Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Istituzione e caratterizzazione di UTI e CAUTI in un modello murino

Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52892
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Abstract

Infezioni del tratto urinario (UTI) sono altamente prevalenti, una causa importante di morbilità e sono sempre più resistenti al trattamento con antibiotici. Le femmine sono sproporzionatamente afflitti da UTI: il 50% di tutte le donne avranno un UTI nella vita. Inoltre, il 20-40% di queste donne che hanno un primo UTI subirà una ricorrenza con qualche sofferenza recidive frequenti con un grave deterioramento della qualità della vita, il dolore e il disagio, interruzione delle attività quotidiane, l'aumento dei costi sanitari, e poche opzioni di trattamento diverso di profilassi antibiotica a lungo termine. Uropatogeni Escherichia coli (UPEC) è l'agente eziologico principale di acquisita in comunità UTI. Catetere-associata UTI (CAUTI) è la più comune infezione acquisita in ospedale pari a un milione di eventi negli Stati Uniti ogni anno e costi sanitari drammatici. Mentre UPEC è anche la causa primaria di CAUTI, altri agenti causali sono di maggiore importanza tra cui Enterococcusfaecalis. Qui utilizziamo due modelli murini consolidate che ricapitolano molte delle caratteristiche cliniche di queste malattie umane. Per UTI, un modello C3H / nubilato ricapitola molte delle caratteristiche di virulenza UPEC osservati negli esseri umani, tra cui le risposte di accoglienza, formazione e IBC filamentazione. Per CAUTI, un modello con topi C57BL / 6, che mantengono gli impianti vescica catetere, ha dimostrato di essere sensibili a E. faecalis infezione della vescica. Questi modelli rappresentativi vengono utilizzati per ottenere sorprendenti nuove informazioni sulla patogenesi della malattia UTI, che sta portando allo sviluppo di nuove terapie e strategie di gestione e di prevenzione.

Introduction

Infezioni del tratto urinario (UTI) sono una delle più comuni infezioni batteriche e possono essere suddivisi in due categorie a seconda del meccanismo di acquisizione, comunità e nosocomiali acquisita UTI. IVU si verificano spesso nelle donne e negli studi altrimenti sane acquisita in comunità hanno dimostrato che circa il 50% delle donne avranno almeno un UTI nella vita 1. Inoltre, la recidiva è un grave problema. Una donna che ha una infezione acuta iniziale ha una probabilità del 25-40% di avere una seconda infezione entro sei mesi, nonostante adeguato trattamento antibiotico e molte donne continuano ad avere recidive frequenti 2. I batteri che causano queste infezioni stanno diventando resistenti ulteriori protocolli terapeutici sempre più confondenti antibiotico 3-6. UTI colpiscono milioni di persone ogni anno costano circa 2,5 miliardi di dollari di spese relative di assistenza sanitaria negli Stati Uniti, sottolineando l'impatto e prevalenza della malattia1,7 .Nosocomial acquisito IVU sono associati principalmente con la presenza di corpi estranei, quali cateteri. Catetere-associate infezioni del tratto urinario (CAUTI) rimangono il nosocomiale più comune acquisito UTI, pari al ~ 70-80% di tali infezioni 8. Inoltre, CAUTI è associata ad un aumento della morbilità e della mortalità ed è la causa più comune delle infezioni del sangue secondarie 9.

UPEC comunità associata acquisita IVU sono pensato per essere causato dall'introduzione di batteri nella vescica da giacimenti nel tratto gastrointestinale attraverso la manipolazione meccanica durante il rapporto sessuale, scarsa igiene o di altri dinamica delle popolazioni microbiche tra host differenti nicchie 10. Una volta dentro la vescica, UPEC impiegano numerosi fattori di virulenza, tra cui capsule, sistemi di acquisizione di ferro, le tossine, un plasmide di virulenza, tRNA, isole di patogenicità e fattori di colonizzazione che hanno dimostrato di avere un ruolo nella patogenesi <sup> 11-14. Fondamentale per la creazione di colonizzazione UPEC, UPEC codificare anche più tipi di chaperone adesivo usciere pathway (CUP) pili che riconoscono i recettori con specificità stereochimica 15. Tipo 1 pili, rovesciato con l'adesina FimH, sono espressi da UPEC e BIND uroplakins 16 e α-1, β-3 integrine 17, che si esprimono sulla superficie luminale di entrambe le vesciche umane e di topo 18 mannosylated. Queste interazioni FimH mediata facilitano la colonizzazione batterica e l'invasione delle cellule epiteliali superficiali 19,20. Una volta all'interno della cellula, UPEC può sfuggire nel citoplasma dove un singolo batterio può rapidamente dividere per formare una comunità batterica intracellulare (IBC), che A maturazione, può contenere circa 10 4 21 batteri. Formazione IBC è stata dimostrata in almeno sei diversi ceppi di topi, C3H / nubilato, C3H / HeJ, C57Bl / 6, CBA, FVB / NJ e BALB / c, e con una grande varietà di differenti UPECeppi C e altri enterobatteri 22-24. Tuttavia le differenze temporali e spaziali della formazione IBC può variare a seconda del fondo mouse e il ceppo infettante UPEC. In topi C3H / HeN infettati con il prototipo UPEC ceppi UTI89 o formazione CFT073, IBC possono essere visualizzati come piccoli biomasse di batteri già il 3 HPI (infezione post hr). Questa comunità continua ad espandersi e raggiunge un "punto medio" di sviluppo circa 6 hpi quando i batteri astiformi occupano una grande percentuale di spazio citoplasmatica di cellule superficiali ombrello terminalmente differenziate Questi prima forma GIR in maniera relativamente sincrono con la maggioranza visualizzazione dimensioni simili e morfologie. ~ 8 hpi i batteri nel cambiamento IBC da un bacilli a Cocci morfologia. IBC sono di natura transitoria. Così, IBC maturazione 12-18 risultati HPI in continua espansione della popolazione batterica, seguito dal loro filamentazione e dispersione dal wi cellulareth successiva diffusione di cellule vicine 23. Così, la nicchia IBC consente per la crescita batterica rapida in un ambiente protetto dalle risposta immunitaria e antibiotici 25. Le fasi distinte di infezione UPEC che si vedono nei topi si osservano anche negli esseri umani, come i GIR ei filamentazione, sostenendo il modello murino di UTI come uno strumento utile che può essere utilizzato per modellare UTI nell'uomo 22,26-28.

Mentre la maggioranza delle donne sperimenta un UTI nella vita, l'esito di queste infezioni può variare da infezione autolimitante acuta senza recidiva, a frequentare cistiti ricorrenti. Inoltre, gli studi hanno dimostrato una forte presenza familiare di UTI, il che suggerisce una componente genetica contribuisce alla UTI suscettibilità 29. Abbiamo scoperto che i diversi risultati UTI visto in cliniche possano essere riprese dai risultati diversi di infezione sperimentale UPEC tra ceppi di topi inbred 30. Ad esempio, C3H / nubilato, CBA, Topi DBA e C3H / HeOuJ sono suscettibili, in maniera dose-dipendente infettiva, a lunga durata, cistite cronica caratterizzata da persistente, batteri alto titolo (> 10 4 unità formanti colonie (CFU) / ml), alto titolo batteriche oneri vescica al sacrificio> 4 settimane dopo l'infezione (WPI), infiammazione cronica, e necrosi uroteliale. Questi topi mostrano anche elevati livelli sierici di IL-6, G-CSF, KC, e IL-5 entro il primo 24 HPI che servono come biomarcatori per lo sviluppo di cistite cronica. Questo può rappresentare accuratamente il corso naturale della UTI in alcune donne, come gli studi placebo hanno dimostrato che una grande percentuale di donne che subiscono UTI manterrà livelli elevati di batteri nelle urine per diverse settimane dopo i primi sintomi della cistite se non somministrato il trattamento antibiotico 31 , 32. Inoltre, utilizzando topi C3H / nubilato, abbiamo scoperto che una storia di cistite cronica è un fattore di rischio significativo per le successive gravi infezioni ricorrenti. Ricorrente UTI è la più significant manifestazione clinica della UTI e il topo C3H / nubilato è attualmente il modello studiato solo che riassume una maggiore predisposizione dopo l'esposizione precedente. Un altro risultato UTI è ricapitolato in C57Bl / 6 topi in cui l'infezione acuta UPEC è autolimitante, con una risoluzione di infiammazione della vescica e batteriuria entro circa una settimana. È interessante notare che, in questo modello, UPEC facilmente formare riserve intracellulari di riposo all'interno del tessuto della vescica da cui UPEC sono capaci di emergere da uno stato inattivo a ricominciare una UTI attivo, potenzialmente spiegare uno dei meccanismi per lo stesso ceppo UTI ricorrente negli esseri umani 33, 34.

Oltre alle influenze genetiche sulla UTI suscettibilità, introduzione di un catetere in vescica aumenta notevolmente la probabilità di avere un'infezione nonché aumentare la gamma di batteri in grado di causare un'infezione. È stato dimostrato che la cateterizzazione urinaria umana provoca istologico ecambiamenti immunologici nella vescica a causa di stress meccanico che si traduce in una risposta infiammatoria robusto, esfoliazione, edema della lamina propria e submucusa, assottigliamento uroteliale, e mucosa lesioni dell'urotelio e rene 35,36. Inoltre, il catetere fornisce una superficie di attacco batterico creando così un ambiente utilizzato da diverse specie di causare CAUTI. Mentre UPEC sono ancora una delle principali cause, Enterococcus faecalis rappresenta il 15% di questi CAUTI 37. E. faecalis sta diventando sempre più resistenti agli antibiotici con vancomicina resistenza emersione, che presentano un grave problema per la salute 38. E. faecalis possiedono numerosi fattori di virulenza tra cui tossine e adesine necessari per il fissaggio sia per il catetere e epitelio 38. Durante cateterizzazione urinaria, l'host è vulnerabile a microbica adesione, moltiplicazione e diffusione del 39,40 tratto urinario. E. faecalis forma un biofilm sul catetere come parte di un meccanismo a persistere nella vescica e diffondere ai reni, che viene riprodotto in un modello di topo CAUTI 41. Recentemente, è stato dimostrato durante cateterizzazione urinaria, fibrinogeno (Fg) viene rilasciato nella vescica come parte della risposta infiammatoria. Fg accumula nella vescica, ricopre il catetere ed è essenziale per E. faecalis formazione di biofilm, funzionando come un ponteggio allegato. In un modello C57BL / 6 del mouse di CAUTI, abbiamo scoperto che E. formazione di biofilm faecalis sul catetere, e quindi la persistenza nella vescica, era dipendente dalla pilus Ebp, in particolare la sua EBPA punta adesina. Abbiamo trovato che il dominio N-terminale di EBPA lega specificamente a FG rivestimento del catetere. Inoltre, si è riscontrato che E. faecalis utilizza Fg come fonte metabolita durante l'infezione, rafforzando in tal modo la formazione di biofilm 42.

Modelli murini hanno dimostrato fondamentale per underdagiato nonché prevedere manifestazioni cliniche di UTI e CAUTI 41. In questo articolo abbiamo dimostrato la preparazione inoculo della cistite UPEC isolare UTI89 e inoculazione transuretrale di topi C3H / celibato. Inoltre, dimostriamo un protocollo per l'inserimento del catetere in topi C57BL / 6 e inoculazione del E. ceppo faecalis OG1RF. Entrambe queste tecniche portano a UTI coerente e affidabile o CAUTI nei topi. Mostriamo anche le tecniche utilizzate per osservare la formazione di IBC durante cistite acuta e raccolta delle urine per l'analisi di cistite cronica o ricorrente. Topi C3H / nubilato sono stati utilizzati per studiare gli aspetti della UPEC patogenesi tra cui l'invasione iniziale batterica, la formazione di IBC, filamentazione e lo sviluppo di cistite cronica 23,33,43. Questi parametri di virulenza sono stati studiati anche in una varietà di altri ambiti del mouse 22,33. Per CAUTI, il / 6 modello C57BL permette per l'impianto di corpi estranei nella vescica con conseguente co battericalonization, che può essere mantenuta per 7 giorni dopo l'infezione 41. Questi modelli sono stati utili per valutare i meccanismi di virulenza batterica, le risposte di accoglienza per UTI e meccanismi per sovvertire risposta dell'ospite, gran parte del quale è stato successivamente ricapitolato o osservati nella popolazione umana clinici.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Affermazione Etica: Il Comitato Washington University Animal Studies approvato tutte le infezioni del mouse e procedure nell'ambito del numero di protocollo 20120216, che è stato approvato 2013/01/11 e 2016/01/11 scade. Cura generale degli animali era in linea con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio da parte del Consiglio Nazionale delle Ricerche e la cura Resource Guide USDA animale. Eutanasia procedure sono in linea con le "linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali edizione 2013".

1. UPEC UTI protocollo, inoculazione Ago Preparazione (Figura S1)

  1. Togliere il tappo del G 30 ago. Infilare circa 1 pollice di tubo PE10 sull'albero dell'ago. UV sterilizzare i gruppi di aghi durante la notte. Aghi cateterizzati possono essere conservati a tempo indeterminato in piastre Petri sterili.

2. UPEC batterica Inoculum Preparazione

  1. Preparare UTI89 inoculo (inizio 72 ore prima della inoculizione giorno)
    1. Streak UTI89 su un LB (Luria-Bertani) piastra di agar da uno stock congelato. Incubare per una notte a 37 ° C. Scegliere una colonia e inoculare in 10 ml di LB in un pallone da 125 ml. Incubare a 37 ° C per 24 ore, in modo statico.
    2. Seminare 10 ml di coltura durante la notte in 10 ml di LB in un pallone nuovo 125 ml per altre 24 ore a 37 ° C, in modo statico.
    3. Trasferimento 3 ml (variano in base alla tensione e alle dimensioni inoculo desiderato) per sterili provette da 1,5 ml e centrifugare a 7.000 xg per 3 min e risospendere il pellet in 1x PBS e centrifugare una seconda volta. Risospendere il pellet batterico in 1 ml di PBS 1x.
  2. Misurare la densità ottica batterica e regolare la concentrazione alla densità inoculo desiderato. La concentrazione standard dell'inoculo utilizzato è 10 7 batteri; Tuttavia, questo può variare a causa del disegno dello studio.

3. batterica Inoculazione

  1. Pulire la stazione di lavoro con il 70% di etanolo e csu area con carta assorbente (o usare cappa a flusso sterile).
  2. Disegna fino a 0,9 ml di inoculo batterico preparato in un 1 ml (TB) siringa (rimuovere le bolle d'aria). Collegare un ago sterile inoculazione preparata con tubi PE10, sulla siringa contenente l'inoculo, quindi sterilmente tagliare il tubo in polietilene.
    NOTA: Lasciare 1 mm tubo sopra la punta dell'ago per evitare la puntura della vescica.
  3. Tagliare un pezzo quadrato 1 pollice di parafilm e mettere una piccola quantità di lubrificante chirurgica (circa le dimensioni di una monetina) sulla parte superiore.
  4. Anestetizzare femminile topi C3H / nubilato mettendoli in un vaso di vetro 32 once contenente una sfera di tè-infusore con batuffoli di cotone imbevuti di 3 ml di isoflurano o camera vaporizzatore (segue produce protocollo) fino incosciente ma ancora respirando normalmente (1 respiro / sec) .
    NOTA: Alcuni comitati IACUC non approvano l'uso di un vaso o vaporizzatore. Si prega di seguire le indicazioni del comitato IACUC della vostra istituzione.
    NOTA: Se vaso di vetrocon tè-ball e / o di cono con batuffoli di cotone vengono utilizzate isoflurano-soakd, l'animale deve essere osservato con attenzione per evitare overdose di anestetico e la morte. Il vantaggio di utilizzare una camera di vaporizzatore e anestesia è che fornisce somministrazione isoflurano controllato che evita overdose accidentale. ATTENZIONE: Isoflurano è un anestetico per inalazione. Utilizzare in un ambiente ben ventilato e ridurre al minimo l'inalazione.
  5. Rimuovere il mouse dal vaso / vaporizzatore e posizionarlo sul dorso su un tovagliolo di carta e diffondere le gambe.
  6. Coprire il naso del mouse con un cono (un tubo collegato al vaporizzatore che fornisce una dose controllata isoflurance che è dotato su alcune unità vaporizzatore) o 50 ml tubo conico con un batuffolo di cotone contenente una piccola quantità (circa 1-2 ml ) di isoflurano.
  7. Palpitate delicatamente la vescica per indurre la minzione e garantire una vescica annullata. Pulire la zona periuretrale con il 100% di etanolo pulire. Tamponare l'inoculazione ago / siringa, primo punto, nelLubrificante chirurgico.
  8. Inoculare ciascuna mouse con 50 microlitri della soluzione batteri inserendo l'ago inoculazione transurethrally, di circa 12 mm, e premendo sullo stantuffo della siringa delicatamente per dispensare l'inoculo in vescica delicatamente (10 ml / sec). Rimuovere l'ago inoculazione dal mouse.
    NOTA: il ritorno immediato di inoculo in apertura uretrale quando si inizia per inoculare indica l'inserimento improprio o incompleta dell'ago.
  9. Rimuovere il mouse dal cono e tornare alla sua gabbia. Ripetere i passaggi 3,3-3,8 per ogni mouse. Quando / se il passaggio di inoculo condizioni / ceppi, gettare la siringa e l'ago inoculazione in un apposito contenitore approvato e ricominciare punto 3.2.
    NOTA: inoculazione di organismi uropatogeni generalmente non causa gravi sintomi di dolore. Tuttavia, in rari casi, la somministrazione di forti dosi di agenti patogeni può causare febbre, riduzione di cibo e acqua e l'assunzione di un comportamento anomalo. LaNimal salute deve essere monitorato durante tutto l'esperimento. Se i sintomi di dolore sono evidenti preavviso, un analgesico, come la buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg per via sottocutanea), può essere applicato. Le procedure dovrebbero essere in accordo con IACUC di ciascuna istituzione.

4. Determinazione degli oneri batteriche

  1. Preparare separati 5 ml provette per ogni coppia vescica e reni per essere raccolto. Aggiungere 1 ml di PBS 1x / tubo / mouse vescica per essere raccolte. Aggiungere 0,8 ml di PBS 1x / tubo / coppia di reni del mouse per essere raccolto. Etichettare ogni provetta corrispondere ad un determinato mouse. Preparare una piastra a 96 pozzetti contenenti 180 ml di PBS 1x in ogni pozzetto per 01:10 diluizioni seriali.
  2. Pulire l'area di lavoro con il 70% di etanolo e coprire l'area con una copertura o tovagliolo di carta assorbente.
  3. Anestetizzare il mouse con isoflurano (vedi punto 3.4) fino a quando il mouse smette di respirare per circa 1 minuto, poi posizionarlo sul coperchio o tovagliolo di carta assorbente. Altri metodi di euthanaSia sono accettati anche da comitati IACUC, come l'anidride carbonica, e può essere sostituito in caso di sovradosaggio isoflurano.
  4. Sacrificare il mouse rapida dislocazione cervicale che consiste di immobilizzare la collo alla base della testa e tirando la coda distanza orizzontale dal corpo finché non si verifica dislocazione.
    NOTA: La maggior parte dei comitati IACUC richiedono un mezzo secondario di eutanasia e dislocazione cervicale è un metodo comune. Tuttavia, altri metodi possono essere utilizzati, se approvato dal comitato IACUC.
  5. Posizionare il mouse guasto sul dorso e spruzzare 70% di etanolo sull'addome. Sezionare il mouse, raccogliere la vescica e reni, in questo ordine per minimizzare la contaminazione potenziale dal sangue dopo la dissezione rene. Posizionare gli organi in modo indipendente nei preparati da 5 ml provette contenenti 1x PBS (vedi punto 4.1).
    NOTA: utilizzare forbici diverse per la dissezione esterna e per il prelievo di organi per ridurre al minimo la contaminazione.
  6. Toccare il tubo per assicurare gli organi sono in tegli 1x PBS. Ripetere il passaggio 4,3-4,5 per ogni mouse. Forbici pulite e pinze in etanolo al 70% dopo ogni mouse.

5. batterica Recovery

  1. Omogeneizzare vescica raccolti e reni nelle provette da 5 ml con un omogeneizzatore tessuto, 15 sec per rene e 30 sec per la vescica. Sciacquare omogeneizzatore sequenzialmente in 1x PBS, il 70% di etanolo e 1x PBS tra i campioni.
  2. Fai seriali diluizioni 1:10 out a 10 -8 e piastra ogni diluizione per UFC (unità formanti colonie) su piastre di agar LB. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte e contare le colonie il giorno successivo.

6. IBC Enumeration

  1. Asetticamente rimuovere la vescica e posizionarlo in 1x PBS in una piastra da 6 pozzetti con fondo silicone. Le piastre possono essere preparati utilizzando un kit di elastomero di silicone e versando circa 1 cm di silicone in ogni pozzetto, vedere produce istruzioni. Tagliare la vescica a metà con le forbici.
  2. Utilizzando piccoli perni metallici splay delicatamente la fogliader modo che il lume della vescica è rivolto verso l'alto. Assicurarsi di posizionare i perni sui bordi più esterni delle sezioni vescica per garantire la quantità massima di dell'urotelio è esposto.
  3. Dopo strombatura, lavare delicatamente la vescica una volta con PBS 1x. Rimuovere la PBS 1x per pipetta. Fissare la vescica aggiungendo abbastanza 3% paraformaldeide per coprire l'intera vescica strombato. ATTENZIONE: Paraformaldeide è cancerogeno. Attrezzatura protettiva adatta, compresi i guanti, deve essere indossato in ogni momento. I rifiuti devono seguire le linee guida istituzionali.
  4. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Rimuovere la soluzione paraformaldeide. Lavare una volta con PBS 1x.
  5. Lavare con soluzione di lavaggio LacZ (2 mM MgCl 2, 0,01% sodio desossicolato e 0,02% Nonidet-p40in 1x PBS) tre volte per 5 minuti a lavaggio.
  6. Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere abbastanza macchia LacZ (9,5 ml di soluzione di lavaggio LacZ, 0,4 ml di 25 mg / ml di X-gal e 0,1 ml di 100 mM K-ferrocianuro / K-ferricianuro) per coprire le vesciche. Incubare a 30 ° C overniGHT al riparo dalla luce.
  7. Rimuovere vesciche strombate da incubatore e osservare IBC, che appaiono come blu puncta come visualizzato con un ambito dissezione, 40-60X ingrandimento.
    NOTA: A volte un mouse può urinare prima del posizionamento del tubo sotto l'uretra. In questo caso, attendere 15-20 minuti prima di tentare di raccogliere di nuovo le urine.

7. raccolta di urine per batteriuria CFU Enumeration (non applicabile per CAUTI)

  1. Per la raccolta delle urine pre o post infezione frenare dolcemente il mouse tenendo la coda e collocata su una superficie elevata piatta (parte superiore della gabbia del mouse).
  2. Tenere una provetta sterile da 1,5 ml sotto l'uretra mouse. Premere delicatamente verso il basso sul retro del mouse vicino alla coda per esercitare una pressione alla vescica. Cattura l'urina nella provetta da 1,5 ml.
  3. Fai seriali diluizioni 1:10 out a 10 -7 e piastra ogni diluizione adeguati LB. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte e contare le colonie il giorno successivo.

8. CAUTI modello di protocollo, catetere Ago Preparazione per CAUTI Model (figura S2)

  1. Togliere il tappo del G 30 ago. Tagliare un pezzo 7 millimetri di tubo PE10 e 5 mm pezzo di tubo in silicone come RenaSIL. Infilare l'ago con tubi PE10 finché il tubo tocca la base dell'ago.
  2. Poi alimentare il pezzo 5 millimetri sul ago-PE10 contenenti. UV sterilizzare i aghi assemblee durante la notte.
    NOTA: Quando si carica il tubo di silicone, lasciare circa 1 millimetro del tubo che si estende oltre la punta dell'ago.

9. E. faecalis OG1RF batterica Inoculum Preparazione

  1. Preparare OG1RF inoculo di partenza 48 ore prima del giorno inoculazione. Streak OG1RF su un BHI (Brain Heart Infusion) piatto da uno stock congelato.
  2. Scegli una colonia e inoculare in 10 ml di BHI e coltivarla staticamente per 18 ore a 37 ° C. Centrifugare la cultura e lavare il pellet (3 volte) in 1 ml di volume di PBS sterile 1x.
  3. Risospendere il pellet batterico in 1x PBS. Misurare la densità ottica batterica e regolare la concentrazione alla dimensione inoculo desiderato. La concentrazione standard dell'inoculo utilizzato è 10 7; tuttavia, questo può variare a causa del disegno dello studio

10. Catetere impianto

  1. Pulire la stazione di lavoro con il 70% di etanolo e coprire l'area con una copertura assorbente (o usare cappa a flusso sterile).
  2. Fissare il catetere-ago a un vuoto 1 ml (TB) siringa. Tagliare un pezzo quadrato 1 pollice di parafilm e mettere una piccola quantità di lubrificante chirurgica (circa le dimensioni di una monetina) sulla parte superiore.
    NOTA: Due aghi differenti sono utilizzati per la deposizione del catetere e per l'inoculo di minimizzato inoculazione accidentale dovuto alla manipolazione meccanica necessaria per l'impianto del catetere. Questo permette anche per la comodità di preparare un minor numero di aghi di inoculazione.
  3. Anestetizzare C57BL / 6 topi mettendoli in un vaso di vetro contenente 32 once un tèpalla -infuser con batuffoli di cotone imbevuti di 3 ml di isoflurano o camera vaporizzatore (segue produce protocollo) fino incosciente ma ancora respirando normalmente (1 respiro / sec).
  4. Poi mettere il mouse sul dorso su un tovagliolo di carta e diffondere le gambe. Coprire il naso del mouse con un cono di naso o tubo da 50 ml con batuffoli di cotone contenente una piccola quantità (circa 1-2 ml) di isoflurano.
    ATTENZIONE: Isoflurano è un anestetico per inalazione. Utilizzare in un ambiente ben ventilato e ridurre al minimo l'inalazione dal ricercatore.
  5. Palpitate delicatamente la vescica per indurre la minzione e garantire una vescica annullata. Pulire zona periuretrale con etanolo al 100% pulire.
  6. Disinfettare la zona periuretrale con soluzione di iodio-povidone al 10% con un applicatore di cotone-punta. Tamponare l'inoculazione ago / siringa, primo punto, nel lubrificante chirurgico.
    NOTA: povidone-iodio viene utilizzato per l'impianto del catetere, che è una soluzione asettica forte di alcol. Catetere impianto richiedepiù manipolazione meccanica per inserire il catetere e quindi un maggiore potenziale di contaminazione.
  7. Inserire il catetere nell'apertura uretrale. Una volta in, utilizzare pinzette per spingere la (7 millimetri PE10) lungo pezzo verso la vescica, quindi spingendo la (5 mm silicone) piccolo catetere e depositarlo nella vescica. Rimuovere l'ago, con il tubo 7 millimetri ancora attaccato, immediatamente.

11. batterica Inoculazione

  1. Seguire il protocollo di inoculazione batterica nella sezione 3, utilizzando l'inoculo preparato dalla sezione 9. Rimuovere il mouse dal cono naso e tornare alla sua gabbia

12. A ciascun intervallo di Sacrifice

  1. Preparare provette da 5 ml per la vescica e del rene (per organi seguire passo 4.1) e 1,5 ml provetta Eppendorf per cateteri. Aggiungere 1 ml di PBS 1x in 1,5 ml provetta Eppendorf per i campioni catetere
  2. Seguire i passaggi 4,3-4,5. Sezionare il mouse, la raccolta della vescica, reni e del catetere, placing i tessuti in modo indipendente in 5 provette ml contenenti 1x PBS e il catetere nel 1,5 ml Eppendorf (vedi punto 12.1).
    NOTA: utilizzare forbici diverse per la dissezione esterna e per la raccolta di organi e il recupero del catetere per minimizzare la contaminazione
  3. Poi seguire passo 4.6.

13. batterica Recovery

  1. Per gli organi, seguire i passi 5.1 e 5.2. Per il recupero batterica da cateteri, vortex alla velocità massima per 30 sec, sonicare campioni catetere per 5 minuti utilizzando un bagno sonicatore, e poi vortex alla velocità massima per altri 30 sec.
  2. Fai seriali diluizioni 1:10 out a 10 -8 e piastra ogni diluizione per CFU enumerazione su piastre BHI. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte e contare le colonie il giorno successivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I modelli intravescicali di semplice e catetere IVU associate forniscono piattaforme flessibili per chiarire i meccanismi molecolari della patogenesi batterica, l'impatto di queste malattie sulla tessuto ospite, e lo sviluppo e la sperimentazione di nuovi approcci per gestire queste infezioni comuni e costosi. A seconda del ceppo di topi e patogeno, inoculazione intravesical può essere usato per studiare le interazioni ospite-patogeno per chiarire fattori necessari per avviare o modulante acuta (Figura 1 e 3), croniche o ricorrenti (Figura 2) cistite. I dati riportati nella figura 1 sono rappresentativi della fase acuta (24 HPI) colonizzazione del tratto urinario dal prototipo UPEC cistite isolano UTI89 44. Dopo l'inoculazione, le infezioni possono sviluppare per 24 ore a che punto i topi vengono sacrificati e il tessuto della vescica e del rene omogeneizzato. Gli omogenati di tessuti sono in serie diluted e placcato per il conteggio dei batteri che colonizzano. Colonizzazione UPEC cronica e infiammazione della vescica possono essere istituiti e mantenuti in alcune linee del mouse (in particolare C3H / nubilato) in una dose infettiva e modo uropatogeno dipendente. Cistite cronica è definita come persistenti batteriuria ad alto titolo (> 10 4 CFU / ml), infiammazione della vescica e ad alto titolo oneri vescica batteriche (> 10 4 CFU / vescica) al momento del sacrificio 33. I dati riportati nella figura 2 sono CFU rappresentativi che si verificano quattro settimane dopo l'inoculazione di topi C3H / nubilato con 2 x 10 7 CFU di UTI89. In queste condizioni sperimentali, 20-50% dei topi infettati sviluppano cistite cronica mentre il restante 50-80% dei topi risolvere l'infezione. Questa dualità di esito dipende da un punto di controllo ospite-patogeno che si decide entro il primo 24 HPI. L'attivazione (o meno) dei risultati checkpoint nella distribuzione bimodale osservata di titoli batteriche, che inizia a manifestarsi inurine a 3 dpi (giorni dopo l'infezione) e nella vescica al sacrificio 28 dpi (Figura 2) 33. I topi con una storia di cistite cronica sono significativamente predisposti a ricorrenti cistite cronica sulla sfida dopo l'infezione iniziale è eliminato con terapia antibiotica 33. Allo stesso modo, una storia di UTI è un noto fattore di rischio per UTI ricorrente negli esseri umani. Così, questo è l'unico modello noto utilizzato per studiare la patogenesi della ricorrente UTI. Quando sperimentalmente modellazione UTI in ambiti alternativi del mouse, è importante determinare se il ceppo di topi è suscettibile di UTI, UTI ricorrenti o CAUTI, dato che alcuni ceppi sono più o meno resistenti allo sviluppo di queste sindromi 33.

Una misura aggiuntiva di cistite acuta è IBC enumerazione. Formazione IBC è limitata alle cellule superficiali ombrello terminalmente differenziate. IBC quantificazione è una misura informativo di carica batterica durante cisti acutaitis e alti livelli di IBC correlano con il rischio di sviluppare la cistite cronica 21. Formazione IBC verifica solo nelle fasi acute della malattia. Dopo l'esfoliazione delle cellule superficiali ombrello, GIR non sono più rispettati. Nel modello UTI C3H / nubilato, IBC può essere misurato 6 ore dopo inoculando ~ 1 x 10 7 CFU di UTI89 nella vescica transurethrally. Vesciche sono divaricate con perni metallici su lastre di silicone e colorate per l'espressione di LacZ. LacZ, β-galattosidasi, un enzima batterico comunemente espressa che scinde il legame β tra il galattosio e altri zuccheri. Questo enzima può essere utilizzato per rilevare i batteri fornendo X-gal, un analogo β-galattoside, che produce un colore blu sulla fenditura. Dopo la colorazione, le camere d'aria vengono esposte sotto un microscopio da dissezione con il GRV che appaiono come puntini punctae blu / viola sul urotelio e IBC possono essere elencati contando i punti (figura 3A). Mentre il numero di IJacket formate per animale varia, nel C3H / nubilato sfondo una media di ~ 50 IBC sono visti per la vescica (Figura 3B). Aumento GIR in modo dose-dipendente. Il numero di IBC che si formano varia tra UPEC e ceppi di topi di sfondo. Ad esempio, in C57BL / 6, un inoculo di ~ 1 x 10 7 UTI89 porta alla formazione di diverse centinaia di IBC per vescica.

Al di là della comunità semplice acquisita UTI modellato sopra, brughiera-cura associate infezioni del tratto urinario rappresenta un onere significativo per il sistema sanitario. IVU rappresentano circa il 40% di tutte le infezioni associate sanitari e fino al 95% di tutti sanitario associato IVU sono catetere associati 45. Qui mostriamo un modello murino di impianto della vescica di CAUTI che rappresenta un potente sistema per l'analisi sperimentale di questo difficile problema clinico. I dati presentati in Figura 4 sono rappresentative del 24 hr infezioni con il modello E. faecalis s addestrare OG1RF. Quando 1 x 10 7 CFU di OG1RF sono via endovescicale inoculato in una vescica non impiantato, l'infezione comincia a chiaro 24 HPI (Figura 4A) e del 3 dpi la risoluzione dell'infezione 41. Al contrario, l'inoculazione di OG1RF in un impiantati risultati della vescica in colonizzazione sia il catetere e la vescica, con 10 volte superiori livelli di colonizzazione della vescica a 24 HPI di quelli osservati nelle vesciche non impiantato (Figura 4A e 4B). Inoltre, questa infezione è mantenuta a> 10 6 CFU nella vescica fino alla perdita catetere circa 7 dpi 41. Tutti i modelli sperimentali descritti sono suscettibili di un elevato grado di flessibilità sperimentale, compreso ma non esclusivo di vari approcci per imaging macroscopica e microscopica dei tessuti infetti e superfici, dimensioni inoculo alterati e tempi di malattia, infezioni competitivi e ospitano analisi immunologiche .

ve_content "> Figura 1
Figura 1:. 24 ore colonizzazione del tratto urinario femminile, 7-8 settimane di età C3H / mice HeN stati transurethrally inoculato con ~ 2 x 10 7 CFU del prototipo UPEC cistite isolare UTI89 per 24 ore. CFU rappresentativi recuperati dai tessuti della vescica e del rene raccolte vengono mostrati, n = 5. La linea tratteggiata denota il limite inferiore di rilevamento (20 CFU).

Figura 2
Figura 2:. 28 giorni di colonizzazione del tratto urinario femminile, 7-8 settimane di età topi C3H / HeN stati transurethrally inoculato con ~ 2 x 10 7 CFU UTI89. Urina era raccogliere in indicati infezione giorni dopo (dpi) e placcato per CFU enumerazione. Rappresentante della vescica 28 giorni e renali titoli vengono anche visualizzati, n = 8. Urine CFU limite inferiore di rilevazione (1.000 UFC / ml) è indicato con la linea tratteggiata. Rappre linea tratteggiatats limite il tessuto inferiore di rilevamento, 20 CFU / tessuto.

Figura 3
Figura 3:. IBC enumerazione Femmina, 7-8 settimane di età topi C3H / HeN stati transurethrally inoculato con ~ 1 x 10 7 CFU UTI89. Vesciche sono state raccolte 6 HPI e allargate per IBC colorazione. (A) Immagine di vescica strombato dopo LacZ colorazione. GIR sono rappresentati come puntini blu. L'immagine inserto è un ingrandimento digitale della sezione dell'immagine nella scatola nera. (B) numeri rappresentativi di IBC formati nei topi C3H / nubilato 6 HPI, n = 10.

Figura 4
Figura 4: E. faecalis catetere-associata UTI. C57BL / 6 topi sono stati inoculati con o senza cateteri con ~ 1 x 10 7 CFU della (A) E. faecalis colonizzazione della vescica in presenza o assenza di catetere. (B) E. faecalis colonizzazione del catetere. Test di Mann-Whitney U è stato utilizzato per esperimenti di topo, p <0,05 è stato considerato statisticamente significativo. **, P <0.005.

Figura S1
Figura S1:. UTI preparazione inoculo ago diagramma mostra inoculazione fasi di preparazione dell'ago compresi materiali necessari (1), filettatura del catetere sul all'ago (2) e del taglio del tubo prima dell'inoculazione (3).

Figura S2
Figura S2:. CAUTI preparazione inoculo ago diagramma mostra materiali di preparazione dell'inoculo aghi necessari (1), filettatura del catetere inoculazione (2) e il catetere impiantazione suall'ago (3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Comunità Semplice acquisito UTI è un'infezione comune e costosa contabilità per diversi milioni di visite di assistenza primaria ogni anno 46. Inoltre, Cautis sono un sanitario comune infezione acquisita che è diventato estremamente oneroso per gli operatori sanitari, come i Centri di Medicare e Medicaid Services non rimborsa i fornitori per il costo aggiunto di trattamento risultante dall'ospedale acquisito CAUTI 45. I modelli murini di UTI, sia cistite non complicata e CAUTI, descritti in questi protocolli forniscono strumenti preziosi per la comprensione delle basi molecolari delle interazioni ospite e patogeno necessari per l'avvio, il mantenimento, e modulando il risultato di diverse forme di UTI. Questi modelli consentono l'applicazione di potenti genetica batterica e mouse, immunologici, microscopico, strumenti genetici biochimici e chimici per l'analisi di UTI 23,47-49. Inoltre, i protocolli qui esposti hanno fornito una piattaformaper lo sviluppo e la sperimentazione di nuove strategie terapeutiche e preventive comprese le piccole molecole inibitrici della virulenza batterica e nuovi bersagli di vaccinazione e le strategie di 50-55.

Ci sono diverse condizioni critiche che devono essere mantenute per l'applicazione di successo del modello di cistite non complicata. Come per tutte le procedure del mouse anestesia, la cura deve essere presa per prevenire la mortalità del mouse a causa di un eccesso di anestesia. Nel preparare il catetere inoculazione, il tubo di silicone deve essere sufficientemente lungo da coprire la punta dell'ago, ma non così lungo da danneggiare la parete della vescica sulla cateterizzazione. Inoltre, a causa della vicinanza e dimensioni dell'apertura vaginale, bisogna fare attenzione ad inserire il catetere inoculo nell'uretra e non la vagina. Durante strombatura vescica per IBC enumerazione, è essenziale che le vesciche essere divaricate il più rapidamente possibile dopo la dissezione e il tessuto da fissare per approximately 1 ora, ma non durante la notte. Per IBC enumerazione LacZ colorazione, è anche necessario che il batterio in questione produce LacZ durante la colonizzazione delle cellule uroteliali. Quando si utilizza ceppi dove l'enzima LacZ non si produce, è ancora possibile enumerare IBC con immunofluorescenza con anti- E. anticorpi coli o GFP batteri che esprimono. Una caratteristica particolare di questo modello è i modelli differenti di progressione della malattia e la gravità presentato da diverse linee pure del mouse e il potenziale patogeno variabile del prototipo UPEC ceppi 33,56. Queste differenze sono sia un punto di forza e la limitazione di questa tecnica in quanto riassumono la variazione naturale di suscettibilità dell'ospite e della diversità patogeno che è stata osservata negli studi clinici e fenotipici mentre complicando disegno sperimentale e l'interpretazione 57,58. Queste variazioni forniscono fonti di confronto che consentono di chiarire ospite e Mechan battericoismi modulando la patogenesi della semplice UTI 33,56. Tuttavia, significano anche che, a causa del diverso grado di linea di topi UTI suscettibilità, la massima cura deve essere presa nella scelta della linea di topi corretta e tensione UPEC per affrontare il problema particolare un investigatore sta chiedendo. Ad esempio, topi C57BL / 6 sono un ottimo modello di infezione acuta, presentano titoli elevati batteriche e un gran numero di GIR a primi punti temporali. Questo ceppo poi risolve rapidamente l'infezione tra i 3 ei 7 dpi con la sola colonizzazione persistente derivante da infezioni renali gravi e quiescenti serbatoi intracellulari 33,34. Il / 6 modello C57BL può rappresentare accuratamente il risultato più comune per molti pazienti UTI in cui i sintomi presenti e poi risolvono. Al contrario, il mouse sfondo C3H / nubilato presenta un alto grado di sensibilità a cistiti croniche che li rende un ceppo ideale per studiare IVU ricorrenti. Sono stati inoltre istituiti Altri modelli UTIin CBA, DBA e C3H / HeJ topi sfondo dimostrando utile per studiare particolari aspetti di UTI 33,59. Lo svantaggio sperimentale primaria esposto dal modello cistite non complicata è l'esistenza di più colli di bottiglia infezione limitare l'applicazione di metodologie di screening su larga scala genetica per la scoperta di nuovi fattori batterici necessari per acuta, cronica e ricorrente cistiti 60.

Le considerazioni critiche per il modello cistite non complicata tutti si applicano al modello CAUTI basato impianto con due ulteriori preoccupazioni. In primo luogo, occorre prestare attenzione a garantire che l'inserimento dell'impianto avviene in modo sterile, a causa della maggiore suscettibilità alle infezioni della vescica conferito dall'impianto. In secondo luogo, è essenziale che il catetere sia tenuto in posizione durante la rimozione dell'ago impiantazione. I principali limiti del modello CAUTI sono che ha una gamma ridotta di accoglienza disponibili background genetico, il propensity per la perdita del catetere nel tempo e l'incapacità di raccogliere l'urina a causa di una disfunzione della vescica derivanti da impianto. Per compensare la perdita di impianto e l'impossibilità di monitorare l'infezione tramite analisi delle urine longitudinale, questo modello richiede in genere un numero maggiore di topi cateterizzato per momenti successivi e gruppi di topi devono essere sacrificati in ogni punto desiderato. L'host limitato sfondi risultati genetici alla frequenza proibitivo in cui alcuni ceppi di topi, come C3H / nubilato, perdono l'impianto (P. Guiton, comunicazione personale 2010). Come risultato, i protocolli Cauti sopra descritte sono solo stati ottimizzati nel ceppo C57BL / 6 del mouse. Tuttavia, mentre la limitazione di ceppi di topi disponibili per CAUTI è un peccato, molte varianti genomiche sono state stabilite in C57BL / 6 di fondo e il modello CAUTI espande la diversità batteriologico disponibili per lo studio durante UTI alterando l'ambiente vescica per facilitare la colonizzazione da parte di organismi che sonoaltrimenti non patogeni nel modello murino di UTI. Un esempio di questo è la recente scoperta del ruolo di Fg rilasciato durante catetere indotta infiammazione della vescica in E. crescita faecalis, formazione di biofilm, e persistenza durante CAUTI 42. Questo esempio illustra la potenza del modello di impianto di CAUTI nel chiarire non solo meccanismi molecolari della patogenesi batterica ma anche il ruolo di fattori dell'ospite durante l'infezione. Tutte queste caratteristiche contribuiscono a comprendere questa infezione clinica rilevante, che è stato in precedenza understudied.

Oltre agli approcci sperimentali sopra descritti, i modelli murini di cistite e CAUTI sono suscettibili di numerose modifiche metodologiche. Nel caso del modello cistite non complicata, queste modifiche possono includere la riduzione del volume inoculazione e la forza applicata durante l'instillazione dell'inoculo per ridurre il numero di batteriintrodotto nei reni 61, variando la durata dell'infezione, sacrificando in momenti già nel 1 hpi e mediante saggi di protezione gentamicina per valutare il grado in cui la uropatogeno ha invaso la vescica cellule epiteliali 62. Le vesciche strombate da topi sacrificati tra 6 e 24 HPI possono essere sezionato e colorati con gli anticorpi ai vari host e / o epitopi batteriche e osservati al microscopio confocale a fluorescenza o di osservare la struttura IBC, flussaggio batterica e filamentazione e tessuto ospite condizioni 25,33 , 63,64. L'effetto di infezione uropatogeno e / o l'impianto sulle risposte immunitarie locali e sistemici del paese ospitante può essere valutata utilizzando il sistema di citometria tallone Bioplex o test basati ELISA per determinare i livelli di citochine nelle urine o nel siero, rispettivamente, 33,65. Infine, la condizione del tessuto della vescica, la posizione e la morfologia di colonizzazione batterica e la struttura del biofilm depositato suil catetere può essere valutata da varie tecniche di imaging tra cui microscopia elettronica 25,41.

Questi modelli di base di infezione può anche essere adattati per imitare altri fenomeni clinicamente rilevanti tra cui ricorrenti UTI e lo sviluppo di una risposta immunitaria adattativa attraverso infezioni multiple. In questo contesto, ripetuta infezione di C57BL / 6 topi risultati in maggiore resistenza cistite acuta mentre nel modello C3H / gallina, previo lo sviluppo di cistite cronica seguita dalla liquidazione dell'infezione tramite la somministrazione di antimicrobici sensibilizza questi topi sviluppare cistite cronica nelle successive 66 vaccinazioni. Inoltre i meccanismi molecolari di fattori di rischio per lo sviluppo di UTI possono essere esaminati. Il diabete e l'obesità hanno entrambi dimostrato di aumentare la frequenza e la gravità delle infezioni del tratto urinario. Il diabete di tipo 2 può essere geneticamente modellati nei topi in background FVB / NJ e un modello indotto chimicamente di diabete di tipo 1 è already dimostrato di aumentare la gravità delle infezioni del tratto urinario causate da entrambi UPEC e K. pneumophila 67,68.

Infine, questi sistemi modello rappresentano un banco di prova ideale per lo sviluppo e l'ottimizzazione delle modalità terapeutiche volte a curare o prevenire UTIs e Cautis. La comprensione molecolare della patogeno ospite forniti da questi modelli ha già favorito lo sviluppo di strategie di vaccinazione efficaci volte a colpire importante fattori di virulenza 51-55. Inoltre, piccole molecole inibitrici di UPEC adesione hanno dimostrato di essere efficaci nel trattamento di semplice UTIs acuta e cronica, nonché Cautis causata da UPEC 12,69,70. Entrambi i modelli UTI e Cauti semplici descritti in questi protocolli forniscono gli strumenti sperimentali per analizzare i dettagli molecolari delle interazioni ospite-patogeno del tratto urinario. Questi strumenti possono essere sfruttati in molti modi per espandere la nostra understanding di questo complesso insieme di condizioni e facilitare lo sviluppo di più efficaci interventi terapeutici.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito da ORWH SCOR P50 DK064540, RO1 DK 051.406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101.171, e F32 DK 104516-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles BD Precision Glide 305106 30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing BD 427400 Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing Braintree Scientific, Inc SIL 025 inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia Butler Schein 29405 250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar Kimble Chase 5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser Schefs-Amazon Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls Fisherbrand 22-456-880
50 ml Falcon tubes VWR 89039-660
Isotec 3 -vaporizer Ohmeda 1224478
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201 (when necessary)
Betadine solution Betadine solution 10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips Fisher Scientific 22-037-924 6 inches
Diapers for bench Fisherbrand 14206 63 Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant Surgilube 0281-0205-36
Dissecting scissor Fine Science tools, INC 14084-08
Micro-Adson Forceps Fine Science tools, INC 11018-12
1 ml syringe BD 309659 Tuberculin slip tip
Parafilm Bemis PM996 4 inches x 125 FT
Eppendorf rack Fisherbrand 05-541-1
Eppendorf tubes MIDSCI AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer PRO Scientific INC Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube BD 352063 for organ homogenization
Paper towel Georgia-Pacific
Ethanol Pharmco-AAPER 11100020S 200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates Corning 3788
1x Phosphate sodium saline Sigma-Aldrich P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210 Branson Ultrasonics Corporation 1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate Techno Plastic Products 92006
Pins Fine Science Tools 26002-20
Sylgard 184 Dow Corning 3097358-1004 Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) Invitrogen 15520-034 Ultrapure
N, N-Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
MgCl2 (Magnesium chloride) Sigma Aldrich M8266
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750
Nonidet-P40 Roche 11754599001 Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide) Sigma Aldrich P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide) Sigma Aldrich 60299

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Dis Mon. 49, 53-70 (2003).
  2. Foxman, B., et al. Risk factors for second urinary tract infection among college women. American journal of epidemiology. 151, 1194-1205 (2000).
  3. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Increasing antimicrobial resistance and the management of uncomplicated community-acquired urinary tract infections. Annals of internal medicine. 135, 41-50 (2001).
  4. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Isolation of fluoroquinolone-resistant rectal Escherichia coli. after treatment of acute uncomplicated cystitis. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 56, 243-246 (2005).
  5. Gupta, K., Sahm, D. F., Mayfield, D., Stamm, W. E. Antimicrobial resistance among uropathogens that cause community-acquired urinary tract infections in women: a nationwide analysis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 89-94 (2001).
  6. Gupta, K., Scholes, D., Stamm, W. E. Increasing prevalence of antimicrobial resistance among uropathogens causing acute uncomplicated cystitis in women. Jama. 281, 736-738 (1999).
  7. Jarvis, W. R. Selected aspects of the socioeconomic impact of nosocomial infections: morbidity, mortality, cost, and prevention. Infect Control Hosp Epidemiol. 17, 552-557 (1996).
  8. Lo, E., et al. Strategies to prevent catheter-associated urinary tract infections in acute care hospitals: 2014 update. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America. 35, 464-479 (2014).
  9. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature reviews Urology. 7, 653-660 (2010).
  10. Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11, 551-581 (1997).
  11. Hannan, T. J., et al. LeuX tRNA-dependent and -independent mechanisms of Escherichia coli. pathogenesis in acute cystitis. Molecular microbiology. 67, 116-128 (2008).
  12. Cusumano, C. K., Hung, C. S., Chen, S. L., Hultgren, S. J. Virulence plasmid harbored by uropathogenic Escherichia coli. functions in acute stages of pathogenesis. Infection and immunity. 78, 1457-1467 (2010).
  13. Dhakal, B. K., Mulvey, M. A. The UPEC pore-forming toxin alpha-hemolysin triggers proteolysis of host proteins to disrupt cell adhesion, inflammatory, and survival pathways. Cell host & microbe. 11, 58-69 (2012).
  14. Garcia, E. C., Brumbaugh, A. R., Mobley, H. L. Redundancy and specificity of Escherichia coli. iron acquisition systems during urinary tract infection. Infection and immunity. 79, 1225-1235 (2011).
  15. Bergsten, G., Wullt, B., Svanborg, C. Escherichia coli., fimbriae, bacterial persistence and host response induction in the human urinary tract. International journal of medical microbiology : IJMM. 295, 487-502 (2005).
  16. Zhou, G., et al. Uroplakin Ia is the urothelial receptor for uropathogenic Escherichia coli.: evidence from in vitro FimH binding. J Cell Sci. 114, 4095-4103 (2001).
  17. Eto, D. S., Jones, T. A., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Integrin-mediated host cell invasion by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 3, e100 (2007).
  18. Taganna, J., de Boer, A. R., Wuhrer, M., Bouckaert, J. Glycosylation changes as important factors for the susceptibility to urinary tract infection. Biochemical Society transactions. 39, 349-354 (2011).
  19. Mulvey, M. A., et al. Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science. 282, 1494-1497 (1998).
  20. Mysorekar, I. U., Mulvey, M. A., Hultgren, S. J., Gordon, J. I. Molecular regulation of urothelial renewal and host defenses during infection with uropathogenic Escherichia coli. The Journal of biological chemistry. 277, 7412-7419 (2002).
  21. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  22. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli. from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and immunity. 75, 52-60 (2007).
  23. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 1333-1338 (2004).
  24. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae. urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and immunity. 76, 3337-3345 (2008).
  25. Anderson, G. G., et al. Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections. Science. 301, 105-107 (2003).
  26. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli. recurrent urinary tract infections. Pathogens and disease. 68, 78-81 (2013).
  27. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4, e329 (2007).
  28. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PloS one. 8, e83637 (2013).
  29. Hopkins, W. J., Uehling, D. T., Wargowski, D. S. Evaluation of a familial predisposition to recurrent urinary tract infections in women. American Journal of Medical Genetics. 83, 422-424 (1999).
  30. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli. urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and immunity. 66, 2798-2802 (1998).
  31. Mabeck, C. E. Treatment of uncomplicated urinary tract infection in non-pregnant women. Postgraduate medical journal. 48, 69-75 (1972).
  32. Ferry, S., Holm, S., Stenlund, H., Lundholm, R., Monsen, T. The natural course of uncomplicated lower urinary tract infection in women illustrated by a randomized placebo controlled study. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 36, 296-301 (2004).
  33. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli. predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathog. 6, (2010).
  34. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. persistence and eradication from the urinary tract. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 14170-14175 (2006).
  35. Glahn, B. E., Braendstrup, O., Olesen, H. P. Influence of drainage conditions on mucosal bladder damage by indwelling catheters. II. Histological study. Scandinavian journal of urology and nephrology. 22, 93-99 (1988).
  36. Goble, N. M., Clarke, T., Hammonds, J. C. Histological changes in the urinary bladder secondary to urethral catheterisation. British journal of urology. 63, 354-357 (1989).
  37. Ronald, A. The etiology of urinary tract infection: traditional and emerging pathogens. Dis Mon. 49, 71-82 (2003).
  38. Arias, C. A., Murray, B. E. The rise of the Enterococcus.: beyond vancomycin resistance. Nature reviews. Microbiology. 10, 266-278 (2012).
  39. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. The New England journal of medicine. 291, 215-219 (1974).
  40. Warren, J. W. Catheter-associated urinary tract infections. Infect Dis Clin North Am. 11, 609-622 (1997).
  41. Guiton, P. S., Hung, C. S., Hancock, L., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcal biofilm formation and virulence in an optimized murine model of foreign body-associated urinary tract infections. Infection and immunity. 78, 4166-4175 (2010).
  42. Flores-Mireles, A. L., Pinkner, J. S., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. EbpA vaccine antibodies block binding of Enterococcus faecalis. to fibrinogen to prevent catheter-associated bladder infection in mice. Science translational medicine. 6, 254ra127 (2014).
  43. Martinez, J. J., Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Pinkner, J. S., Hultgren, S. J. Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells. The EMBO Journal. 19, 2803-2812 (2000).
  44. Hultgren, S. J., Schwan, W. R., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Regulation of production of type 1 pili among urinary tract isolates of Escherichia coli. Infection and immunity. 54, 613-620 (1986).
  45. Chenoweth, C. E., Gould, C. V., Saint, S. Diagnosis, Management, and Prevention of Catheter-Associated Urinary Tract Infections. Infect. Dis. Clin. North Am. 28, 105-+ (2014).
  46. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7, 653-660 (2002).
  47. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (1988).
  48. Song, J., et al. TLR4-mediated expulsion of bacteria from infected bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14966-14971 (2009).
  49. Wang, H., Min, G., Glockshuber, R., Sun, T., Kong, X. P. Uropathogenic E. coli. adhesin-induced host cell receptor conformational changes: implications in transmembrane signaling transduction. Journal of molecular biology. 392, 352-361 (2009).
  50. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science translational medicine. 3, 109-115 (2011).
  51. Langermann, S., Ballou, W. R. Vaccination utilizing the FimCH complex as a strategy to prevent Escherichia coli. urinary tract infections. J Infect Dis. 183, S84-S86 (2001).
  52. Langermann, S., et al. Vaccination with FimH adhesin protects cynomolgus monkeys from colonization and infection by uropathogenic Escherichia coli. J Infect Dis. 181, 774-778 (2000).
  53. Langermann, S., et al. Prevention of mucosal Escherichia coli. infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination. Science. 276, 607-611 (1997).
  54. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. Plos Pathogens. 5, (2009).
  55. Russo, T. A., et al. The siderophore receptor IroN of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. is a potential vaccine candidate. Infect. Immun. 71, 7164-7169 (2003).
  56. Schwartz, D. J., et al. Positively selected FimH residues enhance virulence during urinary tract infection by altering FimH conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15530-15537 (2013).
  57. Czaja, C. A., et al. Prospective cohort study of microbial and inflammatory events immediately preceding Escherichia coli. recurrent urinary tract infection in women. J Infect Dis. 200, 528-536 (2009).
  58. Chen, S. L., et al. Genomic Diversity and Fitness of E. coli. Strains Recovered from the Intestinal and Urinary Tracts of Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Science Translational Medicine. 5, 2013 (2013).
  59. Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli. through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 166, 1148-1155 (2001).
  60. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  61. Chan, C. Y., St John,, L, A., Abraham, S. N. Mast Cell Interleukin-10 Drives Localized Tolerance in Chronic Bladder Infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  62. Justice, S. S., Lauer, S. R., Hultgren, S. J., Hunstad, D. A. Maturation of intracellular Escherichia coli. communities requires SurA. Infect. Immun. 74, 4793-4800 (2006).
  63. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19884-19889 (2006).
  64. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1333-1338 (2004).
  65. Guiton, P. S., Hannan, T. J., Ford, B., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcus faecalis. Overcomes Foreign Body-Mediated Inflammation To Establish Urinary Tract Infections. Infect. Immun. 81, 329-339 (2013).
  66. Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. Journal of Immunology. 176, 3080-3086 (2006).
  67. Rosen, D. A., Hung, C. -S., Kline, K. A., Hultgren, S. J. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect. Immun. 76, 4290-4298 (2008).
  68. Daneshgari, F., Leiter, E. H., Liu, G., Reeder, J. Animal Models of Diabetic Uropathy. Journal of Urology. 182, S8-S13 (2009).
  69. Guiton, P. S., et al. Combinatorial Small-Molecule Therapy Prevents Uropathogenic Escherichia coli. Catheter-Associated Urinary Tract Infections in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56, 4738-4745 (2012).
  70. Totsika, M., et al. A FimH Inhibitor Prevents Acute Bladder Infection and Treats Chronic Cystitis Caused by Multidrug-Resistant Uropathogenic Escherichia coli. ST131. Journal of Infectious Diseases. 208, 921-928 (2013).

Tags

Medicina emissione 100, UPEC, Uropatogeni catetere infezione del tratto urinario IBC cistite cronica

Erratum

Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 08/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.
Istituzione e caratterizzazione di UTI e CAUTI in un modello murino
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conover, M. S., Flores-Mireles, A.… More

Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (100), e52892, doi:10.3791/52892 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter