Abstract
极限到光学分辨率和鉴定特定蛋白质种群透射电镜的挑战已经在细胞生物学障碍。许多现象无法通过体外分析在简化的系统进行说明，并且需要额外的结构信息在原位 ，特别是在1毫微米和0.1微米之间的范围内，以便被完全理解。这里，电子光谱成像，透射电子显微技术，允许蛋白质和核酸的分布同时映射，和表达标签，miniSOG，被组合以研究DNA双链断裂修复病灶的结构和组织。
Introduction
尽管近年来在1光学显微镜显著的进步，细胞生物学家仍在遭受分辨率的差距。这限制涉及大分子复合物之间的协调相互作用中基本的细胞过程中的结构-功能关系的了解（例如，在染色质重塑，DNA修复，转录的RNA和DNA复制）。虽然透射电子显微镜（TEM）■提供所要求的分辨率，已经挑战来定义这些过程无法的结构因为标注的特定蛋白质，同时还能够以确定的可视化结构的生化成分。在没有内部的膜，以帮助区分核结构中，核一直特别具有挑战性。电子光谱成像（ESI）通过允许DNA，RNA和PROT的同时检测和分化解决某些限制EIN基核结构2-5。
电子光谱成像：
为了映射以高灵敏度和分辨率在电子显微镜下元素分布，可以用一个图像光谱仪，其选择已通过与元素的在样本 6内壳层电子相互作用非弹性散射电子。因为能量的单元特定的量被丢失原子在试样的电离的结果，这些电子可以被分离并使用被附接到电子显微镜的分光计可视化。因此，已经相互作用与试样的电子的频谱分析揭示关于样品7的元素组成的定性和定量的信息。电子通过检体传递时不损失能量被发现在电子能量损失的“零损耗峰”谱。这些电子的丰度是相关的试样的质量，密度和厚度，并包括通过检体通过，而不碰撞与样品或通过试样通道中失去能量的电子。这个信息可以是为特定的元素本的原子数，在试样8的绝对定量是有用的。
因为生物样品包括主要光元件很差偏转电子在TEM的入射光束，染色方法使用重金属盐具有以生成所述样品中的对比度得以应用。特异性大多数这些造影剂和无法的可视化多个污点其中特异性是可能的缺乏在细胞核的研究已限制常规电子显微镜的值。 ESI有超过常规的TEM显著的优点，特别是对细胞核的结构的研究。有可能利用DNA和含有RNA的大分子复合的富磷性质区分蛋白质复合核蛋白复合物和解决基于核酸它们的密度不同核蛋白复合物。剩余的生物材料可以根据它的丰度氮气进行成像。不同的解剖结构中的映射只是这两种元素的分布和相对丰度的分析为我们提供了许多关于核信息。例如，它是容易识别染色质，并在地图上的核糖体代表磷丰度。所述interchromatin空间，核孔复合物，和核机构，另一方面，可以容易地在该氮地图图像中检测到。
迷你单态氧发生器系统（miniSOG）
尽管ESI代表一种强大的技术原位染色质结构来研究，因为它需要的优势在磷和氮之间的元素组成的特征比率，元素组成通常不能使用的蛋白质复合物的不同群体之间进行区分。抗体标记的小的金颗粒在纳米范围内已被广泛地用于绘制单个分子的位置。由于金颗粒通常连接到一个二级抗体，它将出现的周围由第一抗体检测的表位大约20nm的圆周内。在后包埋样品，抗体只能检测是在部分的表面露出的表位。虽然这是可能的，以证明抗原的存在，并将其涉及到细胞的特定解剖结构，所获得的信息是不完整的，因为大部分的表位是由树脂遮蔽。预嵌入技术，其使用类似的协议与用于荧光显微镜，在整个允许访问抗原样品的整个深度，但所需要的使抗体穿透细胞通常需要去除脂膜，并删除无法固定醛组分通透步骤。此外，优选的醛固定液超微结构保存，戊二醛，通常破坏的表位，因此，多聚甲醛，通常需要。这是在蛋白质 - 蛋白质交联效果较差。抗体的被标记有金纳米颗粒的另一缺点是，金是创建一个强烈的对比，可以掩盖样品，它具有弱对比度性的结构细节非常电子致密材料。
绿色荧光蛋白（GFP）作为表达的蛋白质标签的出现改变了使用荧光显微镜的解答在细胞生物学的问题。标记的蛋白质与小荧光域允许其在体内的分布制图9的胞质溶胶催化活性。 HRP的反应产物也可以扩散远离一代的网站，这样它们的分辨率比纳米金法10恶化。为了绕开这些问题，FLASH / ReAsH系统的开发11。它由重组融合蛋白，其拥有四半胱氨酸基序。这个主题可以结合一个biarsenic荧光。当激发时，结合的闪光或ReAsH是能够产生反应性高的单重态氧，因此photoconvert二氨基联苯胺（DAB）插入在标签的蛋白质的位点紧接该沉淀的聚合物。民建联聚合物可染色用四氧化锇，这是电子致密，因而可以用于映射重组融合蛋白在TEM的分布。
在2011年，舒等人 10提交的miniSOG系统，它由来自拟南芥的黄素蛋白是荧光，并且能够在与448纳米的蓝色光激发而产生很多单线态氧自由基衍生的小106个氨基酸融合标记的。这些单线态氧自由基可用于光氧化二氨基联苯胺，以形成上和标签蛋白，这是比免疫标记的抗体11相当接近的表面附近的聚合物。虽然闪存/ ReAsH系统需要使氟铬和二氨基联苯胺成执行光转化前的细胞中，miniSOG系统只需要二氨基联苯胺和轻，此外是大约两倍于聚合二氨基联苯胺作为有效。在这里，miniSOG采用与ESI的组合，以图的DNA修复灶的超微结构。
DNA修复灶（DRF）
未修复DNA双链断裂构成严重威胁到细胞，因为它们可以导致易位和遗传信息的丢失。反过来，这可导致衰老，癌症和细胞死亡。参与DNA双链断裂修复，许多蛋白积聚在病灶周围的DNA双链组装打破12-14。虽然它们的功能是未知的，它们所代表的部位在包含DNA双链断裂，并且是DNA双链断裂修复的部位的核心。
DNA修复FOCI（DRF）的特点是荧光显微镜和它们作为生物标志物用于DNA损伤12,15。它们大量相对于双链断裂的大小和被认为是相对均匀的，直到最近的超高分辨率显微镜研究揭示在每个聚焦16个子条块分子的一些证据。为了了解这些位点的组织，有必要以可视化的所有潜在的生物结构的相对于彼此。这不能用荧光显微镜下进行，但有可能通过电子显微镜17,18。这里，描述了一种方法，结合了电子光谱成像与miniSOG方法，来说明这种组合方法的潜力，以探索的DNA双链断裂修复的超微结构。
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Protocol
1.代miniSOG细胞系
- 生长的U2OS（人骨肉瘤）细胞在含2ml即补充有10％胎牛血清（FBS），在37℃下在湿润的培养箱中5％的CO 2低葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）的35mm培养皿气氛。
- 转染的细胞时，它们是80％汇合通过脂质转染法，用纯化的转染质量（A269 / 280比率1.8-2.0）包含miniSOG和mCherry序列质粒构建根据转染试剂19的制造商的协议标签修复蛋白。该miniSOG表达质粒可以从钱学森实验室订购：http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
- 排序的细胞通过荧光活化细胞分选后两天转染表达重组蛋白与miniSOG和mCherry标记。收集细胞用，以避免被过度表达20个细胞中间荧光强度。
- 培养上在10ml的DMEM培养基是补充有10％FBS和选择剂的G418（遗传霉素）的0.6微克/毫升10cm皿的阳性细胞。
- 后可见菌落都出现在平板上，画面mCherry阳性菌落使用倒置荧光显微镜和绘制圆周围（上板的底部）具有永久性标记。使用低倍率的空气物镜（ 如 10倍），并选择使用无菌技术克隆通过仔细刮殖民地断，慢慢地吸吮他们进入无菌1000微升的枪头。
- 扩展所选择的菌落，并利用在步骤1.1补充有10％二甲亚砜中描述的生长培养基冻结其中某些部分向下。通过他们成长在无菌18×18 平方毫米盖玻片，并将其暴露于测试细胞DRF形成辐射2戈瑞。经照射的细胞稳定表达miniSOG mCherry标记的修复蛋白必须显示双链断裂的典型焦图案特性时使用的过滤器设置用于成像mCherry用荧光显微镜显现。
2.细胞培养
- 培养U2OS细胞稳定表达miniSOG和mCherry在步骤1.1中概述的条件下标记修复蛋白。细胞生长至80％汇合在含2ml DMEM的35毫米直径的玻璃底菜。确保，重视盖玻片到塑料和所使用的塑料的胶水是耐水性和醇溶液和耐使用的树脂！
- 之前进行的实验中，概述了大约1mm 2，其中包含的细胞通过使用荧光显微镜来识别感兴趣的区域，用无菌金刚石笔刮擦表达异位蛋白质的小区域。或者使用玻璃底菜牛逼帽子包含与内置于盖玻片预蚀刻的网格系统盖玻片。
注意：如果使用的是高品质的相关显微镜相结合ESI和荧光显微图片21，确保盖玻片厚度与油浸目标一致。它应具有的厚度号1.5（0.16-0.18毫米）。选择一个面积接近盘的中心区域进行审查的TEM，以避免与附近的边缘可能发生的树脂的聚合（见点4.10-4.13）。
3. DNA损伤诱导
- 照射细胞用γ辐射，可使用radiomimetic药物，或诱导由激光微照射的伤害上的共焦显微镜（例如，如在18,22或23中所述 ）。
- 在这个例子中，使用405nm的溶胶照射细胞用γ照射的2和6戈瑞铯-137辐射源或激光器microirradiate共聚焦显微镜的致敏细胞20分钟，用0.5微克/毫升赫斯特之后的ID激光器。
4.样品制备
- 固定细胞用1ml的4％多聚甲醛小心在0.1M二甲胂酸钠缓冲液或者在0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.4，在室温30分钟在黑暗中。
注意：多聚甲醛和砷酸钠是有毒的！戴上手套和处置有毒物质充分。 - 用4ml的0.1M二甲胂酸钠缓冲液pH 7.4或磷酸盐缓冲液pH 7.4洗涤细胞两次。
- 对待固定的细胞用2ml的50mM甘氨酸，5mM的氨基三唑和在0.1M二甲胂酸钠缓冲液或0.1M磷酸缓冲液（pH7.4）中的10mM氰化钾小心（检查pH值！）处理30分钟，以封闭未反应醛基和以抑制由血红素基团所产生的活性氧，从而可以提高的背景。
注意：氰化钾是剧毒！ W¯¯耳手套，工作引擎盖下和处置有毒物质充分。该反应对pH非常敏感，因此，重要的是将pH核实和准确。 - 记录被在上一个倒置荧光显微镜步骤2.2在二维或三维中选择，如果相关显微术所需的区域。
- 通过将10毫克的二氨基联苯胺盐酸盐片剂到2ml微量离心管中制备一1mg / ml的二氨基联苯胺盐酸小心溶液。添加980微升蒸馏水H 2 O的和20μl浓盐酸（11.65米）的并混合直至溶液为浅棕色并且是半透明的。稀释此溶液在0.1M磷酸盐或0.1M的二甲胂酸钠缓冲液中至1毫克/毫升的最终浓度，同时调整用氢氧化钠将pH值至pH 7.0和7.6之间（pH为7.4，推荐）。
注意：二氨基联苯胺是有毒的！戴上手套和处置有毒物质充分。 - 对于光氧化河E放置用2ml的1毫克/毫升二氨基联苯胺盐酸盐在0.1M二甲胂酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液的缓冲液中。避光该溶液冷却下来在冰上4℃下 ，以提高氧的溶解度。通过该溶液鼓泡氧气饱和与氧的溶液（使用插入到溶液中并连接到一个氧气瓶的软管）。再次检查pH值，并在必要时进行调整。
注：它是用于光氧化反应的pH为7.0和pH 7.6之间至关重要。 - 支座与固定的细胞的培养皿小心地配备了40倍的油浸物镜透镜倒置荧光显微镜，并将其移动到感兴趣的区域。通过使用滤镜立方体的GFP或CFP激发与蓝光miniSOG标签。 MiniSOG有一个最大激发在448 nm的肩膀，在473±10。
- 即使在绿色荧光miniSOG公顷继续与照明š完全消失，直到聚合二氨基联苯胺的棕色光氧化产物出现在所传送的光信道。当氧化产物是可见的，在大多数的细胞，关闭荧光照明，停止光氧化。
注：光氧化最多可能需要取决于物镜，滤波器的传输波长和效率，以及照明源数分钟。 - 后缀的细胞用1ml的2％戊二醛的0.1M二甲胂酸钠pH 7.4的缓冲液或磷酸盐缓冲液pH 7.4 30分钟。
- 固定细胞与0.1％-0.5％的四氧化锇将膜20分钟在0.1M二甲胂酸钠缓冲液pH 7.4或0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.4。
注：建议使用来稳定该膜所需的四氧化锇的可能的最低浓度。由于聚合的DAB析出物具有高密度的氮气，它可以直接用ESI，强烈的被检测锇染色是没有必要的，以确定所述miniSOG标记蛋白，可能是有害的ESI。四氧化锇很毒！在通风橱中操作和处置有毒废物充分。 - 通过乙醇系列使用30％，50％，70％，90％，98％的100％乙醇的步骤（每次5分钟）脱水，所述细胞。接着，孵育细胞以1：1混合100％乙醇和丙烯酸树脂（LR白），并把该盘到振荡器上4小时孵育细胞至少在100另外4小时前，以促进渗透到细胞％丙烯酸树脂（LR白）。
- 为了使树脂聚合，切断标记的2 ml离心管的盖用刀片和涂层与丙烯酸树脂加速器边缘。确保该加速器仅覆盖轮缘和不流入管内。随后，小心地充满管大约三分之二与使用巴氏吸管的LR白树脂。请注意，该树脂不会进入接触机智H于轮辋的加速器！
- 删除渗入细胞在培养皿的树脂和颠倒放置皿到垂直竖立的离心管，使得该管的宽度几乎完全填满了盘的玻璃覆盖的观察窗。
- 等待1至2分钟的加速器以密封管和盖玻片，然后反转管，使得在管中的树脂现已覆盖细胞。
- 放置与管盘放入烘箱，在60℃，并固化它12小时。
- 当块被治愈，删除与从烘箱所附树脂填充的离心管盘和分离的离心管从盘。促进在液氮和热水通过冷冻 - 解冻循环的分离。
- 丢弃玻璃底培养皿，并仔细剖开的离心管，用刀片以除去该块。
- 标签永久性标记块。
- 使用刀片为三M中的嵌段，使得只是包含先前标记与金刚石或钨笔的区域（或含有与感兴趣的细胞中的区域）中的1毫米2区保持。
- 安装块在超微，具有修边刀修剪块切成约50nm的超薄切片，使用金刚石刀。
- 拿起高传输300目网格的部分。这些网格有非常小的尘棒，从而覆盖更少细胞中所关注的区域。
- 涂层，使用约0.2-0.4纳米碳的碳涂布机，以帮助TEM的电子束下稳定它们的网格的部分。
5.电子显微镜
- 加载网格成配备有能量过滤器的TEM。调整显微镜并根据制造商的说明，将能量过滤后，检查对切片中的细胞低倍率模式（通常传输），并比较它们与荧光数据在适当的时候（在步骤4.4获得）。
- 一旦与有趣的功能（DNA损伤曲目或DNA修复灶）原子核被发现，切换到能过滤模式并记录厚度图。
注：此过程包括零丢失和未经过滤的图像的记录。厚度达0.3平均自由程（在入射光束的电子的30％得到由样品散射）是足够薄，以产生良好的元素映射。 - 元素磷和氮的使用控制所使用的显微镜的能量过滤器的软件的记录比率的地图。记录在175电子伏特能量损失的磷地图后边缘图像以20电子伏特的预边缘图像，在120电子伏特能量损失的狭缝宽度，也以20电子伏特的狭缝宽度。在氮地图，记录后的边缘图像在447伏特与35伏特和预边缘图像的狭缝宽度在358电子伏特，也为35电子伏特的狭缝宽度。
注：由于成像元件的含量（phosphOrús酒店位和氮）是相对低的（约1％），选择“比率图像”（定性元素地图）比“3窗口方法”（定量元素地图），以产生具有更好的信噪比的图像。
6.图像处理
- 在图像处理软件可以处理所获取的图像的文件格式 （例如，数字显微）打开元素比地图。氮地图复制到红色通道和磷地图成RGB图像的绿色通道，然后叠加并对准地图。
- 合成图像导出为标记的图像文件格式（TIFF）文件。在图像处理的软件，可以使用层（如，Photoshop中）打开图像。
- 通过重新缩放的最大值和最小值在图像中的8位数据组（0到255）调整各信道的动态范围。
- 减去从氮地图中的磷含量（使用“层”的窗口），以产生一个定性图，显示蛋白质的分布。
- 转换在上一步分为“索引彩色”创建的核酸（磷）和蛋白质（氮）的地图和在该地图表示核酸分布和青色查找表CMYK颜色空间创建一个黄色的查找表以显示非核蛋白地图。颜色被选择为产生在两个元素地图之间的最大对比度。
- 创建一个新的形象，呈现出进口磷和蛋白质的不同层的分布地图。使用以便在“屏幕”透明模式，看看这两个层相互叠加。
- 打开在步骤5.2获得的零损失图像。此图像表示记录区，看起来像一个常规的TEM图像的图像，但只包含通过试样已通过而不与样品碰撞的电子。出口此图片为TIFF图像。
- 在照片编辑器中打开导出的零损耗的图像，并将其复制到图像显示的地图元素的最上层。对齐使用“屏幕”透明模式下的图像。
- 任选阈零损失使图像段源自所述miniSOG信号。添加得到的图像作为一个单独的层，如上所述。
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Representative Results
ESI
与常规的TEM图像比较所述核（ 图1）的ESI 图像 （例如， 图7-1）中揭示了解剖结构，可以很容易分辨的显着增加。染色质脊显示为黄色，这是很容易识别在小鼠细胞中的chromocenters。核仁可以容易地从染色质区分通过圆形结构和不同的颜色，由于预组装的核糖体已经含有高量的蛋白质，其是富含氮，除了核糖核酸，其中富含磷。外围染色质驻留作为薄层上的核和核孔的边界可以被看作是该中断的周质富氮的结构。常椎板可以被看作是一个非常薄的蓝色层的周质之外。在细胞质中，含有丰富的磷许多小颗粒可见。这些可以被识别为基于它们的大小，数量和位置的细胞核外核糖体。的interchromatin空间可以被看作是位于染色质之间的富含蛋白质的区域。这包含核机构和丰富的黄色小信号，如核糖核蛋白颗粒和集群核糖核蛋白颗粒（ 图2）的区域。后者被称为interchromatin颗粒簇并被特征性地富含所需前mRNA剪接。 图1B，C和D示出的其他公知的结构的外观如丝分裂染色体，中心体，线粒体和着丝粒蛋白。在图2中，用来产生从原始元素比地图有色复合图象的步骤归纳。合并磷地图（绿色）和氮地图（红色）在RGB颜色空间（上排）使样品中的这些元素的量的更好的评估。 HoweveR，减去磷信号以耗尽含核酸结构的从氮地图的贡献，得到蛋白质地图（青色）和与磷地图合并它（黄色）在CYMK色空间提供核蛋白的更明显的视觉表示和非核蛋白（下排）。这使得数据能够更容易地由个人不熟悉技术的解释。
激光microirradiated表达MDC1，53BP1和RAD52
由于激光损坏磁道的用户定义的大小，形状和位置，在激光microirradiated细胞的DAB沉积的区域都是很容易使用miniSOG系统时以TEM找到。在低倍率的传输模式（即，常规的明场TEM）拍摄的照片显示特性损坏磁道，并且可以与被之前嵌入记录用荧光显微镜的数据进行比较。这是特别有用的，如果相关显微镜的目的，因为它可方便识别和搬迁的单核。 （图2-4）。
第一个例子（图3）示出的U2OS细胞系稳定表达MDC1 miniSOG-mCherry。在激光microirradiation实验中，含有miniSOG和mChrerry标签MDC1招募非常相似于该蛋白的GFP标记版本（数据未显示）。固定细胞的DNA损伤诱导后1小时，制备样品的透射电子显微镜，所述MDC1损伤轨道被在超薄切片在正常TEM模式横跨细胞核为深色条纹，其对应非常良好的荧光数据容易识别（ 图3-5）。当看该蛋白质的分布，在氮气信号明显增加可以在激光损伤点被观察到。它必须在这里指出这主要是由聚合的diami引起 nobenzidine，其中富含氮和放大miniSOG的信号标记的修复蛋白，而不是仅仅通过修复蛋白的损坏磁道的积累。与在损坏磁道结构中的核的其余部分比较染色质结构显示了一个明显的区别。损坏的染色质（即示出了虚线内的图3），出现更多解聚而相比之下，非照射染色质，它发生在厚的脊中的核质。内的损坏磁道，核体（200-300纳米）（在图3 II2，IIB，IIC和Ⅲa族强调由箭头）是富含MDC1-miniSOG蛋白但不含核酸也可观察到。这将是非常具有挑战性的，而不此技术来定义这些核体如染色质 - 自由结构。它也表明复杂到不通过MDC1的已知生物化学预测损伤位点的额外的水平。
ntent“>综观53BP1（图4）使用的相同的条件中MDC1转染的细胞先前描述的损害所创建的损坏磁道，非常相似的结果可以观察到。这是由光氧化的产生的信号所述miniSOG为拥挤，填补了染色质的折叠之间的空间中。重染色核机构也可以被观察到（在图4 D，E，F的箭头突出显示）。从与RAD52-GFP构建体的实验中，已知的是RAD52将形成小而明亮的microcompartements 24沿一个激光损伤的轨道。由于传统的光学显微镜的分辨率极限，它一直不清楚他们是如何大的这些结构真的是和如何与受损的DNA。综观激光照射U2OS细胞核组成型表达RAD52-miniSOG-mCherry TEM照片，这些机构的规模，测量是在平均水平（150-250纳米）。它是更让人惊讶的看着这些病灶与ESI。与此相反的前面的例子中，RAD52-miniSOG-mCherry灶似乎完全不同组织沿损伤轨道和似乎是被由蛋白质和有其内部中没有可检测的核酸的紧凑核体样结构。基于看着与我们共同miniSOG和ESI方法获得的受损区域的核酸/蛋白质的关系，我们认为，DNA修复可能发生在焦点的表面，而不是在室内。
在图5显示的结果相似下部图像图3-Ⅲ。在受损区域的染色质似乎比在非照射区的染色质（参见由红色虚线轮廓区域）可以更解聚。
伽玛辐照细胞
虽然激光微照射是一种方便的工具来quickl包含荧光标记招募的DNA损伤位点ÿ测试蛋白质，它创建大量复杂损伤（双链断裂，单链断裂，碱的损害，并cyclopyrimidine二聚体）25。为了研究，围绕DNA双链断裂更直接形成隔室，我们检查了围绕单个双链断裂形成通过将细胞暴露于γ-照射DRFS。
U2OS细胞稳定表达53BP1-miniSOG-mCherry暴露于γ-照射的2戈瑞和照射后的固定半小时。的大焦点在整个核质分布特征模式可以观察到（图6Ia）。后光氧化二氨基联苯胺的，新出现的位置处的荧光mCherry信号分别位于荧光显微照片黑斑可以看出，在电子显微照片（ 图6Ib和c）。这些斑点可以被关联到的TEM图像已采取在低倍镜下（ 图6Id和e）。这些病灶，这似乎是约1-1.5微米直径的ESI图像，显示了一个有趣的结构。染色质的薄链似乎具有大约两倍的厚度53BP1蛋白质穿插。
在其它实验中，将细胞暴露于更高的辐射量，并固定在稍后的时间点，以产生更大的发灶和促进定位他们在超薄切片（3小时和6小时，分别经过）（ 图7）。因为我们能够分别映射核蛋白和蛋白质，ESI表明，病灶的结构出现重组随时间。 53BP1蛋白在焦点的相对量似乎增加而染色质需要更多周边位置。
由于53BP1灶也出现在非辐照的细胞作为“神秘灶”，在G1期细胞下复制的网站D核酸26,27，这些灶也成像。这些隐蔽灶似乎含有高量的相对于所述辐射诱导的病灶蛋白，并显示染色质的一个有趣的规则结构。
因此，可视化使用miniSOG方法DNA修复焦点成分有助于确定DNA损伤的区域和映射修复蛋白相对于染色质的标记的分布。
图1.概述了可以在ESI图像可以观察到结构的 请点击此处查看该图的放大版本。
小鼠胚胎成纤维细胞（一）ESI图像。染色质脊（黄色）由核质（青色）填满interchromatin藻包围王牌。核是由外围异和chromocenters（左下），它们通过核孔复合物（青色）中断包围。核仁可以通过它们的颜色来清楚地分开。这是由于这样的事实，即相对于核酸蛋白的量在核仁结构高于它在染色质。外的细胞核，线粒体和核糖体（富含核酸）可以容易地识别。
一个核和中心体（见箭头），它可以被看作是中空富含蛋白质的颗粒在图像的左上角的（B）的图像。
（C）穿越一个中期板部分。在高度浓缩的中期染色体都对准一个磁盘跨越从左上角到左下角。高浓度的氮的是在一些染色体的表面可见。这些区域的着丝粒（见箭头）。
（上排）行中的前两个画面显示磷和氮的比例的地图。在上排的最后图为叠加在RGB颜色空间这些元素的地图。黄结构代表核蛋白，这反映了磷和氮的存在。 （下排）第一图为磷图，它揭示了主要核酸的样品中的分布。中间图为核酸贫/负STRU分布 ctures。有人计算减去磷地图从氮地图。右下图为核酸图和蛋白质地图在减色空间的一个合并。这个彩色复合应用于帮助单个结构的识别和把它们称为核蛋白分类或不核蛋白。上的磷和氮丰度的量化信息应当从视觉净磷和净氮灰度地图或从通过使用添加剂的颜色，如在顶行中产生的复合材料来收集。 
图2.创建多色ESI图象的 
图3.激光微U2OS稳定表达MDC1-miniSOG-mCherry的照射。 请点击此处查看该图的放大版本。
（II）中的区域中，通过在IC绿色方块强调被放大并在正常传输模式（IIa）的和ESI（IIb）中示出。的IIc表示ESI图像与损坏轨迹的信号的叠加。用阈值的上图像获得的损坏磁道信号。
（Ⅲ）激光微结构，例如可以γ-照射的染色质和染色质的激光破坏的区域之外。
图4.激光微稳定表达53BP1-miniSOG-mCherry的照射。 请点击此处查看该图的放大版本。
左柱：（A）中的荧光，（B）的常规TEM和照射核相同的激光微（℃）。ESI图像。
右列：（D）常规TEM，（E）ESI和ESI图像被分割的（D）阈值的miniSOG信号（F）叠加（见步骤6.10）
图5. U2OS稳定表达RAD52-miniSOG-mCherry和激光微辐射损伤。 请点击此处查看该图的放大版本。
的荧光图像（A）的铺层低倍率的TEM图像示出激光microirradiated U2OS核与损伤轨道在左下角。
激光微（B）的代表性共聚焦荧光显微镜图像照射的Hoechst染色的核（蓝色）表达RAD52-miniSOG-mCherry示出的小病灶沿损伤轨道（红色信号）特征模式。
（C）的常规TEM，（D）。ESI，
的另一个的U2OS核稳定表达RAD52-miniSOG-mCherry表示激光损伤轨道在整个核的上下文中（G）。ESI图像。
图6. U2OS稳定表达53BP1-miniSOG-mCherry照射2戈瑞和固定30分钟后。 请点击此处查看该图的放大版本。
（I）的一个）的荧光图像示出了伽玛射线诱导53BP1灶。 B）光聚合后的透射光图像。 C）卵圆erlay与透射光图像的荧光。 d）低倍率TEM图像（黑色条纹TEM网格吧）。 E）覆盖的低倍率TEM图像的荧光图像。
（II）的损害聚焦标记记录在正常TEM和在ESI模式的透射光图像的星号。一）零损耗，B）。ESI，三）磷，四）E蛋白）叠加ESI和从零损失图像分割信号。
（Ⅲ）损害聚焦标记记录在正常TEM和在ESI模式的荧光图像传。一）零损耗，B）。ESI，三）磷，四）E蛋白）叠加ESI和从零损失图像分割信号。
图7.改变照射后不同时间灶灶之间的结构。< / STRONG> 请点击此处查看该图的放大版本。
U2OS 53BP1 miniSOG mCherry细胞暴露于γ-照射固定3H（1A-E，FJ），并分别为6小时（2A-E，FJ）之后的6戈瑞。图3示出未照射的U2OS 53BP1 miniSOG mCherry核，显示出一个隐蔽焦点（AE）。 ESI图像被显示的顺序。ESI（核酸和蛋白），核酸（单独），蛋白质（单独），ESI（核酸和蛋白质）+分段miniSOG信号。
图8. DNA修复灶仍处于传统的传输方式可见时省略固定后用四氧化锇。 arge.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
一个的U2OS核，显示出从未与四氧化锇处理过的样品2 53BP1灶超薄切片（50nm以下）。（A）在常规TEM模式，也能够看到站点民建联聚合物染色，即使没有提高与对比重金属染色。（二）病灶的对比度可以通过采取零损失图像（过滤出所有的电子起源来自多个散射事件）得到进一步加强。
图9.确定的映射磷的最佳能量窗口设置
（A）在120 eV的记录与磷的边缘后，在155 eV和预边缘元素比例的地图。
内容“>（B）元素的比例图录磷与后缘在175 eV和预边缘在120电子伏特。（C）从在120电子伏特能量的损失和可变后边缘窗口范围从140-200eV能量损耗，以确定该组合是最好的对比度的恒定预边缘窗口计算磷比例的地图。的最亮的强度差和dimmestpixel在一个线扫描横跨相同富磷和磷差区域表示最高的对比度值（动态范围）被选择的175电子伏特能量损失的后边缘图像时。
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Discussion
ESI可作为极好的工具用于检查染色质和核糖核蛋白的不同状态在细胞核中，因为它是能够专门映射是富含磷的区域。它深刻增强细节，可以用电子显微镜来获得并且不依赖于非特异性对比方法的量。 ESI的一个缺点是，它需要比在相同的加速电压常规的TEM较薄部分。这可以通过在与连续切片或使用层析方法28来克服。
虽然大量的信息可以通过查看磷和氮的分布来获得，它是感兴趣的能够也映射某些蛋白质的分布。该方法本文提出，它被证明ESI可以与基于二氨基联苯胺的位点特异性聚合上的方法相结合。虽然这种方法不加赋LL新颜色ESI，它显然是有用的映射的蛋白的分布。这尤其适用于与该染色质相互作用的蛋白质。如果研究需要可视化多个蛋白群，当作为预嵌入染色前光氧化9施加，仍然可以使用利用免疫标记的方法。相比的稳定细胞株，瞬时转染具有的缺点是表达水平可以细胞之间的显著变化，从而使其难以找到多个细胞表达类似量的标记的蛋白质。因此，建立稳定的细胞系被推荐。然而，也可以使用荧光成像来判断蛋白表达的相对量，并选择以下瞬时转染的细胞与中间表现。
虽然miniSOG融合标签是荧光的本身而言，其量子产率比GFP（0.37对0.6）10显著恶化。对于purpOSE相关显微镜，加入像mCherry额外的荧光蛋白标记允许成像在活细胞没有发生与miniSOG激发产生单态氧。所述miniSOG标记的蛋白的表达水平，中的氧气含DAB-缓冲器的量，并且pH也可影响光氧化的速度。有时也可以是很成问题，实现因光的光氧化反应的依赖性同质光氧化中的感兴趣的区域。延长光氧化可以导致非特异性染色和太多的重金属的样品在淀积，这可以通过ESI复杂化单元特定信号的检测。光氧化过程是相当耗时的，使得通常仅含有少量细胞上的盖玻片一个非常小的区域，通常染色。
我们已经表明miniSOG的结合ESI标记的蛋白质使用的追随者胡单层人类癌细胞系。原则上，该方法也可以应用于任何其它样品（酵母，细菌，组织，胚胎），只要它是能够表达miniSOG标签蛋白在合理的水平，并且只要半透明和氧的扩散和DAB是足够高，以允许适当的光氧化，从而均匀染色。对于悬浮细胞，这将是有利的是固定在使用粘接剂，例如聚-L-赖氨酸盖玻片细胞的位置。对于较厚的样品，用较低的数值孔径物镜将实现更均匀的照明，但需要较长的时间光氧化。
我们已经提出了使用miniSOG标签的融合蛋白接近舒等 [10]发表尽可能原协议-包括使用四氧化锇。那里可以观察到的是，除了优先沉积在DAB-聚合物和膜，四氧化锇显示了一些反应性和沉积在大多数样品中的生物材料 （10 图3）。四氧化锇具有45电子伏特的元素边缘。这个信号和它的等离子体可以叠加在作为试样的增加和单个电子的厚度通过试样通过期间经历多个能量损失事件的电子能量损失光谱。这可以限制磷元素的图的质量，如果高OSO 4浓度在样品制备中使用。我们在这里使用的浓度，这是比以前使用10显著下，允许的良好的质量的磷的地图的产生。在使用的实验miniSOG标记的蛋白质，要求更高OSO 4浓度，最佳浓度仍然允许良好磷图产生将不得不凭经验确定。
我们已发现，民建联聚合物形成在DNA修复焦点是sufficiently稠密在常规TEM模式的待观察（或在零损失模式甚至更好的对比度），甚至当被省略后的定影用四氧化锇（ 见图 8）。记录这种方式，该信号的分割是因为使用了与锇处理的样品作为稳健。根据具有要被可视化的核蛋白质，结构的它形成的大小和必要性来可视化膜的系统中，使用四氧化锇的可能不是必要的，其不作为将除去掩蔽磷的元素签名的潜力。
相比，使用ESI 18,29,30其他出版物，我们以产生具有最少噪声元素比地图用于前和后边缘图像不同的设置。我们已经凭经验确定在手稿提交的设置（ 参见图9）。边缘周围的选择的设置应导致纠正ELE除非集合窗户心理地图重叠与存在于样品中的其他元素。在我们的情况下，硫可以是这样的元件。因为硫的浓度（这发生在氨基酸甲硫氨酸和半胱氨酸）是非常低的，并有助于计算出的地图只在一个可忽略的量，我们认为，我们使用这里使用超过了缺点的设置获得了较好的S / N比这可能产生硫的样品中的痕迹。
我们发现DRFS在使用DNA修复蛋白MDC1，53BP1和RAD52结合ESI和透射电镜技术，纳米决议的超微结构。使用这种方法的染色质和个人DSB修复蛋白定位的组织得到解决。显示出其在结构域富含以下激光微照射DNA和修复蛋白的倾向，以填补染色质脊之间的空间的DNA损伤定位。在RAD52的情况下，其中PLAYS在同源重组的作用，形成核体样球形结构的沿着激光损坏轨迹可以观察到，这是在相对于其它两个测试蛋白质。当损害是通过γ照射施加，53BP1周围形成受损染色质灶。染色质和蛋白质在灶的相对组成和位置似乎随时间而改变。都可以很容易地使用ESI技术而传统明场显微术使用铀和铅作为造影剂不能直接评估这些特性得到这些蛋白质和损坏的染色质，以及在染色质的组织的变化和核体的组合物之间的关系。因此，这种技术显示出高潜力的结构与功能的关系，特别是对作用于DNA的过程的研究。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
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