56. הבדלים אלה הם כוח והגבלה של טכניקה זו כפי שהם לשחזר את הווריאציה הטבעית של רגישות מארח וגיוון פתוגן שנצפה במחקרים קליניים ופנוטיפי תוך מסבך עיצוב ופרשנות 57,58 ניסיוניים. וריאציות אלה מספקים מקורות השוואה מאפשרים להבהרה של מארח וmechan חיידקיםהאיזמים ויסות פתוגנזה של דלקת בדרכי שתן לא מסובכים 33,56. עם זאת, הם גם אומר כי, כתוצאה מהמידה השונות של רגישות UTI קו העכבר, זהירות רבה צריכה להילקח בבחירת הקו הנכון העכבר ומתח UPEC לטיפול בשאלה המסוימת חוקר שואל. לדוגמא, עכברי C57BL / 6 הם מודל מצוין של זיהום חריף, עם הצגת titers החיידקים גבוה ומספר גדול של IBCs בנקודתי זמן מוקדמים. זן זה לאחר מכן במהירות פותר את הזיהום בין 3 ו -7 dpi עם הקולוניזציה המתמשכת רק כתוצאה מזיהומים בכליות חמורות ומאגרים תאיים שקטים 33,34. מודל C57BL / 6 יכול לייצג במדויק את התוצאה הנפוצה ביותר לחולי UTI רבים שבהן תסמינים הנוכחיים ולאחר מכן לפתור. לעומת זאת, רקע עכבר C3H / חן מציג רמה גבוהה של רגישות לדלקת שלפוחית ​​השתן כרוני שהופכת אותם למתח אידיאלי ללימוד זיהומים בדרכי שתן חוזר ונשנה. מודלים UTI אחרים כמו כן נקבעובCBA, DBA ורקע עכברי C3H / HeJ מוכיחים שימושיים לחקר היבטים מסוימים של דלקת בדרכי השתן 33,59. החסרון העיקרי הניסיוני הוצג על ידי מודל דלקת שלפוחית ​​השתן לא מסובך הוא קיומה של צווארי בקבוק זיהום מרובים הגבלת היישום של מתודולוגיות בדיקות סקר גנטיות בקנה מידה גדולה על גילוי גורמי חיידקי רומן הכרחיים לדלקת שלפוחית ​​השתן חריף, כרונית וחוזרת 60.

השיקולים הקריטיים למודל דלקת שלפוחית ​​השתן לא מסובך כל חלים על מודל CAUTI מבוסס שתל עם שני חששות נוספים. ראשית, יש להקפיד על מנת להבטיח כי החדרת השתל מתרחשת באופן סטרילי, עקב הרגישות המוגברת לזיהום בשלפוחית ​​השתן שמעניקה את השתל. שנית, זה חיוני כי קטטר יתקיים במקום במהלך הסרת מחט השתלה. המגבלות העיקריות של המודל הן שCAUTI יש לו מגוון ירידה של רקע גנטי מארח זמין, יחסי הציבורopensity לאובדן צנתר לאורך זמן וחוסר היכולת לאסוף שתן בשל תפקוד לקוי של שלפוחית ​​השתן כתוצאה מהשתלה. כדי לפצות על אובדן שתל וחוסר היכולת לפקח על הזיהום באמצעות בדיקת שתן אורך, מודל זה דורש בדרך כלל מספרים גבוהים יותר של עכברי צינתור לנקודות זמן מאוחר יותר וקבוצות של עכברים חייבים להיות מוקרבת בכל נקודת זמן רצויה. המארח המוגבל רקע התוצאות גנטיות מהתדר מונע שבכמה זני עכבר, כגון C3H / חן, לאבד את השתל (פ Guiton, אישי תקשורת 2010). כתוצאה מכך, פרוטוקולי CAUTI שתוארו לעיל יש רק עברו אופטימיזציה בזן עכבר C57BL / 6. עם זאת, בעוד שההגבלה של זני עכבר זמינים עבור CAUTI מצערת, רבות וריאציות הגנומי הוקמו בC57BL / 6 הרקע ומודל CAUTI מרחיב את המגוון בקטריולוגית זמין עבור מחקר בדלקת בדרכי שתן על ידי שינוי סביבת שלפוחית ​​השתן כדי להקל על התישבות על ידי אורגניזמים ש הםאחרת אינם פתוגניים במודל עכברי של UTI. דוגמא לכך, היא הגילוי האחרון של תפקידו של FG פורסם במהלך דלקת קטטר המושרית של שלפוחית ​​השתן בE. צמיחת faecalis, היווצרות biofilm, והתמדה בCAUTI 42. דוגמא זו ממחישה את כוחו של מודל השתל של CAUTI בהבהרת מנגנונים לא רק חיידקים מולקולריים של הפתוגנזה אלא גם את התפקיד של גורמי מארח בזיהום. כל התכונות הללו תורמים להבנת זיהום זה רלוונטי קליני, אשר כבר בעבר understudied.

בנוסף לגישות הניסיוניות שתוארו לעיל, המודלים של העכברים של דלקת שלפוחית ​​השתן וCAUTI מסובכים ניתנים למספר גדול של שינויים מתודולוגיים. במקרה של דלקת שלפוחית ​​השתן לא מסובך מודל, שינויים אלה יכולים לכלול הפחתת חיסון הנפח והכוח ליישם במהלך החדרה של הבידוד כדי לצמצם את מספרם של החיידקיםהוכנס לכליות 61, משתנה משך הזיהום, להקריב בנקודות זמן מוקדם ככל HPI 1 ושימוש במבחני הגנת גנטמיצין כדי להעריך את המידה שבה uropathogen פלש שלפוחית ​​השתן תאי האפיתל 62. שלפוחיות פרושות מעכברים הקריבו בין 6 ל 24 HPI גם יכול להיות מחולקים ומוכתם עם נוגדנים למארח שונים ו / או epitopes חיידקים ונצפו תחת ניאון או confocal להתבונן מבנה IBC, fluxing החיידקים וfilamentation ורקמת מארח מצב 25,33 , 63,64. ההשפעה של זיהום uropathogen ו / או השתלה בתגובות חיסוניות מערכתיות והמקומיות של המארח ניתן להעריך באמצעות מערכת חרוז cytometric Bioplex או מבחני מבוססים ELISA כדי לקבוע את רמות ציטוקינים בשתן או בסרום בהתאמה 33,65. לבסוף, המצב של רקמת שלפוחית ​​השתן, מיקום ומורפולוגיה של חיידקי מיישבים והמבנה של biofilm שהופקד עלהצנתר ניתן להעריך על ידי שיטות הדמיה שונות, כוללים מיקרוסקופ אלקטרונים 25,41.

דגמים בסיסיים אלה של זיהום יכולים גם להיות מותאמים לחקות תופעות קליניות רלוונטיות אחרות, כוללים דלקת בדרכי שתן חוזר והפיתוח של תגובה חיסונית אדפטיבית באמצעות זיהומים מרובים. בהקשר זה, חזר זיהום של C57BL / 6 תוצאות עכברים בהתנגדות מוגברת לדלקת שלפוחית ​​השתן חריפה ואילו במודל C3H / חן, הפיתוח המוקדם של דלקת שלפוחית ​​השתן כרונית ואחרי אישור של הזיהום באמצעות אנטיביוטיקת הממשל של sensitizes עכברים אלה לפתח דלקת שלפוחית ​​השתן כרונית על חיסונים שלאחר מכן 66. בנוסף המנגנונים המולקולריים של גורמי סיכון להתפתחות של דלקת בדרכי שתן יכולים להיבחן. סוכרת והשמנת יתר יש גם הוכחו להגדיל את התדירות וחומרה של זיהומים בדרכי שתן. סוכרת מסוג 2 יכול להיות מודל גנטי בעכברים ברקע FVB / ניו ג'רזי ומודל מושרה כימי של סוכרת מהסוג 1 יש already הוכח להגדיל את חומרת הזיהומים בדרכי השתן נגרמת על ידי שני UPEC וק pneumophila 67,68.

לבסוף, מערכות מודל אלה מייצגים קרקע להוכיח אידיאלית לפיתוח וייעול השיטות הטיפוליות שמטרתה טיפול או מניעת זיהומים בדרכי השתן וCautis. ההבנה המולקולרית של אינטראקציות הפתוגן מארח מסופקות על ידי המודלים האלה כבר אפשרה הפיתוח של אסטרטגיות חיסון יעילות במטרה מיקוד ארסיות חשובה גורמים 51-55. בנוסף, מעכבי מולקולה קטנים של הידבקות UPEC הוכחו כיעיל בטיפול בזיהומים בדרכי שתן אקוטי וכרוניות לא מסובכים כמו גם Cautis נגרמים על ידי UPEC 12,69,70. שני דגמי UTI וCAUTI מסובכים המתוארים בפרוטוקולים אלה מספקים כלים הניסיוניים לנתח את הפרטים המולקולריים של אינטראקציות מארח הפתוגן בדרכי השתן. ניתן למנף כלים אלה בדרכים רבות להרחבת understandinגרם של מערכת מורכבת זו של תנאים ולהקל על הפיתוח של התערבויות טיפוליות יעילות יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

מימון עבור עבודה זו סופק על ידי DK064540 P50 ORWH SCOR, RO1 DK 051,406, RO1 AI 108,749-01, F32 DK 101,171, וF32 DK 104,516-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles BD Precision Glide 305106 30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing BD 427400 Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing Braintree Scientific, Inc SIL 025 inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia Butler Schein 29405 250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar Kimble Chase 5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser Schefs-Amazon Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls Fisherbrand 22-456-880
50 ml Falcon tubes VWR 89039-660
Isotec 3 -vaporizer Ohmeda 1224478
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201 (when necessary)
Betadine solution Betadine solution 10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips Fisher Scientific 22-037-924 6 inches
Diapers for bench Fisherbrand 14206 63 Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant Surgilube 0281-0205-36
Dissecting scissor Fine Science tools, INC 14084-08
Micro-Adson Forceps Fine Science tools, INC 11018-12
1 ml syringe BD 309659 Tuberculin slip tip
Parafilm Bemis PM996 4 inches x 125 FT
Eppendorf rack Fisherbrand 05-541-1
Eppendorf tubes MIDSCI AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer PRO Scientific INC Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube BD 352063 for organ homogenization
Paper towel Georgia-Pacific
Ethanol Pharmco-AAPER 11100020S 200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates Corning 3788
1x Phosphate sodium saline Sigma-Aldrich P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210 Branson Ultrasonics Corporation 1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate Techno Plastic Products 92006
Pins Fine Science Tools 26002-20
Sylgard 184 Dow Corning 3097358-1004 Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) Invitrogen 15520-034 Ultrapure
N, N-Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
MgCl2 (Magnesium chloride) Sigma Aldrich M8266
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750
Nonidet-P40 Roche 11754599001 Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide) Sigma Aldrich P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide) Sigma Aldrich 60299

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Dis Mon. 49, 53-70 (2003).
  2. Foxman, B., et al. Risk factors for second urinary tract infection among college women. American journal of epidemiology. 151, 1194-1205 (2000).
  3. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Increasing antimicrobial resistance and the management of uncomplicated community-acquired urinary tract infections. Annals of internal medicine. 135, 41-50 (2001).
  4. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Isolation of fluoroquinolone-resistant rectal Escherichia coli. after treatment of acute uncomplicated cystitis. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 56, 243-246 (2005).
  5. Gupta, K., Sahm, D. F., Mayfield, D., Stamm, W. E. Antimicrobial resistance among uropathogens that cause community-acquired urinary tract infections in women: a nationwide analysis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 89-94 (2001).
  6. Gupta, K., Scholes, D., Stamm, W. E. Increasing prevalence of antimicrobial resistance among uropathogens causing acute uncomplicated cystitis in women. Jama. 281, 736-738 (1999).
  7. Jarvis, W. R. Selected aspects of the socioeconomic impact of nosocomial infections: morbidity, mortality, cost, and prevention. Infect Control Hosp Epidemiol. 17, 552-557 (1996).
  8. Lo, E., et al. Strategies to prevent catheter-associated urinary tract infections in acute care hospitals: 2014 update. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America. 35, 464-479 (2014).
  9. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature reviews Urology. 7, 653-660 (2010).
  10. Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11, 551-581 (1997).
  11. Hannan, T. J., et al. LeuX tRNA-dependent and -independent mechanisms of Escherichia coli. pathogenesis in acute cystitis. Molecular microbiology. 67, 116-128 (2008).
  12. Cusumano, C. K., Hung, C. S., Chen, S. L., Hultgren, S. J. Virulence plasmid harbored by uropathogenic Escherichia coli. functions in acute stages of pathogenesis. Infection and immunity. 78, 1457-1467 (2010).
  13. Dhakal, B. K., Mulvey, M. A. The UPEC pore-forming toxin alpha-hemolysin triggers proteolysis of host proteins to disrupt cell adhesion, inflammatory, and survival pathways. Cell host & microbe. 11, 58-69 (2012).
  14. Garcia, E. C., Brumbaugh, A. R., Mobley, H. L. Redundancy and specificity of Escherichia coli. iron acquisition systems during urinary tract infection. Infection and immunity. 79, 1225-1235 (2011).
  15. Bergsten, G., Wullt, B., Svanborg, C. Escherichia coli., fimbriae, bacterial persistence and host response induction in the human urinary tract. International journal of medical microbiology : IJMM. 295, 487-502 (2005).
  16. Zhou, G., et al. Uroplakin Ia is the urothelial receptor for uropathogenic Escherichia coli.: evidence from in vitro FimH binding. J Cell Sci. 114, 4095-4103 (2001).
  17. Eto, D. S., Jones, T. A., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Integrin-mediated host cell invasion by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 3, e100 (2007).
  18. Taganna, J., de Boer, A. R., Wuhrer, M., Bouckaert, J. Glycosylation changes as important factors for the susceptibility to urinary tract infection. Biochemical Society transactions. 39, 349-354 (2011).
  19. Mulvey, M. A., et al. Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science. 282, 1494-1497 (1998).
  20. Mysorekar, I. U., Mulvey, M. A., Hultgren, S. J., Gordon, J. I. Molecular regulation of urothelial renewal and host defenses during infection with uropathogenic Escherichia coli. The Journal of biological chemistry. 277, 7412-7419 (2002).
  21. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  22. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli. from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and immunity. 75, 52-60 (2007).
  23. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 1333-1338 (2004).
  24. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae. urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and immunity. 76, 3337-3345 (2008).
  25. Anderson, G. G., et al. Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections. Science. 301, 105-107 (2003).
  26. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli. recurrent urinary tract infections. Pathogens and disease. 68, 78-81 (2013).
  27. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4, e329 (2007).
  28. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PloS one. 8, e83637 (2013).
  29. Hopkins, W. J., Uehling, D. T., Wargowski, D. S. Evaluation of a familial predisposition to recurrent urinary tract infections in women. American Journal of Medical Genetics. 83, 422-424 (1999).
  30. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli. urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and immunity. 66, 2798-2802 (1998).
  31. Mabeck, C. E. Treatment of uncomplicated urinary tract infection in non-pregnant women. Postgraduate medical journal. 48, 69-75 (1972).
  32. Ferry, S., Holm, S., Stenlund, H., Lundholm, R., Monsen, T. The natural course of uncomplicated lower urinary tract infection in women illustrated by a randomized placebo controlled study. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 36, 296-301 (2004).
  33. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli. predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathog. 6, (2010).
  34. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. persistence and eradication from the urinary tract. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 14170-14175 (2006).
  35. Glahn, B. E., Braendstrup, O., Olesen, H. P. Influence of drainage conditions on mucosal bladder damage by indwelling catheters. II. Histological study. Scandinavian journal of urology and nephrology. 22, 93-99 (1988).
  36. Goble, N. M., Clarke, T., Hammonds, J. C. Histological changes in the urinary bladder secondary to urethral catheterisation. British journal of urology. 63, 354-357 (1989).
  37. Ronald, A. The etiology of urinary tract infection: traditional and emerging pathogens. Dis Mon. 49, 71-82 (2003).
  38. Arias, C. A., Murray, B. E. The rise of the Enterococcus.: beyond vancomycin resistance. Nature reviews. Microbiology. 10, 266-278 (2012).
  39. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. The New England journal of medicine. 291, 215-219 (1974).
  40. Warren, J. W. Catheter-associated urinary tract infections. Infect Dis Clin North Am. 11, 609-622 (1997).
  41. Guiton, P. S., Hung, C. S., Hancock, L., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcal biofilm formation and virulence in an optimized murine model of foreign body-associated urinary tract infections. Infection and immunity. 78, 4166-4175 (2010).
  42. Flores-Mireles, A. L., Pinkner, J. S., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. EbpA vaccine antibodies block binding of Enterococcus faecalis. to fibrinogen to prevent catheter-associated bladder infection in mice. Science translational medicine. 6, 254ra127 (2014).
  43. Martinez, J. J., Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Pinkner, J. S., Hultgren, S. J. Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells. The EMBO Journal. 19, 2803-2812 (2000).
  44. Hultgren, S. J., Schwan, W. R., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Regulation of production of type 1 pili among urinary tract isolates of Escherichia coli. Infection and immunity. 54, 613-620 (1986).
  45. Chenoweth, C. E., Gould, C. V., Saint, S. Diagnosis, Management, and Prevention of Catheter-Associated Urinary Tract Infections. Infect. Dis. Clin. North Am. 28, 105-+ (2014).
  46. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7, 653-660 (2002).
  47. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (1988).
  48. Song, J., et al. TLR4-mediated expulsion of bacteria from infected bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14966-14971 (2009).
  49. Wang, H., Min, G., Glockshuber, R., Sun, T., Kong, X. P. Uropathogenic E. coli. adhesin-induced host cell receptor conformational changes: implications in transmembrane signaling transduction. Journal of molecular biology. 392, 352-361 (2009).
  50. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science translational medicine. 3, 109-115 (2011).
  51. Langermann, S., Ballou, W. R. Vaccination utilizing the FimCH complex as a strategy to prevent Escherichia coli. urinary tract infections. J Infect Dis. 183, S84-S86 (2001).
  52. Langermann, S., et al. Vaccination with FimH adhesin protects cynomolgus monkeys from colonization and infection by uropathogenic Escherichia coli. J Infect Dis. 181, 774-778 (2000).
  53. Langermann, S., et al. Prevention of mucosal Escherichia coli. infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination. Science. 276, 607-611 (1997).
  54. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. Plos Pathogens. 5, (2009).
  55. Russo, T. A., et al. The siderophore receptor IroN of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. is a potential vaccine candidate. Infect. Immun. 71, 7164-7169 (2003).
  56. Schwartz, D. J., et al. Positively selected FimH residues enhance virulence during urinary tract infection by altering FimH conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15530-15537 (2013).
  57. Czaja, C. A., et al. Prospective cohort study of microbial and inflammatory events immediately preceding Escherichia coli. recurrent urinary tract infection in women. J Infect Dis. 200, 528-536 (2009).
  58. Chen, S. L., et al. Genomic Diversity and Fitness of E. coli. Strains Recovered from the Intestinal and Urinary Tracts of Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Science Translational Medicine. 5, 2013 (2013).
  59. Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli. through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 166, 1148-1155 (2001).
  60. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  61. Chan, C. Y., St John,, L, A., Abraham, S. N. Mast Cell Interleukin-10 Drives Localized Tolerance in Chronic Bladder Infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  62. Justice, S. S., Lauer, S. R., Hultgren, S. J., Hunstad, D. A. Maturation of intracellular Escherichia coli. communities requires SurA. Infect. Immun. 74, 4793-4800 (2006).
  63. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19884-19889 (2006).
  64. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1333-1338 (2004).
  65. Guiton, P. S., Hannan, T. J., Ford, B., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcus faecalis. Overcomes Foreign Body-Mediated Inflammation To Establish Urinary Tract Infections. Infect. Immun. 81, 329-339 (2013).
  66. Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. Journal of Immunology. 176, 3080-3086 (2006).
  67. Rosen, D. A., Hung, C. -S., Kline, K. A., Hultgren, S. J. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect. Immun. 76, 4290-4298 (2008).
  68. Daneshgari, F., Leiter, E. H., Liu, G., Reeder, J. Animal Models of Diabetic Uropathy. Journal of Urology. 182, S8-S13 (2009).
  69. Guiton, P. S., et al. Combinatorial Small-Molecule Therapy Prevents Uropathogenic Escherichia coli. Catheter-Associated Urinary Tract Infections in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56, 4738-4745 (2012).
  70. Totsika, M., et al. A FimH Inhibitor Prevents Acute Bladder Infection and Treats Chronic Cystitis Caused by Multidrug-Resistant Uropathogenic Escherichia coli. ST131. Journal of Infectious Diseases. 208, 921-928 (2013).

Tags

רפואה גיליון 100, UPEC, Uropathogenic קטטר דלקת בדרכי שתן IBC דלקת שלפוחית ​​השתן כרונית

Erratum

Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 08/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.
ההקמה ואפיון של UTI וCAUTI במודל עכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conover, M. S., Flores-Mireles, A.… More

Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (100), e52892, doi:10.3791/52892 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter