Abstract
Die Grenzen der optischen Auflösung und der Herausforderung der Identifizierung von spezifischen Proteinpopulationen in der Transmissionselektronenmikroskopie wurden Hindernisse in der Zellbiologie. Viele Phänomene können durch in vitro-Analyse, ein vereinfachtes System erläutert und benötigen zusätzliche Strukturinformationen in situ, insbesondere im Bereich zwischen 1 nm und 0,1 & mgr; m, um vollständig zu verstehen. Hier Elektronen spektroskopische Bildgebung, eine Transmissions-Elektronenmikroskopie-Technik, die gleichzeitige Abbildung der Verteilung der Proteine und Nukleinsäuren ermöglicht, und ein Ausdruck tag, miniSOG, kombiniert werden, um die Struktur und Organisation der DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Foci studieren.
Introduction
Trotz der erheblichen Fortschritte in der Lichtmikroskopie in den letzten Jahren 1, Zellbiologen leiden immer noch unter einer Lücke in Auflösung. Dies begrenzt Verständnis der Struktur-Funktionsbeziehungen in grundlegenden zellulären Prozesse, die eine koordinierte Zusammenspiel von makromolekularen Komplexen beinhalten (zB in Chromatin-Remodeling, DNA-Reparatur, die RNA-Transkription und DNA-Replikation). Obwohl Transmissions-Elektronenmikroskopen (TEM) s die erforderliche Auflösung, es schwierig war, diese Prozesse strukturell wegen der Unfähigkeit zu definieren, um bestimmte Proteine zu markieren gleichzeitig in der Lage, die biochemische Zusammensetzung der visualisierten Strukturen zu bestimmen. In Abwesenheit von internen Membranen zur Unterscheidung der Kernstrukturen wurde der Kern eine besonders anspruchsvolle Aufgabe. Elektronenspektroskopie-Bildgebung (ESI) löst einige dieser Beschränkungen, indem sie den gleichzeitigen Nachweis und die Differenzierung von DNA, RNA und protein-basierten Kernstrukturen 2-5.
Electron spektroskopischen Bildgebung:
Um elementaren Verteilungen mit hoher Empfindlichkeit und Auflösung im Elektronenmikroskop abzubilden, kann man ein Bildgebungsspektrometer, die Elektronen, die unelastisch durch Wechselwirkungen mit Innenschale Elektronen eines Elements in der Probe 6 wurde zerstreut wählt verwenden. Weil elementspezifischen Energiemengen als Folge der Ionisation von Atomen in der Probe verloren geht, können diese Elektronen getrennt und visualisiert unter Verwendung eines Spektrometers, das Elektronenmikroskop befestigt werden. Somit Analyse des Spektrums der Elektronen, die mit der Probe in Wechselwirkung getreten zeigt die qualitative und quantitative Informationen über die elementare Zusammensetzung der Probe 7. Elektronen, die keine Energie verlieren, wenn die durch die Probe werden in der "Null-Verlust-Spitze" des Elektronen-Energieverlust gefundenSpektrum. Die Fülle dieser Elektronen zu der Masse, Dichte und Dicke der Probe bezogen ist und der Elektronen, die durch die Probe passieren, ohne mit der Probe oder Energie beim Durchgang durch die Probe zu verlieren besteht. Diese Information kann für die absolute Quantifizierung der Anzahl von Atomen eines bestimmten Elements in der vorliegenden Probe 8 ist.
Da biologische Proben bestehen hauptsächlich von Lichtelementen, die schlecht in den einfallenden Strahl der TEM lenken die Elektronen, Färbeverfahren unter Verwendung von Schwermetallsalzen werden müssen, um den Kontrast in der Probe zu erzeugen, aufgebracht werden. Die mangelnde Spezifität der meisten dieser Kontrastmittel und die Unfähigkeit, mehr als ein Fleck, wo Spezifität möglich visualisieren hat den Wert der herkömmlichen Elektronenmikroskopie bei der Untersuchung des Kerns beschränkt. ESI hat signifikante Vorteile gegenüber herkömmlichen TEM, insbesondere für die Untersuchung von Strukturen des Zellkerns.Es ist möglich, die phosphorreichen Natur der DNA- und RNA-enthaltenden makromolekularen Komplexen auszunutzen Nucleoprotein-Komplexe aus Protein-Komplexe zu unterscheiden und verschiedene Nucleoproteinkomplexen ihre Dichte von Nukleinsäuren zu lösen. Der verbleibende biologische Material kann auf der Grundlage seiner Fülle von Stickstoff abgebildet werden. Mapping nur diese beiden Elemente und Analyse von deren Verteilung und relative Häufigkeit innerhalb der verschiedenen anatomischen Strukturen bietet uns eine Vielzahl von Informationen über den Zellkern. Zum Beispiel ist es einfach, Chromatin und den Ribosomen in der Karte darstellt Phosphor Fluss identifizieren. Die interchromatin Raum Kernporenkomplexe und Kernkörper, andererseits leicht in der Stickstoffkartenbild detektiert werden.
Mini Singulett-Sauerstoff-Generator-System (miniSOG)
Während ESI stellt eine leistungsfähige Technik, um in situ Chromatinstruktur zu studieren, weil es,s Vorteil der charakteristischen Verhältnisse in elementare Zusammensetzung von Phosphor und Stickstoff, kann die Elementzusammensetzung in der Regel nicht verwendet werden, um zwischen den verschiedenen Populationen von Protein-Komplexen zu unterscheiden. Antikörper mit kleinen Goldpartikel im Nanometerbereich markiert wurden allgemein verwendet, um die Lage der einzelnen Moleküle abzubilden. Da die Goldpartikel in der Regel zu einem sekundären Antikörper gebunden ist, wird es in einem Umkreis von etwa 20 nm auf der durch den primären Antikörper nachgewiesen Epitop angezeigt. In Posteinbettungsproben können Antikörper nur die Epitope, die an der Oberfläche der Abschnitte freiliegen detektieren. Während es möglich ist, die Anwesenheit eines Antigens nachzuweisen und in Beziehung zu einer bestimmten anatomischen Struktur der Zelle, die Information, die erhalten wird, nicht vollständig ist, da die meisten der Epitope durch Harz verdeckt. Pre-Einbettungstechniken, die ähnliche Protokolle zu denen für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet verwenden, erlauben den Zugriff auf Antigene in ganzdie gesamte Tiefe der Probe, aber die Permeabilisierung Schritte, die erforderlich sind, damit der Antikörper an die Zelle eindringen erfordern typischerweise die Entfernung von Lipidmembranen und Komponenten, die nicht durch Aldehyde fixiert werden können, zu entfernen. Darüber hinaus ist die bevorzugte Aldehyd Fixiermittel für Ultra Konservierung, Glutaraldehyd, üblicherweise zerstört Epitopen und folglich wird Paraformaldehyd in der Regel erforderlich. Dies ist weniger effektiv bei der Protein-Protein-Vernetzung. Ein weiterer Nachteil von Antikörpern, die mit einer Gold-Nanoteilchen bezeichnet werden, ist, daß Gold ein sehr elektronendichtes Material, das einen starken Kontrast, die interessante strukturelle Details der Probe, die schwächeren Kontrast hat verschleiern kann erzeugt.
Die Entstehung des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) als ein exprimiertes Protein-Tag hat die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie, um Fragen in der Zellbiologie Antwort umgewandelt. Tagging ein Protein mit einem kleinen Leuchtstoff Domäne ermöglicht Abbildung von seiner Verteilung in vivo 9 katalytisch aktiv. Die Reaktionsprodukte von HRP kann auch diffundieren weg von der Stelle der Erzeugung, so dass ihre Auflösung ist schlechter als der Nanogold-Verfahren 10. Um diese Probleme zu umgehen, wurde der Flash / ReAsH System 11 entwickelt. Es besteht von rekombinanten Fusionsproteinen, die ein Tetracysteinmotiv Motiv besitzen. Dieses Motiv ermöglicht die Bindung vona biarsenic Fluorophor. Wenn sie erregt werden, wird das gebundene Flash oder ReAsH Lage, den hochreaktiven Singulett-Sauerstoffs und somit photoconvert Diaminobenzidin (DAB) in einem Polymer, das unmittelbar am Ort der markierten Proteine Ausscheidungen zu erzeugen. Der DAB-Polymer kann mit Osmiumtetroxid, die Elektronendichte ist, und kann somit verwendet werden, um die Verteilung des rekombinanten Fusionsproteins in der TEM abzubilden gefärbt werden.
Im Jahr 2011 Shu et al. 10 präsentiert den miniSOG System, das aus einem kleinen 106 Aminosäuren Fusion-Tag aus einem Flavoprotein von Arabidopsis, die Leuchtstoff und in der Lage, viele Singulett-Sauerstoff-Radikale, wenn sie mit 448 nm blaues Licht angeregt zu erstellen ist abgeleitet aus. Jene Singulettsauerstoff Reste können photo oxidize Diaminobenzidin verwendet werden, um Polymere an und nahe der Oberfläche der markierte Protein, das wesentlich näher als Immunogold markierten Antikörpern 11 bilden. Während der Blitz / ReAsH System erfordert womit sich die FluorChrom und das Diaminobenzidin in die Zellen, bevor Sie die Photokonversion, die miniSOG System benötigt nur Diaminobenzidin und leicht und außerdem ist etwa so effektiv zweimal bei Polymerisation von Diaminobenzidin. Hier wird miniSOG in Kombination mit ESI, um die Ultrastruktur von DNA-Reparatur-Foci Karte eingesetzt.
DNA-Reparatur-Foci (DRF)
Nicht reparierten DNA-Doppelstrangbrüche stellen eine ernsthafte Bedrohung für die Zelle, da sie für die Umsiedlung und den Verlust der genetischen Information zu führen. Wiederum kann dies Seneszenz, Krebs und Zelltod führen. Viele Proteine, die an DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur beteiligt sind, sammeln sich Schwerpunkte, die um einen DNA-Doppelstrang zusammenzubauen brechen 12-14. Obwohl ihre Funktion nicht bekannt ist, stellen sie die Website in den Zellkern, die die DNA-Doppelstrangbruch enthält, und ist der Ort von DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur.
DNA-Reparatur foci (DRF) wurden durch Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert worden, und sie als Biomarker für DNA-Schäden 12,15 dienen. Sie sind massiv in Bezug auf die Größe des Doppelstrangbruch und wurden als relativ homogen bis in die jüngste superauflösende Mikroskopie Studien zeigten einige Anzeichen von Unter Abschottung der Moleküle innerhalb jedes konzentrieren 16. Um zu verstehen, wie diese Seiten organisiert sind, ist es notwendig, alle der zugrunde liegenden biologischen Strukturen relativ zueinander zu visualisieren. Dies kann nicht durch Fluoreszenz-Mikroskopie erreicht werden, ist jedoch durch Elektronenmikroskopie 17,18 möglich. Hier wird ein Verfahren beschrieben, das Elektronen-spektroskopischen Bildgebung kombiniert mit der miniSOG Methode, um das Potenzial dieses kombinierten Ansatzes zu illustrieren, um die Ultrastruktur von DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur zu erkunden.
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Protocol
1. Erzeugung von miniSOG Zelllinien
- Wachsen U2OS (menschliche Osteosarkom-Zellen) in einer 35 mm-Schale, enthaltend 2 ml niedrigen Glucose Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 ergänzt wird, Atmosphäre.
- Transfektion der Zellen, wenn sie 80% Konfluenz durch Lipofektion mit gereinigtem Transfektion Qualität (A269 / 280-Verhältnis 1,8-2,0) Plasmid-Konstrukte, welche die Sequenzen für miniSOG und mCherry tagged Reparaturproteine gemß dem Protokoll des Herstellers des Transfektionsreagenz 19. Die miniSOG Expressionsplasmide können vom Tsien-Lab bestellt werden: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
- Sortieren der Zellen, die das rekombinante Protein mit der miniSOG und mCherry tag exprimiert durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zwei Tage nach der Transfektion. Sammeln Zellenmit Zwischenfluoreszenzintensität, um die Zellen, die überexprimiert werden 20 zu vermeiden.
- Kultur die positiven Zellen auf einer 10 cm-Schale in 10 ml DMEM-Medium, das mit 10% FBS und 0,6 ug / ml des Selektionsmittel G418 (Geneticin) ergänzt wird.
- Nach sichtbare Kolonien auf den Platten entstanden, Bildschirm mCherry positiven Kolonien mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop und ziehen Kreise um sie herum (auf der Unterseite der Platte) mit einem Permanentmarker. Verwenden Sie ein geringer Vergrößerung Luft Objektiv (zB 10-fach) und Pick-Klonen unter Verwendung einer sterilen Technik durch vorsichtiges Kratzen die Kolonien aus und langsam saugen sie in eine sterile 1,000 ul Pipettenspitze.
- Erweitern Sie die ausgewählten Kolonien und frieren Teile davon nach unten unter Verwendung des in Schritt 1.1 mit 10% Dimethylsulfoxid ergänzt beschriebene Wachstumsmedium. Testen Sie die Zellen für die DRF-Bildung durch den Anbau von ihnen auf sterile 18 x 18 mm 2 Deckgläsern und bei denen sie2 Gy von Strahlung. Die bestrahlten Zellen stabil exprimiert eine miniSOG mCherry getaggt Reparaturprotein muss die typische Brennmuster charakteristisch DSBs, wenn sie mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung von zum Abbilden mCherry ein Filter-Set sichtbar zu zeigen.
2. Zellkultur
- Kultur U2OS-Zellen, die die miniSOG und mCherry tagged Reparaturproteine unter den in Stufe 1.1 angegebenen Bedingungen. Wachsen Zellen auf 80% Konfluenz in einer 35 mm Durchmesser Glasbodenschale mit 2 ml DMEM. Stellen Sie sicher, dass der Leim, der das Deckglas auf den Kunststoff und die verwendeten Kunststoffisst ist beständig gegen wässrigen und alkoholischen Lösungen und beständig gegen das verwendete Harz!
- Vor der Durchführung des Experiments, umreißen eine kleine Fläche von etwa 1 mm 2, die Zellen, die die ektopische Proteine durch Kratzen mit einem sterilen Diamantfeder mit einem Fluoreszenzmikroskop, um den Bereich von Interesse zu identifizieren enthält. Alternativ verwenden Sie eine Bodenschale Glas tKappe enthält eine Deckglas mit einer vorgeätzten Gittersystem in das Deckglas aufgebaut.
HINWEIS: Bei Verwendung von hochwertigen korrelative Mikroskopie kombiniert ESI und fluoreszenzmikroskopische Bilder 21, stellen Sie sicher, dass die Dicke des Deckglases mit Ölimmersionsobjektiven kompatibel ist. Es sollte die Dicke No. 1,5 (0,16 bis 0,18 mm). Wählen Sie einen Bereich in der Nähe der Mitte der Schale für die Region im TEM, um untersucht, um Probleme mit der Polymerisation des Harzes, das in der Nähe der Kanten auftreten können, zu vermeiden (siehe Punkt 4,10-4,13).
3. DNA Damage Induction
- Bestrahlen der Zellen mit Gamma-Strahlung, mit einem radiomime Arzneimittel oder induzieren die Schäden, die durch die Lasermikro Bestrahlung auf einem konfokalen Mikroskop (zB wie in 18,22 bzw. 23 beschrieben).
- In diesem Beispiel Bestrahlung der Zellen mit 2 und 6 Gy Gammastrahlung in einer Cäsium-137-Strahlungsquelle oder Laser microirradiate wird bei 405 nm solid Laser aus einem konfokalen Mikroskop nach Sensibilisierung der Zellen für 20 min mit 0,5 & mgr; g / ml Hoechst.
4. Probenvorbereitung
- Befestigen Sie die Zellen mit 1 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 M VORSICHT Natriumcacodylatpuffer oder in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, für 30 min bei RT im Dunkeln.
ACHTUNG: Paraformaldehyd und Natriumcacodylat sind giftig! Tragen Sie Handschuhe und entsorgen Sie die giftigen Substanzen ausreichend. - Mit 4 ml 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer, pH 7,4 oder Phosphatpuffer, pH 7,4, die Zellen werden zweimal.
- Behandeln Sie die fixierten Zellen mit 2 ml 50 mM Glycin, 5 mM Aminotriazol und 10 mM Kaliumcyanid VORSICHT in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer oder 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) (überprüfen Sie den pH-Wert!) Für 30 Minuten, um zu blockieren nicht umgesetzte Aldehyd-Gruppen und die vom Häm-Gruppen erzeugt reaktive Sauerstoffspezies zu unterdrücken, die den Hintergrund erhöhen können.
ACHTUNG: Kaliumcyanid ist extrem giftig! WOhr Handschuhe, arbeiten unter einer Haube und entsorgen Sie die giftigen Substanzen ausreichend. Die Reaktion ist sehr empfindlich gegenüber pH so ist es wichtig, dass der pH-Wert überprüft und genau. - Nehmen Sie den Bereich, der in Schritt 2.2 in 2D oder 3D auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop ausgewählt wurde, wenn die korrelative Mikroskopie gewünscht wird.
- Bereiten Sie eine 1 mg / ml Diaminobenzidin-Hydrochlorid VORSICHT Lösung, indem ein 10 mg Diaminobenzidin Hydrochlorid-Tabletten in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Add 980 ul destilliertem H 2 O und 20 & mgr; l konzentrierte Salzsäure (11,65 M) zugegeben und gemischt, bis die Lösung hellbraun und transparent. Verdünnen dieser Lösung in 0,1 M Phosphat oder 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml, während der pH mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert zwischen 7,0 und 7,6 (pH-Wert 7,4 wird empfohlen).
ACHTUNG: Diaminobenzidin ist giftig! Tragen Sie Handschuhe und entsorgen Sie die giftigen Substanzen ausreichend. - Für Photooxidation, replace der Puffer mit 2 ml einer 1 mg / ml Diaminobenzidin Hydrochlorid-Lösung in 0,1 M Natriumkakodylat oder Phosphatpuffer. Schützen Sie diese Lösung vor Licht und abkühlen lassen auf Eis bis 4 ° C, um die Löslichkeit von Sauerstoff zu erhöhen. Sättigt die Lösung mit Sauerstoff durch Einblasen von Sauerstoff durch die Lösung (mit einem Schlauch, der in die Lösung eingelegt und mit einer Sauerstoffflasche angeschlossen). Überprüfen Sie den pH-Wert wieder, gegebenenfalls einstellen.
Hinweis: Es ist wichtig für die Photooxidationsreaktion, dass der pH zwischen pH 7,0 und pH 7,6. - Montieren Sie den Teller mit den fixierten Zellen vorsichtig auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit einem 40x Ölimmersionsobjektiv Objektiv ausgestattet und verschieben Sie sie in den Bereich von Interesse. Erregen die miniSOG Tag mit blauem Licht durch die Verwendung von Filterwürfel für GFP oder GFP. MiniSOG weist ein Anregungsmaximum bei 448 nm mit einer Schulter bei 473 nm 10.
- Fahren Sie mit der Beleuchtung auch nach der grünen Fluoreszenz miniSOG haist völlig verschwunden, und bis die braune Photooxidationsprodukt des polymerisiert Diaminobenzidin tritt in dem übertragenen Lichtkanal. Wenn das Oxidationsprodukt ist in den meisten der Zellen sichtbar ist, schalten Sie die Fluoreszenzbeleuchtung, um die Photooxidation zu stoppen.
HINWEIS: Die Photooxidation kann bis zu mehreren Minuten, abhängig von der Objektivlinse, Filter Übertragungswellenlängen und die Effizienz und der Beleuchtungsquelle zu nehmen. - Postfix die Zellen mit 1 ml von 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, pH 7,4 oder Phosphatpuffer pH 7.4 für 30 min.
- Fixierung der Membranen der Zellen mit 0,1% -0,5% Osmiumtetroxid 20 min in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer, pH 7,4 oder in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4.
HINWEIS: Es wird empfohlen, eine möglichst geringe Konzentration von Osmiumtetroxid erforderlich, um die Membranen zu stabilisieren, zu verwenden. Da die polymerisierten DAB Ausscheidungen haben eine hohe Dichte von Stickstoff, die durch ESI, einer starken direkt nachgewiesen werden kannOsmium Färbung ist nicht notwendig, die miniSOG-markierte Protein zu identifizieren und möglicherweise schädlich für die ESI sein. Osmiumtetroxid ist sehr giftig! Arbeiten Sie in einem Abzug und entsorgen Sie die giftigen Abfälle angemessen. - Dehydratisieren, die Zellen durch eine Ethanolreihe unter Verwendung von 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% Ethanol Schritten (jeweils 5 min). Anschließend Inkubation der Zellen in einem 1: 1-Mischung aus 100% Ethanol und Acrylharz (LR weiß) und die Schüssel auf einem Schüttler für 4 Stunden, um die Infiltration in die Zellen vor der Inkubation der Zellen für mindestens einen weiteren 4 h in 100 zu erleichtern % Acrylharz (LR weiß).
- Um das Harz zu polymerisieren, schneiden Sie den Deckel eines markierten 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Rasierklinge und Mantel die Felge mit Acrylharz-Beschleuniger. Sicherzustellen, dass der Beschleuniger nur den Rand und nicht in das Rohr fließen. Anschließend vorsichtig den Schlauch zu füllen etwa zwei Drittel mit LR Weiß Harz mit einer Pasteurpipette. Darauf achten, dass das Harz nicht in Kontakt zu bekommen with der Beschleuniger auf den Rand!
- Entfernen Sie das Harz, das die Zellen in der Schale unterwandert und die Schale auf den Kopf auf die aufrecht stehenden Mikrozentrifugenröhrchen, so dass die Breite des Rohres nahezu vollständig füllt das Glas abgedeckt Beobachtungsfenster der Schale.
- Warten 1-2 min für das Gaspedal, um das Rohr und das Deckglas zu versiegeln, wird das Röhrchen, so dass das Harz in dem Röhrchen umfasst nun die Zellen.
- Die Schale mit dem Rohr in einem Ofen bei 60 ° C und heilen 12 Stunden.
- Wenn der Block ausgehärtet ist, entfernen Sie die Schale mit dem beigefügten harzgefüllten Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Ofen und trennen die Mikrozentrifugenröhrchen aus der Schale. Erleichtern die Trennung durch Auftauen und Einfrieren in flüssigem Stickstoff und heißem Wasser.
- Entsorgen Sie die Bodenschale Glas und schneiden Sie vorsichtig öffnen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Rasierklinge, um den Block zu entfernen.
- Beschriften Sie den Block mit einem Permanentmarker.
- Verwenden einer Rasierklinge bis dreim die Block, so dass nur das 1 mm 2 Region, die zuvor mit dem Diamant oder Wolfram Stift markiert Bereich enthält (oder enthält die Fläche mit den Zellen von Interesse) bleibt.
- Montieren Sie den Block in einem Ultramikrotom, schneiden Sie den Block mit einem Schneidmesser und Schnittultradünnschnitten von ca. 50 nm mit einem Diamantmesser.
- Pick-up die Abschnitte über die High-Getriebe 300 Maschengitter. Diese Gitter haben sehr kleine Gitterstäbe und decken damit weniger Zellen im Bereich von Interesse.
- Beschichten der Abschnitte über die Netze mit etwa 0,2-0,4 nm aus Kohlenstoff mit einer Kohlenstoffbeschichtung auf die Stabilisierung sie unter dem Elektronenstrahl des TEM.
5. Elektronenmikroskopie
- Laden Sie die Gitter in eine TEM, die mit einem Energiefilter ausgestattet ist. Nach Einstellen des Mikroskops und der Energiefilter nach den Anweisungen des Herstellers, kontrollieren die Zellen an den Abschnitten in geringen Vergrößerungsmodus (Normalübertragung) und vergleichensie Daten Fluoreszenz, wenn entsprechende (im Schritt 4.4) erhaltenen.
- Einmal im Zellkern mit interessanten Features (DNA-Schaden verfolgen oder DNA-Reparatur-Foci) gefunden wird, wechseln Sie zu dem Energiefilterung-Modus und nehmen eine Dicke Karte.
Hinweis: Dieses Verfahren beinhaltet die Eintragung einer Null-Verlust und ein ungefiltertes Bild. Dicken bis zu 0,3 mittlere freie Weglänge (30% der Elektronen des einfallenden Strahls wird von der Probe gestreut) sind dünn genug, um gute Elementar Karten zu erzeugen. - Rekordquote Karten der Elemente Phosphor und Stickstoff mit der Software, die die Energiefilter des Mikroskops verwendet, steuert. Notieren Sie die Phosphor-Karte Postkantenbilder bei 175 eV Energieverlust mit einer Schlitzbreite von 20 eV und Pre-Kantenbilder bei 120 eV Energieverlust, auch mit einer Schlitzbreite von 20 eV. Für die Stickstoff Karten, Rekord Beitrag Kantenbilder bei 447 eV mit einer Schlitzbreite von 35 eV und Pre-Kantenbilder bei 358 eV, auch mit einer Schlitzbreite von 35 eV.
Hinweis: Da der Inhalt der abgebildeten Elemente (phosphOrus und Stickstoff) ist relativ niedrig (ca. 1%), wählen Sie "Ratio-Bild" (qualitative Elementar Karte) über die "3-Fenster-Methode" (quantitativ zu elementarem Karte), um Bilder mit einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis zu erzeugen.
6. Bildverarbeitung
- Öffnen Sie die Elementverhältnis Karten in einer Bildverarbeitungssoftware, die das Dateiformat der erworbenen Bilder (zB Digital Micrograph) verarbeiten kann. Kopieren Sie die Stickstoff-Karte in den roten Kanal und dem Phosphor-Karte in den grünen Kanal eines RGB-Bildes, so zu überlagern und die Karten auszurichten.
- Exportieren Sie das zusammengesetzte Bild als Tagged Image File Format (TIFF) Datei. Öffnen Sie das Bild in einem Bildbearbeitungssoftware, die Schichten verwenden können (zB Photoshop).
- Die Dynamikbereich jedes Kanals durch Neuskalierung der minimalen und maximalen Werte in dem Bild, um eine 8-Bit-Datensatzes (0 bis 255).
- Subtrahieren Sie die Phosphorgehalt aus dem Stickstoff Karte (mit demFenster "Layers"), um eine Karte oder die die Verteilung von Protein zeigt generieren.
- Konvertieren Sie die Karten der Nukleinsäure (Phosphor) und des Proteins (Stickstoff) im vorherigen Schritt in die "Indexfarben" erstellt und eine gelbe Lookup-Tabelle im CMYK-Farbraum für die Karte, die die Nukleinsäure Verteilung und eine Cyan-Lookup-Tabelle zu erstellen um die nicht-Nukleoprotein Karte anzuzeigen. Die Farben werden gewählt, um maximalen Kontrast zwischen den beiden elementaren Karten zu erzeugen.
- Erstellen Sie ein neues Bild, und importieren Sie die Karten, die die Verteilungen von Phosphor und Protein als verschiedene Schichten. Verwenden Sie die "Bildschirm" Transparenz-Modus, um die beiden Schichten übereinander zu sehen.
- Öffnen Sie die Zero-Loss-Bild in Schritt 5.2 erworben. Diese Abbildung stellt ein Bild des aufgezeichneten Bereichs, der wie eine herkömmliche Bild TEM sieht, enthält jedoch nur die Elektronen, die durch die Probe ohne Kollision mit der Probe durchlaufen haben. ExportDieses Bild als TIFF-Bild.
- Öffnen Sie die exportierte Bildnullverlust in einem Foto-Editor und kopieren Sie sie in der obersten Schicht des Bildes, das die elementaren Karte. Richten Sie das Bild mit der "screen" Transparenz-Modus.
- Optional Schwelle der Nullverlust Bild zu segmentieren das Signal, das von der miniSOG stammt. Als separate Schicht In das resultierende Bild, wie oben beschrieben.
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Representative Results
ESI
Vergleichen der ESI Bilder des Kerns (1) mit den üblichen TEM-Bilder (zB Bild 7-1) zeigt eine dramatische Zunahme der anatomischen Strukturen, die leicht unterschieden werden können. Die Chromatin Rücken erscheinen gelb und es ist ganz einfach, die Chromozentren in Mauszellen zu identifizieren. Kernkörperchen leicht von Chromatin durch ihre runde Struktur und unterschiedliche Farbe unterschieden werden, da die vormontierte Ribosomen hohe Mengen an Protein, das reich an Stickstoff ist, zusätzlich zu der RNA, die reich an Phosphor enthalten bereits. Die periphere Chromatin wohnen, als eine dünne Schicht an der Grenze zwischen dem Kern und Kernporen als stickstoffreichen Strukturen, die den peripheren Chromatin brechen sehen. Oft ist die Lamina kann als eine sehr dünne blaue Schicht außerhalb des peripheren Chromatins zu sehen. Im Zytoplasma, viele kleine Partikel reich an Phosphorgesehen werden. Diese können als Ribosomen auf der Grundlage ihrer Größe, Häufigkeit und Ort außerhalb des Zellkerns identifiziert werden. Die interchromatin Raum kann als proteinreiches Gebiet zwischen dem Chromatin entfernt gesehen werden. Diese enthält nuklearen Einrichtungen und Bereiche reich an kleinen gelben Signale, wie Ribonukleoproteinpartikel und Cluster von Ribonukleoprotein Granulate (Abbildung 2). Letztere interchromatin Granulat Cluster bezeichnet und sind in charakteristischer Weise in Proteinen für pre-mRNA-Spleißen. 1B, C und D veranschaulichen das Aussehen von anderen bekannten Strukturen wie mitotischen Chromosomen Zentrosomen, Mitochondrien und Romeren erforderlich angereichert. In Abbildung 2 sind die verwendeten gefärbten Verbundbilder aus den Ausgangselementverhältnis Karten erzeugen Schritten zusammengefasst. Zusammenlegung der Phosphor-Karte (Grün) und den Stickstoff Karte (rot) im RGB-Farbraum (obere Reihe) ermöglicht eine bessere Einschätzung der Mengen dieser Elemente in der Probe. However, Subtrahieren des Phosphorsignals, um den Beitrag der nukleinsäurehaltige Strukturen aus dem Stickstoff der Karte gelöscht werden, damit das Protein Karte (cyan) und Zusammenführung mit dem Phosphor Karte (gelb) in CYMK Farbraum Ausbeute liefert eine deutliche visuelle Darstellung der Nukleoprotein und nicht-Nukleoprotein (untere Reihe). Dies ermöglicht die Daten leichter von Personen nicht mit der Technik interpretiert werden.
Laser microirradiated Zellen, MDC1, 53BP1 und Rad52
Aufgrund der benutzerdefinierten Größe, Form und Lage der Laserschadensbahnen, die Umgebung von DAB Abscheidung in den Laser microirradiated Zellen sind sehr einfach in der TEM finden bei Verwendung der miniSOG Systems. Bilder in niedriger Vergrßerung Übertragungsmodus (dh konventionelle Hell TEM) genommen zeigen die charakteristischen Schadensbahnen und mit Daten, die mit einem Fluoreszenzmikroskop vor dem Einbetten aufgezeichnet wurde, verglichen werden.Dies ist besonders nützlich, wenn die korrelative Mikroskopie soll, da es eine einfache Identifizierung und Verlagerung von einzelnen Kernen. (Abbildung 2-4).
Das erste Beispiel (Figur 3) zeigt U2OS-Zelllinie stabil exprimiert MDC1 miniSOG-mCherry. In einem Laser microirradiation Experiment wurde die Rekrutierung der MDC1 enthaltend die miniSOG und mChrerry Tags war sehr ähnlich dem GFP-markierten Versionen dieser Protein (Daten nicht gezeigt). Fixieren der Zellen 1 Stunde nach DNA-Schäden Induktion und der Probenvorbereitung für die TEM wurden die MDC1 Schadensbahnen leicht in den Ultradünnschnitten im normalen TEM-Modus als dunkle Streifen über den Kernen, die sehr gut zu den Fluoreszenzdaten entsprachen identifiziert ( Abbildung 3-5). Beim Blick auf die Verteilung des Proteins konnte eine deutliche Steigerung der Stickstoff Signal an den Laser-geschädigten Stellen beobachtet werden. Es hat Stelle sei darauf hingewiesen, dass dies in erster Linie durch das polymerisierte diami verursacht werden nobenzidine, das reich an Stickstoff und verstärkt das Signal des miniSOG tagged Reparaturprotein, anstatt allein durch die Anhäufung von Reparaturproteinen im Schadensspur. Vergleichen der Chromatinstruktur in dem Rest der Kern mit der Struktur in der Schadensbahnen zeigt einen deutlichen Unterschied. Der beschädigte Chromatin (das heißt innerhalb der gestrichelten Linien in Figur 3 gezeigt) angezeigt wird mehr im Gegensatz zu der nicht-bestrahlten Chromatin, das im dicken Rippen im Kernplasma tritt dekondensiert. Innerhalb der Schadensbahnen könnten Kernkörper (200-300 nm) (durch Pfeile in 3 II2, IIb, IIc und IIIa hervorgehoben), die von Nukleinsäure reich an MDC1-miniSOG Protein, aber frei sind ebenfalls zu beachten. Es wäre sehr schwierig, diese Kernkörpern als Chromatin freien Strukturen ohne diese Technik zu definieren. Sie schlägt außerdem ein zusätzlicher Grad an Komplexität auf Schadstellen, die nicht durch die bekannte Biochemie MDC1 vorhergesagt wird.
ntent "> Mit Blick auf die Schadensbahnen von 53BP1 (Abbildung 4), die unter den gleichen Bedingungen wie die vorstehend beschriebene Beschädigung MDC1 transfizierten Zellen erzeugt wurden, können sehr ähnliche Ergebnisse beobachtet. Das Signal, das durch die Photooxidation hergestellt werden die miniSOG war überfüllt und füllte den Raum zwischen den Falten des Chromatins. stark verschmutzt Kernkörper könnte auch beobachtet werden (durch einen Pfeil in Abbildung 4 D, E, F hervorgehoben).Aus Experimenten mit Rad52-GFP-Konstrukte, ist bekannt, dass Rad52 werden kleine helle microcompartements bilden 24 entlang einer laserinduzierten Schäden Track. Aufgrund der Auflösungsgrenze des konventionellen Lichtmikroskopen war es unklar, wie groß diese Strukturen wirklich sind und wie sie sich auf die beschädigte DNA beziehen. Mit Blick auf die TEM-Bild von laserbestrahlten U2OS Kerne konstitutiv Rad52-miniSOG-mCherry wurden die Größe dieser Stellen gemessen werden, um im Durchschnitt (150-250 nm) sein. es istumso überraschender, um an diesen Brennpunkten mit ESI aussehen. Im Gegensatz zu den vorherigen Beispielen wurden die Rad52-Foci miniSOG-mCherry scheinen entlang der Beschädigung Bahn sehr unterschiedlich aufgebaut sein und scheinen kompakte Kernkörperartige Strukturen, die von Proteinen zusammengesetzt sind und keine detektierbaren Nucleinsäuren in ihrem Inneren zu sein. Basierend auf Blick auf die Nukleinsäure / Protein-Verhältnis in die beschädigten Bereiche mit unseren kombinierten miniSOG und ESI-Ansatz erhalten, schlagen wir vor, dass die DNA-Reparatur kann an der Oberfläche der Herde und nicht im Inneren zu nehmen.
Das untere Bild in Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse ähnlich wie 3-III Abbildung. Das Chromatin in den beschädigten Bereich scheint mehr verglichen mit dem Chromatin in den nicht-bestrahlten Bereiche (siehe Bereich durch rote Striche skizziert) dekondensiert werden.
Gamma bestrahlten Zellen
Während Laser-Mikro-Bestrahlung ist ein praktisches Tool, um quickly Testproteine, die einen Fluoreszenzmarker für die Rekrutierung zu Websites von DNA-Läsionen enthalten, erstellt es große Mengen an komplexen Schaden (Doppelstrangbrüche, Einzelstrangbrüche, Grundschaden und cyclopyrimidine Dimere) 25. Um die Kammern, die sich um DNA-Doppelstrangbrüche mehr bilden direkt zu untersuchen, untersuchten wir DRFs die um einzelne DSBen bilden durch Aussetzen von Zellen gegenüber Gammastrahlung.
U2OS-Zellen, die stabil exprimieren 53BP1-miniSOG-mCherry wurden in 2 Gy Gammastrahlung ausgesetzt und fixiert eine halbe Stunde nach der Bestrahlung. Das charakteristische Muster von großen Herde gesamten Nukleoplasma verteilt beobachtet werden (Abbildung 6Ia). Nach Photooxidation von Diaminobenzidin könnte dunkle Flecken Schwellen an den Positionen, wo die fluoreszierenden mCherry Signale wurden in Fluoreszenzaufnahmen liegt in den elektronenmikroskopischen Aufnahmen (Fig 6Ib und c) zu sehen. Diese Punkte könnten korreliert, um Bilder TEM werdendaß wurden bei geringer Vergrößerung (Abbildung 6Id und e) gemacht. ESI Bilder dieser Herde, was etwa 1-1,5 & mgr; m im Durchmesser zu sein schien, zeigten eine interessante Struktur. Dünne Stränge aus Chromatin schien mit 53BP1 Protein von etwa der doppelten Dicke durchsetzt sein.
In anderen Experimenten wurden die Zellen auf eine höhere Menge an Strahlung, belichtet und zu späteren Zeitpunkten (nach 3 h und 6 h zugeführt), um größere Foci zu erzeugen und erleichtert ihre Lokalisierung in ultra-dünnen Abschnitte (7) befestigt ist. Weil wir in der Lage, gesondert Karte Nukleoprotein und Protein, ESI zeigt, dass die Struktur der Brennpunkte erscheinen im Laufe der Zeit zu reorganisieren. Die relative Menge an Protein 53BP1 im Fokus scheint zu erhöhen, während das Chromatin nimmt eine Umfangsposition.
Seit 53BP1 Brennpunkte auch erscheinen nicht bestrahlten Zellen als "kryptischen Foci" in G1-Zellen an Stellen unter replizierend DNA 26,27 wurden diese Schwerpunkte auch abgebildet. Diese kryptischen Foci scheinen große Mengen an Protein, bezogen auf das strahlungsinduzierte Foci beherbergen und zeigen eine interessante regelmäßige Struktur von Chromatin.
Somit Visualisierung DNA-Reparatur-Foci Bestandteile mit dem miniSOG Methode hilft, Regionen von DNA-Schäden zu identifizieren und die Verteilung des markierten Reparaturprotein, bezogen auf das Chromatin abzubilden.
Abbildung 1. Übersicht über die Strukturen, die in einer ESI Bild beobachtet werden kann Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
(A) ESI Bild einer embryonalen Maus-Fibroblasten. Chromatin Rippen (gelb) werden durch Kernplasma (cyan) Auffüllen des interchromatin sp umgebenAss. Der Kern wird durch periphere Heterochromatin und Chromozentren (unten links), die von Kernporenkomplexe (cyan) unterbrochen sind, umgeben. Die Nukleolen durch ihre Farbe klar getrennt werden. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass Proteinmenge relativ zu Nukleinsäure in dem nucleolar Struktur höher als in Chromatin. Außerhalb des Kerns kann Mitochondrien und Ribosomen (reich an Nukleinsäure) leicht identifiziert werden.
(B) Aufnahme eines Zellkerns, Zentrosomen (siehe Pfeile), die als Hohlproteinreichen Teilchen in der oberen linken Seite des Bildes zu sehen ist.
(C) Querschnitt durch eine Metaphaseplatte. Die hochkondensierten Metaphasechromosomen haben auf eine Festplatte, die von der linken oberen Ecke auf der linken unteren Ecke erstreckt ausgerichtet sind. Hohe Konzentrationen von Stickstoff an der Oberfläche einiger Chromosomen sichtbar. Diese Bereiche sind die Kinetochoren (siehe Pfeile).
(Obere Reihe) Die ersten beiden Bilder in der Reihe zeigen die Verhältnis Karten von Phosphor und Stickstoff. Das letzte Bild in der oberen Reihe zeigt diese elementaren Karten im RGB-Farbraum überlagert. Gelbe Strukturen stellen Nukleoproteine, was auf die Anwesenheit von sowohl Phosphor als auch Stickstoff enthält. (Untere Reihe) Das erste Bild zeigt die Phosphor-Karte, die in erster Linie zeigt die Verteilung der Nukleinsäure in der Probe. Das mittlere Bild zeigt die Verteilung der Nukleinsäure-verarmte / negativ stru ctures. Es wurde durch Subtraktion der Phosphor Karte aus dem Stickstoff Karte berechnet. Die untere rechte Bild zeigt eine Zusammenführung der Nukleinsäure Karte und dem Protein Karte in der subtraktiven Farbraum. Diese Farbzusammensetzung zu verwenden, um bei der Identifizierung von einzelnen Strukturen zu unterstützen und sie als Nukleoprotein klassifizieren ist oder nicht Nukleoprotein werden. Die quantitative Informationen über die Phosphor- und Stickstofffluss visuell aus dem Netz Phosphor und Stickstoff Nettograustufenkarten oder aus Verbundwerkstoffen unter Verwendung von additiven Farben, wie zum Beispiel in der oberen Reihe erzeugt gesammelt werden. 
Abbildung 2. Erstellung einer mehrfarbigen ESI Bild 
Abbildung 3. Laser Mikro-Bestrahlung von U2OS-Zellen stabil exprimiert MDC1-miniSOG-mCherry. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
(II) Das Gebiet, durch ein grünes Quadrat in Ic hervorgehoben wurde vergrößert und im normalen Sendebetrieb (IIa) und ESI (IIb) dargestellt. IIc zeigt eine Überlagerung der ESI-Bild mit dem Signal des Schadens Strecke. Der Schaden Spursignal wurde durch Schwellen das obere Bild erhalten.
(III) Beispiele für die Struktur der Laser-Mikro-irradiated Chromatin Chromatin und außerhalb des laser beschädigten Bereich.
Abbildung 4. Laser Mikro-Bestrahlung von Zellen stabil exprimiert 53BP1-miniSOG-mCherry. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Linke Spalte: (A) Fluoreszenz, (B) Konventionelle TEM und (C) ESI Bild der gleichen Lasermikro bestrahlt Kern.
Rechte Spalte: (D) Konventionelle TEM, (E) und ESI (F) Überlagerung des Bildes mit der ESI miniSOG Signal, das von der Schwellenwertbildung (D) segmentiert wurde (siehe Schritt 6.10)
Abbildung 5. U2OS Zellinie stabil exprimieren Rad52-miniSOG-mCherry und durch Laser-Mikro-Bestrahlung beschädigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
(A) Überlagerung eines Fluoreszenzbildes mit einem schwachen Vergrößerungs TEM-Bild, das eine Laser microirradiated U2OS Kern mit einem Schadens Spur an der unteren linken Seite.
(B) Repräsentative konfokaler Fluoreszenzmikroskopie Bild eines Lasermikro bestrahlt Hoechst-gefärbte Zellkern (blau) zum Ausdruck Rad52-miniSOG-mCherry zeigt das charakteristische Muster der kleinen Herde entlang der Schadensspur (rotes Signal).
(C) Konventionelle TEM, (D) ESI,
(G) ESI Bild einer anderen U2OS Kern stabil exprimieren Rad52-miniSOG-mCherry welche einen laserinduzierten Schäden Spur im Kontext des gesamten Kerns.
Abbildung 6. U2OS-Zellen stabil exprimiert 53BP1-miniSOG-mCherry bestrahlt mit 2 Gy und nach 30 Minuten festgelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
(I) a) Im Fluoreszenzbild, das den Gamma-Bestrahlung induzierte 53BP1 Brennpunkte. b) Lichtbild übertragen, nachdem die Photopolymerisation. c) Overlay der Fluoreszenz mit dem übertragenen Lichtbild. d) Bild mit geringer Vergrößerung TEM (der schwarze Streifen ist ein TEM-Gitter bar). e) Überlagerung der Fluoreszenzbild mit dem Bild geringer Vergrößerung TEM.
(II) Damage Fokus mit einem Stern in der Durchlichtbild im Normal TEM und im ESI-Modus aufgezeichnet beschriftet. a) eine verlustfreie, b) ESI, c) Phosphor, d) Protein e) ESI Overlay bzw. Segmentsignal von der verlustfreie Bild.
(III) Damage Fokus mit einem Kreuz in der Fluoreszenzbild im Normal TEM und im ESI-Modus aufgezeichnet beschriftet. a) eine verlustfreie, b) ESI, c) Phosphor, d) Protein e) ESI Overlay bzw. Segmentsignal von der verlustfreie Bild.
Abbildung 7. Änderungen der Brennpunkte Struktur zwischen Brennpunkten nach unterschiedlichen Zeiten der Bestrahlung. < / strong> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
U2OS 53BP1 miniSOG mCherry Zellen bis 6 Gy des nach 3H (1A-E, FJ) und 6h (2A-E, FJ) jeweils befestigt Gammabestrahlung ausgesetzt ist. 3 zeigt ein unbestrahltes U2OS 53BP1 miniSOG mCherry Kern zeigt eine kryptische Fokus (AE). ESI Bilder werden in der Reihenfolge ESI (Nukleinsäuren und Proteinen), Nukleinsäure (allein), Eiweiß (allein), ESI (Nukleinsäuren und Proteinen) vorgestellt + segmentiert miniSOG Signal.
Abbildung 8. DNA-Reparatur-Foci sind immer noch in der konventionellen Übertragungsmodus sichtbar, wenn Post Fixierung mit Osmiumtetroxid wird weggelassen. arge.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ultradünnschnitt (50 nm) eines U2OS Kern zeigt zwei 53BP1 Herde aus einer Probe, die nicht mit Osmiumtetroxid behandelt wurde. (A) Bei der konventionellen TEM-Mode, ist es möglich, Webseiten, durch die DAB-Polymer gebeizt auch ohne Verbesserung Kontrast mit dem zu sehen Heavy-Metal-Fleck. (B) Der Kontrast der Brennpunkte kann durch Einnahme von Zero-Loss-Bilder (Filterung entfernt alle Elektronen, die Herkunft von mehreren Streuereignisse) verbessert werden.
Abbildung 9. Ermittlung der optimalen Energiefenster-Einstellungen für das Mapping Phosphor
(A) Elementarverhältnis Karte für Phosphor mit Post Kante bei 155 eV und Pre-Kante bei 120 eV aufgenommen.
Inhalt "> (B) Elementarverhältnis Karte für Phosphor mit Post Kante bei 175 eV und Pre-Kante aufgezeichnet bei 120 eV.(C) Berechnen Phosphor-Verhältnis Karten von einem konstanten vorgeRandFenster bei 120 eV Energieverlust und einer variablen post-Rand-Fenster von 140-200eV Energieverlust, um die Kombination, die am besten in Kontrast zu bestimmen. Der Intensitätsunterschied der hellsten und der dimmestpixel in einer Zeilen die sich über die gleiche Phosphor reichen und Phosphor armen Region zeigt höchste Kontrastwerte (Dynamikbereich), wenn ein Post-Randbild von 175 eV Energieverlust wurde gewählt.
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Discussion
ESI kann als ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Prüfung verschiedener Zustände des Chromatins und Ribonukleoproteine im Kern, weil es in der Lage, speziell map Bereiche, die reich an Phosphor sind, ist zu dienen. Erhöht es grundlegend die Menge an Details, die mittels eines Elektronenmikroskops erhalten werden kann, und ist nicht abhängig von unspezifischen Kontrastverfahren. Ein Nachteil ist, dass es ESI dünneren Abschnitten als herkömmliche TEM gleichzeitig Beschleunigungsspannung erfordert. Dies kann durch die Arbeit mit Serienschnitten oder mit tomographischen Methoden 28 überwunden werden.
Interessen Obwohl eine Vielzahl von Informationen kann, indem man die Verteilungen von Phosphor und Stickstoff erhalten werden, ist es in der Lage, auch Karte der Verteilung bestimmter Proteine zu sein. Mit dem Verfahren in diesem Papier wurde gezeigt, dass ESI kann mit Methoden, die auf der ortsspezifischen Polymerisation von Diaminobenzidin basieren kombiniert werden. Obwohl diese Methode keinen fu hinzufügenll neue Farbe ESI, ist es natürlich hilfreich, um die Verteilung eines Proteins zuzuordnen. Dies gilt insbesondere für Proteine, die mit dem Chromatin wechselwirken. Wenn eine Studie muss mehr als ein Protein Bevölkerung sichtbar zu machen, können die Markierungsverfahren unter Verwendung von Immun immer noch verwendet werden, wenn als Pre-Einbettung Färbung vor Photooxidation 9 angelegt, werden. Verglichen, um stabile Zelllinien haben transienten Transfektionen den Nachteil, dass die Expressionsniveaus signifikant zwischen den Zellen variieren und damit schwer zu mehreren Zellen, die ähnliche Mengen des markierten Proteins zu finden. Daher wird die Erzeugung stabiler Zelllinien empfohlen. Es ist jedoch möglich, die relative Menge von Protein-Expression zu beurteilen durch Fluoreszenz-Bildgebung und wählen Zellen mit Zwischenausdruck nach transienter Transfektion.
Obwohl die miniSOG Fusion-Tag selbst fluoreszierend, ist seine Quantenausbeute deutlich schlechter als GFP (0,37 vs. 0,6) 10. Für die purpose korrelative Mikroskopie, das Hinzufügen eines zusätzlichen fluoreszierenden Protein-Tag wie mCherry ermöglicht die Abbildung in den lebenden Zellen ohne die Produktion von Singulett-Sauerstoff, die mit miniSOG Anregung auftritt. Das Expressionsniveau der miniSOG-markierten Proteinen kann die Menge an Sauerstoff in der DAB-Puffer, und der pH-Wert auch auf die Geschwindigkeit der Photooxidation. Manchmal kann es sehr problematisch sein, homogene Photooxidation in der Region von Interesse, da der Lichtabhängigkeit der Photooxidationsreaktion zu erzielen. Verlängerte Photooxidation kann unspezifische Färbung und die Abscheidung von zu viel Schwermetalle in der Probe, die den Nachweis von elementspezifischen Signalen, die durch ESI komplizieren führen. Die Photooxidationsverfahren ist sehr zeitaufwendig, so dass in der Regel nur eine sehr kleine Region, die wenige Zellen auf dem Deckglas werden üblicherweise gefärbt.
Wir haben gezeigt, die Kombination von miniSOG markierten Proteinen mit ESI Verwendung einer Monoschicht aus einem haftenden huMann Krebszelllinie. Im Prinzip kann das Verfahren auch für eine andere Probe (Hefe, Bakterien, Gewebe, Embryonen), solange es möglich ist, die miniSOG-getaggten Proteins auf einem vernünftigen Niveau und solange Transluzenz und die Diffusion von Sauerstoff auszudrücken und DAB aufgebracht werden ausreichend hoch, um eine ordnungsgemäße Photooxidation und damit homogene Färbung zu ermöglichen. Für Suspensionszellen, wäre es vorteilhaft, die Lage der Zellen, die auf einem Deckglas unter Verwendung eines Klebstoffs, wie etwa Poly-L-Lysin zu fixieren. Für dickere Proben, werden die Ziele mit einem niedrigeren numerischen Apertur eine homogenere Ausleuchtung zu erreichen, aber länger dauern, bis Foto-oxidieren.
., Einschließlich der Verwendung von Osmiumtetroxid - Wir haben die Verwendung der miniSOG-markierte Fusionsproteine, wie in der Nähe des Original-Protokoll von Shu et al 10 als möglich erscheinen dargestellt. Es konnte beobachtet werden, dass, abgesehen von vorzugsweise Ablagern DAB-Polymere und Membranen, Osmiumtetroxid zeigt eine gewisse Reaktivität undAbscheiden auf den meisten biologischen Materials in der Probe (10 3). Osmiumtetroxid eine elementare Kante bei 45 eV. Dieses Signal und sein Plasmonen auf der Elektronenenergieverlustspektrum als die Dicke der Probe zunimmt und einzelne Elektronen beim Durchgang durch die Probe mehrere Energieverlustereignisse durchlaufen überlagert werden. Dies kann die Qualität der elementaren Phosphor Karten zu begrenzen, wenn hoch OsO 4-Konzentrationen werden in der Probenvorbereitung verwendet. Die Konzentrationen, die wir verwendet haben, hier, die deutlich niedriger als was vorher 10 verwendet werden, erlaubt die Erzeugung von guter Qualität Phosphor-Karten. In einem Experiment mit miniSOG markierten Proteinen, die höher OsO 4 Konzentrationen verlangt, wird die beste Konzentration, die noch erlaubt eine gute Phosphor Erstellung von Karten muss empirisch ermittelt werden.
Wir haben festgestellt, dass die DAB-Polymer, das an der DNA-Reparatur-Foci bildende sufficiently dicht, um in konventionellen TEM-Modus zu sehen (oder Zero-Loss-Modus mit noch besseren Kontrast) auch dann, wenn nach der Fixierung mit Osmiumtetroxid weggelassen wird (siehe Abbildung 8). Die Segmentierung der Signale, die auf diese Weise aufgezeichnet wurden, war so stabil wie mit den Proben, die mit Osmium behandelt wurden. In Abhängigkeit von der Zellkernprotein, das sichtbar gemacht werden soll, die Größe der Struktur bildet und die Notwendigkeit, Membransysteme zu visualisieren, die Verwendung von Osmiumtetroxid und nicht unbedingt erforderlich, und ihr Fehlen wird das Potential des Maskierens der Elementar Signatur von Phosphor zu entfernen.
Im Vergleich zu anderen Publikationen mit ESI 18,29,30 haben wir verschiedene Einstellungen für die Pre- und Post-Kantenbilder, um Elementverhältnis Karten mit dem geringsten Lärm zu erzeugen. Wir haben empirisch ermittelt die Einstellungen in der Handschrift präsentiert (siehe Abbildung 9). Die gewählten Einstellungen, um die Kanten sollten führen zu ele korrigierenmentalen Karten außer wenn die Erhebung Fenster sind mit anderen Elementen, die in der Probe vorhanden sind, überlappen. In unserem Fall könnte Schwefel ein solches Element sein. Da die Konzentration von Schwefel (der in der Aminosäuren Methionin und Cystein auftritt) ist sehr gering und trägt zur berechneten Karte nur in einer vernachlässigbaren Menge, glauben wir den besseren S / N-Verhältnis, die wir unter Verwendung der Einstellungen überwiegt die Nachteile welche hier erhalten das könnte von Spuren von Schwefel in der Probe auftreten.
Wir zeigten die Ultrastruktur von DRFs bei Nanometer-Auflösung mit den DNA-Reparaturproteine MDC1, 53BP1 und Rad52 kombiniert mit ESI und TEM-Techniken. Die Organisation des Chromatins und einzelne DSB-Reparatur-Protein-Lokalisierung wurde mit diesem Ansatz gelöst. Deren Lokalisierung in Bereichen, die reich an DNA-Schäden nach Laserbestrahlung Mikro DNA und die Tendenz der Reparatur-Proteine, um den Raum zwischen den Rippen Chromatin Füllen gezeigt. Im Fall von Rad52, die plays eine Rolle bei der homologen Rekombination, die Bildung der Kernkörper artigen sphärischen Strukturen entlang der laser beschädigt Spur beobachtet werden konnte und dies war im Gegensatz zu den beiden anderen getesteten Proteine. Wenn der Schaden durch Gamma-Bestrahlung angewendet wird, gebildet 53BP1 Herde rund um die beschädigten Chromatin. Die relative Zusammensetzung und Lage des Chromatins und Protein in den Brennpunkten scheint mit der Zeit ändern. Die Beziehung zwischen diesen Proteinen und dem beschädigten Chromatin sowie Veränderungen in der Organisation des Chromatins und die Zusammensetzung der Kernkörper können mit dem ESI-Technik während herkömmliche Hellfeldmikroskopie mit Uran und Blei als Kontrastmittel können diese Eigenschaften nicht direkt beurteilen, alle leicht erhalten werden. Somit ist diese Technik zeigt hohes Potential für die Untersuchung von Struktur-Funktions-Beziehungen, insbesondere für auf DNA ablaufenden Vorgänge.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
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