Abstract
Optik çözünürlük ve transmisyon elektron mikroskobu spesifik protein popülasyonlarını tanımlama meydan sınırları hücre biyolojisinde engeller olmuştur. Birçok fenomen basit sistemler, in vitro analizi ile açıklanabilir ve tam anlaşılması için, bilhassa 1 nm ve 0,1 um aralığında, yerinde ek yapısal bilgi mi edilemez. Burada, elektron spektroskopi görüntüleme, protein ve nükleik asitlerin dağılımının eşzamanlı eşleme sağlayan bir transmisyon elektron mikroskobu tekniği ve bir ekspresyon etiketi miniSOG DNA çift iplik kırılım onarımı odaklarının yapısını ve organizasyonunu incelemek için bir araya getirilmektedir.
Introduction
Son yıllarda üzerinde 1 ışık mikroskobu önemli gelişmelere rağmen, hücre biyologlar hala çözünürlükte bir boşluk muzdarip. Bu makromoleküler kompleksleri arasında koordineli etkileşimi içeren temel hücresel süreçleri yapı-fonksiyon ilişkilerinin anlaşılmasını sınırlar (örneğin, kromatin yeniden, DNA onarımı, RNA transkripsiyonu ve DNA replikasyonu olarak). Transmisyon elektron mikroskopları (TEM) gerekli çözünürlüğü sağlamak s olsa da, görsel yapıların biyokimyasal kompozisyonu belirlemek mümkün olurken spesifik proteinlerin etiket yapısal yetersizlik nedeniyle bu süreçleri tanımlamak için zorlu olmuştur. Nükleer yapıları ayırt etmeye yardımcı iç membran yokluğunda, çekirdek özellikle zor olmuştur. Elektron spektroskopik görüntüleme (ESI), DNA, RNA ve prot eş zamanlı algılama ve farklılaşmasını izin vererek bu sınırlamaların bazılarını çözerNükleer yapılar 2-5 ein tabanlı.
Elektron spektroskopik görüntüleme:
Elektron mikroskobu yüksek hassasiyet ve çözünürlükte element dağılımları haritası için bir esnek olmayan numune 6 bir elemanın iç kabuk elektronları ile etkileşimleri dağılmış olan elektronların seçer bir görüntüleme spektrometresi kullanabilirsiniz. Enerji elemanı spesifik miktarlarda numune atom iyonizasyonu bir sonucu olarak kaybolur, çünkü bu elektron ayrıldı ve elektron mikroskobu bağlı bir spektrometre kullanılarak görüntülenebilir. Böylece numune ile etkileşimde elektronların spektrumunun analizi örneği 7 element kompozisyonu hakkında nitel ve nicel bilgiler ortaya koymaktadır. Numune geçerken enerji kaybetmek yok elektronlar elektron enerji kaybı "sıfır kayıp zirve" bulunurtayfı. Bu elektronların bolluğu numune kütlesi, yoğunluğu ve kalınlığı ile ilgilidir ve numune ile çarpışan veya numunenin geçişi sırasında enerji kaybı olmadan numune geçmesine elektron oluşur. Bu bilgiler, örnek 8, belirli bir eleman mevcut atomların sayıları mutlak ölçümü için yararlı olabilir.
Biyolojik örnekler heavy metal kullanarak çoğunlukla kötü TEM olay ışın elektronları saptırmak hafif elementlerin, boyama metotları oluşur beri tuzları numunedeki kontrast üretmek için uygulanmak zorundadır. Bu farklı maddeler ve yetersizlik en özgüllüğü mümkündür birden fazla leke görselleştirmek için özgüllüğü olmaması çekirdeğinin çalışmada bilinen elektron mikroskobu değeri sınırlıdır. ESI özellikle hücre çekirdeğinin yapıların çalışma, geleneksel TEM göre önemli avantajlara sahiptir.Bu protein komplekslerinden nükleoprotein kompleksleri ayırmak için ve nükleik asitlerin yoğunluklarına dayalı olarak farklı nükleoprotein kompleksleri çözmek için nitelikteki DNA- ve RNA-içeren makromoleküler kompleksler fosfor açısından zengin doğasını yararlanmak mümkündür. Kalan biyolojik madde azot bolluğu dayalı görüntülü olabilir. Farklı anatomik yapıların içindeki dağılımı ve göreceli bolluk Haritalama sadece bu iki element ve analiz çekirdeğinin hakkında bilgi bir sürü bize sağlar. Örneğin, kromatine ve fosfor bolluğu temsil harita ribozomlar tespit etmek kolaydır. Interkromatin alanı, çekirdek gözenek kompleks ve nükleer organları, diğer yandan kolayca azot harita görüntü tespit edilebilir.
Mini singlet oksijen jeneratörü sistemi (miniSOG)
ESI güçlü bir teknik temsil ederken o alır çünkü yerinde kromatin yapısı okumak içinfosfor ve azot ile elementel kompozisyon karakteristik oranların s avantajı, element bir bileşim, normal protein kompleksleri farklı popülasyonlar arasında ayrım yapmak için kullanılamaz. Nanometre aralığındaki küçük altın parçacıkları ile etiketlenmiş antikorlar yaygın tek tek moleküller yerini haritalandırmak için kullanılmıştır. Altın partikül genellikle İkincil antikora bağlı olduğu için, bu primer antikor ile tespit epitopa çapında yaklaşık 20 nm'lik bir çevresi içinde görünür. Sonrası gömme örneklerde, antikorlar tek bölümlerin yüzeyinde ortaya epitopu algılar. Bu, elde edilen bilgileri bir antijenin varlığı ispat ve hücrenin belirli bir anatomik yapıya ilişkilendirilmesi mümkün olsa da epitop en reçine ile örtülü olduğundan, tam değildir. Boyunca antijenlere erişime izin, floresan mikroskop için kullanılanlara benzer protokollerini kullanan teknikleri, Ön-gömmenumunenin tamamı derinliği ancak genellikle lipid membranların çıkarılmasını gerektirebilir ve aldehitler ile sabit olamaz bileşenleri kaldırmak antikor hücresine nüfuz sağlamak için gerekli olan permeabilizasyon adımlar. Ayrıca, ultrastrüktür korunması, glutaraldehit için tercih edilen aldehit sabitleştirici, yaygın dolayısıyla paraformaldehit tipik gereklidir epitopları tahrip ve. Bu protein-protein çapraz bağlama az etkilidir. Altın bir nanopartikül ile etiketlenmiş antikorların başka bir dezavantajı, altın zayıf kontrast örnek, ilginç yapısal detayları belirsiz olabilir güçlü bir kontrast oluşturan bir çok elektron-yoğun malzeme olmasıdır.
Bir ifade edilen protein etiketi gibi yeşil flüoresan protein (GFP) ortaya çıkması hücre biyolojisinde soruları cevaplamak için floresan mikroskopi kullanımını dönüştürdü. Küçük bir flüoresan alana sahip bir protein etiketleme in vivo dağılım eşleme sağlar 9 sitozolünde katalitik olarak aktif değildir. Kendi çözünürlük NanoGold yöntemi 10 daha kötü olduğunu, HRP, reaksiyon ürünleri de kuşak mevkiden uzağa yayılabilir. Bu sorunları aşmak için, flash / ReAsH sistemi 11 geliştirilmiştir. Bir Tetracysteine motifine sahip olan yeniden birleştirici füzyon proteinlerinin oluşur. Bu motif bağlanmasını sağlarBir biarsenic fluorofor. Heyecan, ilişkili veya FLASH ya da ReAsH etiketli proteinlerin yerinde hemen çökeltilerin a polimere singlet oksijeni ve böylece photoconvert diaminobenzidin (DAB) üretebilir. DAB polimeri, elektron yoğun ve dolayısıyla TEM rekombinant füzyon proteininin dağılımının haritasının için kullanılabilir osmium tetroksit ile boyanmış olabilir.
2011 yılında, Shu ve ark. 10 floresan ve 448 nm mavi ışık ile uyarıldığı zaman birçok singlet oksijen radikallerini oluşturmak mümkün Arabidopsis bir flavoprotein türetilen küçük 106 amino asit füzyon etiketinin oluşan miniSOG sistemini sundu. Bu tekli oksijen radikalleri ve immünolojik etiketlenmiş antikorlar 11 önemli ölçüde daha yakın olan etiketli protein, yüzeyine yakın polimerleri oluşturmak için foto-oksidaz diaminobenzidin için kullanılabilir. Flaş / ReAsH sistem floro getiren gerektirirkenkrom ve Fotoçevrim yapmadan önce hücre içine diaminobenzidinin, miniSOG sistem sadece diaminobenzidin ve ışık gerektiren ve buna ek olarak diaminobenzidin polimerize yaklaşık iki kat etkilidir. Burada, miniSOG DNA tamir odaklarının ultra yapısını eşlemek amacıyla ESI ile bir arada kullanılmaktadır.
DNA tamir odakları (DRF)
Onlar translokasyonlarda ve genetik bilginin kaybına yol açabilir çünkü unrepaired DNA çift iplikli sonları hücreye ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. Buna karşılık, bu yaşlanma, kanser ve hücre ölümüne yol açabilir. DNA çift iplikli sonu onarım katılan pek çok protein 12-14 kırmak DNA çift sarmalı etrafında bir araya odaklar birikir. Bunların işlevi kesin olarak bilinmemekle birlikte, bu DNA çift iplik sonu içeren ve DNA çift iplik kırılım onarımı edilir çekirdeğinde sitesini göstermektedir.
DNA tamir foci (DRF) floresan mikroskobu ile karakterize edilmiştir ve DNA hasarı 12,15 için biyomarkerların olarak hizmet vermektedir. Onlar çift iplikli mola büyüklüğüne masif göreli ve son süper çözünürlük mikroskop çalışmaları her 16 odak içinde moleküllerin alt bölümlendirme bazı kanıtlar ortaya dek görece homojen olarak kabul edildi. Bu siteler organize anlamak için, birbirine yatan biyolojik yapıların tüm göreceli görselleştirmek için gereklidir. Bu floresan mikroskobu ile elde ancak elektron mikroskobu 17,18 ile mümkün olamaz. Burada bir yöntem DNA çift sarmallı mola onarım ultrastrüktür keşfetmek için bu kombine yaklaşımın potansiyelini göstermek için miniSOG yöntemi ile elektron spektroskopik görüntüleme birleştiren açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MiniSOG Hücre hatları 1. Üretim
- % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de% 10 fetal bovin serumu (FBS) ile takviye edilmiş düşük glikoz Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde 2 ml ihtiva eden bir 35 mm çanak U2OS (insan osteosarkoma) hücreler büyümek atmosfer.
- Bunlar miniSOG ve mCherry sekansları içeren plazmid transfeksiyon reaktifi yapılar 19 ve imalatçının protokolüne göre, onarım etiketli proteinlerin saflaştırılmış transfeksiyon kalitesi (A269 / 280 oranı 1.8-2.0) ile lipofeksiyon ile% 80 konfluent olduğunda, hücreleri transfekte. MiniSOG ifade plazmid Tsien-Lab sipariş edilebilir: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
- İki gün sonra transfeksiyon flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması ile miniSOG ve MCherry etiketiyle rekombinant proteini eksprese eden hücreler, kriteri. Hücreleri toplayın20 aşırı ifade eden hücreleri önlemek için bir ara madde floresan ile.
- Kültür,% 10 FBS ve seleksiyon ajanın G418 (Geneticin) 0.6 ug / ml ile takviye edilmiş DMEM ortamı içinde 10 ml bir 10 cm'lik bir tabak üzerinde pozitif hücreler.
- Görünür koloniler plakalar üzerinde ortaya çıkmıştır sonra, MCherry pozitif kolonilerin ekranı ters bir floresan mikroskop kullanılarak ve kalıcı bir kalem ile (plaka alt üzerine) çevrelerindeki daireler çizin. Düşük büyütme hava objektif lens (örneğin, 10x) kullanın ve dikkatli steril 1000 ul pipet içine emme yavaş yavaş koloniler çizilmeye ve steril tekniği kullanarak klonları seçin.
- Seçilen koloniler genişletin ve% 10 dimetil sülfoksit ile desteklenmiş aşama 1.1 açıklanan büyüme ortamı kullanarak onları kısımlarını aşağı dondurma. Steril 18 x 18 mm 2 kapak fişleri onları büyüyen ve bunları teşhir ederek DRF oluşumu için hücreleri testRadyasyon 2 Gy. Stabil bir miniSOG mCherry ifade ışınlanmış hücreler mCherry görüntülenmesinde filtre seti kullanan bir floresan mikroskop ile görüntülendi zaman tamir protein DSBs tipik odak desen özelliği göstermek zorundadır etiketledi.
2. Hücre Kültürü
- Kültür U2OS hücreleri stabil miniSOG ifade ve mCherry adımda 1.1 belirtilen şartlar altında onarım proteinleri etiketledi. DMEM 2 ml ihtiva eden bir 35 mm çapında bir cam alt tabak içinde% 80 konfluansa kadar hücreleri büyütün. Plastik ve kullanılan plastik kapak kayma verdiği tutkal kullanılan reçine sulu ve alkollü çözümlere karşı dayanıklı ve dirençli olduğundan emin olun!
- Denemeyi gerçekleştirmeden önce, ilgilenilen bölgeyi tanımlamak için bir floresan mikroskop kullanılarak steril bir elmas kalemle çizilerek ektopik proteinleri ifade hücreleri içeren yaklaşık 1 mm 2 küçük bir alanda özetlemektedir. Alternatif bir cam alt çanak t kullanınşapka lamel yerleşik bir ön kazınmış ızgara sistemi ile lamel içeriyor.
NOT: ESI ve floresan mikroskobik resimler 21 birleştirerek yüksek kalitede bağıntılı mikroskopi kullanılarak ise, lamel kalınlığı immersiyon yağı hedefleri ile uyumlu olduğundan emin olun. Bu kalınlık No. 1.5 (0,16-0,18 mm) olması gerekir. Bölge kenarlarına yakın oluşabilecek reçine polimerizasyonu ile sorunları önlemek amacıyla TEM incelenecek için çanak merkezine yakın bir alan seçin (nokta 4,10-4,13 bakınız).
3. DNA Hasarı İndüksiyon
- , Gama radyasyonu ile hücrelerin ışın tedavisi, bir radyomimetik ilaç kullanımı, ya da (18,22 veya 23 de tarif edildiği gibi, örneğin,) konfokal mikroskop lazer ışınlama, mikro hasarını teşvik eder.
- Bu örnekte, 405 nm sol kullanarak bir sezyum-137 radyasyon kaynağı veya lazer microirradiate gama ışınlama 2 ve 6 Gy ile hücrelerin ışın tedavisi0,5 ug / ml Hoechst ile 20 dakika boyunca hücrelerin duyarlılaştırılması sonra konfokal mikroskop id hal lazer.
4. Numune Hazırlama
- 0.1 M sodyum kakodilat tampon maddesi içinde ya da karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 0.1 M fosfat tamponu pH 7.4 içinde% 4 paraformaldehit DİKKAT 1 ml hücreleri saptamak.
DİKKAT: Paraformaldehit ve sodyum kakodilat zehirlidir! Eldiven giyin ve yeterince zehirli maddeler atmayın. - 0.1 M sodyum kakodilat tamponu, pH 7.4 ya da fosfat tampon maddesi, pH 7.4, 4 ml hücreler iki kez yıkayın.
- 2 ml 50 mM glisin ile sabitleştirilmiş hücreler tedavi, 5 mM aminotriazol ve 30 dakika boyunca 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ve 0,1 M fosfat tampon maddesi (pH 7.4) içinde 10 mM potasyum siyanür DİKKAT (pH kontrol!), Reaksiyona girmemiş bloke etmek için aldehit grupları ve arka plan artırabilir hem grupları tarafından üretilen reaktif oksijen türleri bastırmak için.
DİKKAT: Potasyum siyanür son derece zehirlidir! WKulak eldiven, bir başlık altında çalışmak ve yeterince zehirli maddeler atmayın. PH belirlenmiş ve doğru olması önemlidir, böylece, reaksiyon pH karşı çok hassastır. - Bağıntılı mikroskopi isteniyorsa, ters bir floresan mikroskop 2D veya 3D adımda 2.2 seçildi alan kaydedin.
- 2 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpü içine, bir 10 mg tablet diaminobenzidin hidroklorür koyarak 1 mg / ml diaminobenzidin hidroklorür DİKKAT çözeltisi hazırlayın. Distile H, konsantre edilmiş hidroklorik asit (11.65 M) 2 O ve 20 ul 980 ul ekleyin ve çözelti, açık kahverengi ve berrak hale gelene kadar karıştırın. 7.0 ile 7.6 arasında bir pH değerine kadar sodyum hidroksit ile pH ayarlanması sırasında, 1 mg / ml'lik bir son konsantrasyona kadar, 0.1 M fosfat veya 0,1 M sodyum kakodilat tampon maddesi içinde bu çözüm seyreltilir (pH 7,4 önerilir).
UYARI: diaminobenzidin zehirlidir! Eldiven giyin ve yeterince zehirli maddeler atmayın. - Fotooksidasyon, replace 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ya da fosfat tampon maddesi içinde 1 mg / ml diaminobenzidin hidroklorür çözeltisinin 2 ml'si ile tamponu. Işıktan bu çözüm korumak ve oksijenin çözünürlüğünü artırmak için 4 ° C'nin buz üzerinde soğumasını. (Çözelti içine yerleştirilir ve bir oksijen şişeye bağlı bir hortum kullanarak) bir solüsyonu ile oksijen kabarcıkları geçirmek suretiyle oksijen ile çözelti Doymuş. Tekrar pH'ı kontrol edin ve gerekirse ayarlayın.
Not: Bu, pH pH 7.0 ve pH 7.6 arasında olduğunu fotooksidasyon reaksiyon için çok önemlidir. - Dikkatli bir 40x immersiyon yağı objektif lens ile donatılmış bir ters floresan mikroskop üzerine sabit hücrelerle çanak monte edin ve ilgi alanına taşımak. GFP veya CFP filtre küpleri kullanarak mavi ışıkla miniSOG etiketi Excite. MiniSOG 473 nm 10'da bir omuz ile 448 nm bir uyarım maksimum vardır.
- Hatta yeşil miniSOG floresan ha sonra aydınlatma ile devamtamamen kayboldu ve polimerize diaminobenzidin kahverengi fotoğraf oksidasyon ürünü iletilen ışık kanalda çıkana kadar s. Oksidasyon ürünü hücrelerin çoğunda görünür olduğunda, foto-oksidasyon durdurmak için floresan aydınlatma kapatın.
NOT: Fotoğraf-oksidasyon objektif lens, filtre iletim dalga boylarında ve verimlilik ve aydınlatma kaynağına göre birkaç dakika sürebilir. - Postfix'i 0.1 M sodyum kakodilat, pH% 2 gluteraldehit, 1 ml 7,4 tamponu veya 30 dakika boyunca fosfat tamponu pH 7.4 ile hücreleri.
- 0.1 M sodyum kakodilat tamponu, pH 7.4 veya 0.1 M fosfat tamponu pH 7.4 içinde 20 dakika boyunca% 0.1% -0.5 ozmiyum tetroksit hücrelerin zarları sabitleyin.
NOT: Bu zarlarını stabilize gerekli ozmiyum tetroksit mümkün olan en düşük konsantrasyonu kullanılması tavsiye edilir. Polimerleştirilmiş DAB çökeltiler ESI güçlü doğrudan tespit edilebilir bir azot yüksek yoğunluğa da sahip yanaozmiyum boyama miniSOG etiketli proteini tespit etmek için ve ESI zarar verebilecek gerekli değildir. Osmiyum tetroksit çok zehirlidir! Davlumbaz çalışın ve yeterince zehirli atık imha edin. - 30,% 50,% 70,% 90,% 98,% 100,% adım etanol (her biri 5 dakika) ile bir etanol dizi hücreler kurutmak. Daha sonra, bir 1 hücreleri inkübe:% 100 etanol ve akrilik reçinesi (LR White) 1 karışımı ve 100 en azından bir 4 saat hücreleri inkübe edilmeden önce, hücre içine girmesini kolaylaştırmak için 4 saat süre ile bir çalkalama düzenine üzerine tabak koyun % akrilik reçine (LR Beyaz).
- Reçinenin polimerize etmek için, bir jilet kat akrilik reçine hızlandırıcılı kenarı ile etiketlenmiş bir 2 ml mikrosantrifüj tüpü kapağı kesti. Hızlandırıcı sadece jant kapakları ve tüp içine akmaz emin olun. Daha sonra, dikkatlice yaklaşık LR Beyaz reçine Pasteur pipeti kullanarak üçte iki tüp doldurun. Reçine iletişim zekâ içine almaz özenh jant üzerinde hızlandırıcı!
- Çanak hücreleri sızan reçine çıkarmak ve tüpün genişliği neredeyse tamamen çanak cam kaplı gözlem penceresi doldurur ve böylece dik ayakta mikrosantrifüj tüp üzerine baş aşağı çanak yerleştirin.
- Daha sonra, tüp ve lamel mühür tüp reçine artık hücrelerin kapsar şekilde tüp ters çevirmek için hızlandırıcı için 1 dakika 2 bekleyin.
- 60 ° C'da bir fırın içine tüp ile çanak yerleştirin ve 12 saat için tedavi.
- Blok kürünü zaman fırından ekli reçine dolgulu mikrosantrifüj tüp ile çanak kaldırmak ve çanak ependorf tüp ayırın. Sıvı azot ve sıcak su içinde donmuş halde öğütme süreçleri ile ayrılmasını kolaylaştırmak.
- Cam alt çanak atın ve dikkatle bloğu kaldırmak için bir jilet ile ependorf tüp açmak kesti.
- Kalıcı bir kalem ile blok etiketleyin.
- Tri Bir jilet kullanınDaha önce bir elmas veya tungsten kalem ile işaretlenmiştir alanı içerir (veya ilgi hücreleri alanı içeren) 1 ila 2 mm bölgesinde bir şey kalmayacak şekilde blok m.
- Bir ultramicrotome içinde blok monte bir düzeltme bıçakla blok Döşeme ve elmas bıçak kullanarak yaklaşık 50 nm ultra-ince kesitler halinde kesilmiştir.
- Yüksek aktarım 300 meş ızgaraları bölümleri Pick up. Bu ızgaralar çok küçük ızgara çubukları ve böylece ilgi alanında daha az hücre kapsamaktadır.
- Coat karbon yaklaşık 0.2-0.4 nm TEM elektron ışını altında istikrara kavuşturmak için bir karbon kaplayıcı kullanarak ızgaraları bölümleri.
5. Elektron Mikroskobu
- Bir enerji filtresi ile donatılmış bir TEM içine ızgaraları yükleyin. Mikroskop ve üreticinin talimatlarına göre enerji filtresi ayarlama sonra, düşük büyütme modunda bölümlerde hücreleri kontrol (normal iletim) ve karşılaştırmak(adım 4.4 'de elde edilen) uygun olduğunda bunları veri floresan.
- Ilginç özellikleri (DNA hasarı parça veya DNA onarım odakları) ile bir çekirdeğe kez enerji filtreleme moduna geçin bulundu ve kalınlık haritası kayıt edilir.
NOT: Bu prosedür sıfır kayıp ve filtresiz görüntü kaydını içerir. 0.3 kadar kalınlıklar ücretsiz yol (olay demetinin elektron% 30 örnek tarafından dağınık alır) iyi element haritaları oluşturmak için yeterince ince anlamına gelir. - Kullanılan mikroskop enerji filtresi kontrol yazılımı kullanarak elemanları fosfor ve azot Tutanak oranı haritalar. 20 eV bir yarık genişliği ile de, 120 eV enerji kaybı 20 eV ve ön kenar görüntüleri bir yarık genişliğine sahip 175 eV enerji kaybı fosfor haritası sonrası kenar görüntüleri kaydetmek. Ayrıca 35 eV bir yarık genişliğine sahip 358 eV 35 eV ve ön kenar görüntüleri bir yarık genişliği ile 447 eV azot haritalar, kayıt sonrası kenar görüntüler için.
NOT: görüntülü elemanların içeriğinde bu yana (phosphOrus ve nitrojen) (yakl.% 1), gürültü oranı daha iyi bir sinyal ile görüntüler oluşturmak için "3 pencere yöntemi" üzerinde "Oran Görüntü" (kalitatif element harita) (elementer haritayı quantitate) tercih nispeten düşüktür.
6. Görüntü İşleme
- (Örneğin, Dijital Mikrografik) edinilen resim dosya biçimini işleyebilir bir görüntü işleme yazılımı element oranı haritalar açın. Kırmızı kanal ve bir RGB görüntüsünün yeşil kanal içine fosfor haritası içine azot haritası kopyalayın, daha sonra üst üste ve haritalar hizalayın.
- Etiketli görüntü dosyası biçimi (TIFF) dosyası olarak kompozit görüntü aktarın. Katmanları kullanabileceğiniz bir görüntü işleme yazılımı (örneğin, Photoshop) görüntü açın.
- 8 bitlik veri setine (255 0) ile görüntüdeki minimum ve maksimum değerleri rescaling her kanalın dinamik aralığını ayarlayın.
- Kullanarak azot haritadan fosfor içeriği (ÇıkartProtein dağılımını gösteren bir harita nitel üretmek amacıyla "Katmanlar" pencere).
- "Dizinlenmiş renkli" içine önceki adımda oluşturduğunuz nükleik asit (fosfor) ve protein (azot) haritaları dönüştürme ve nükleik asit dağılımı ve bir mavi arama tablosu gösteren harita için CMYK renk uzayında sarı arama tablosu oluşturmak olmayan nükleoprotein haritayı göstermek için. Renkler, iki element haritalar arasında maksimum kontrast üretmek için seçilir.
- Farklı katmanlar olarak fosfor ve protein dağılımını gösteren haritalar yeni bir görüntü oluşturun ve içe aktarın. Birbirine bindirilmiş iki katmanı görmek için "ekranı" şeffaflık modunu kullanın.
- Adım 5.2 elde sıfır kayıp görüntüyü açın. Bu görüntü, geleneksel TEM görüntü benziyor kaydedilen alanın görüntüsünü temsil ancak numune ile çarpışan olmadan numune geçtik elektronları içeriyor. IhracatTIFF görüntüsü olarak bu görüntü.
- Bir fotoğraf editörü ihraç sıfır kayıp görüntü açın ve element haritayı gösteren görüntünün üst tabakası içine kopyalayın. "Ekran" şeffaflık modunu kullanarak görüntüyü hizalayın.
- İsteğe bağlı eşik segment sıfır kayıp görüntü miniSOG kaynaklanır sinyali. Yukarıda tarif edildiği gibi ayrı bir katman olarak elde edilen görüntü ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ESI
Konvansiyonel TEM görüntüleri ile çekirdeğe (Şekil 1) ESI görüntülerini karşılaştırarak (örneğin, Şekil 7-1) kolayca ayırt edilebilir anatomik yapıların dramatik bir artış ortaya koymaktadır. Kromatin sırtlar sarı görünür ve fare hücrelerinde chromocenters belirlemek oldukça kolaydır. Prefabrik ribozomlar önce fosfor yönünden zengin olan RNA, ek olarak nitrojen açısından zengin bir protein, yüksek miktarda yana çekirdekçikler kolayca kendi yuvarlak yapı ve değişik renk kromatin ayırt edilebilir. Çekirdeğin ve nükleer gözeneklerin sınırında ince bir tabaka periferik kromatin kesme azot bakımından zengin yapılar olarak görülebileceği gibi periferik kromatin bulunur. Genellikle lamina periferal kromatin dışında çok ince bir mavi tabaka olarak görülebilir. Sitoplazmada, fosfor bakımından zengin birçok küçük parçacıklar cangörüldüğü. Bu çekirdeğin dışında boyutları, bolluk ve yere göre ribozomlar gibi tespit edilebilir. Interkromatin alanı kromatin arasında yer alan protein açısından zengin bölge olarak görülebilir. Bu nükleer organları ve ribonükleoprotein parçacıklar ve Ribonükleoprotein granül kümeler (Şekil 2) gibi küçük sarı sinyaller, zengin alanları içerir. Ikinci granül kümeleri interkromatin adlandırılır ve karakteristik Şekil 1B, C ve D bu mitotik kromozomlar, sentrozom, mitokondri ve sentromer gibi bilinen diğer yapıların görünüşünü göstermektedir. Pre-mRNA, raptetme için gerekli proteinler açısından zenginleştirilmiştir. Şekil 2'de, ham element oranı haritalarından renkli karma resimler oluşturmak için kullanılan adımların özetlenmiştir. Fosfor haritası (yeşil) ve RGB renk uzayı (üst üste) azot haritası (kırmızı) birleştiriliyor numunede bu elementlerin miktarlarının daha iyi değerlendirilmesini sağlar. However, CYMK renk uzayında proteinin ilk (mavi) ve fosfor harita ile birleştirme (sarı) vermek üzere nitrojen haritadan nükleik asit içeren yapıların katkı tüketmek için fosfor sinyalinin çıkarılmasıyla nükleoprotein daha farklı bir görsel gösterimini sağlar ve non-nükleoproteini (alt sıra). Bu veriler daha kolay teknolojisi ile yabancı kişiler tarafından yorumlanır izin verir.
MDC1, 53BP1 ve Rad52 ifade Lazer microirradiated hücreler
Nedeniyle lazer hasarı parça kullanıcı tanımlı boyut, şekil ve konumu, lazer microirradiated hücrelerde DAB birikimi bölgesi miniSOG sistemini kullanırken TEM bulmak çok kolaydır. Düşük büyütme iletim modu (örneğin, geleneksel bir aydınlık TEM) çekilen resimler karakteristik hasar parçalarını ortaya çıkarmak ve gömme önce bir floresan mikroskobu ile kaydedildi verilerle karşılaştırılabilir.Bağıntılı mikroskopi amaçlanan ise kolay tanımlanması ve tek çekirdeklerin tehcir izin verir, çünkü bu özellikle yararlıdır. (Şekil 2-4).
İlk örnek (Şekil 3) sabit olarak MDC1 miniSOG-mCherry sentezleyen bir U2OS hücre çizgisi gösterilmektedir. Bir lazer microirradiation deneyinde, miniSOG ve mChrerry etiketleri içeren MDC1 işe alım (veriler gösterilmemiştir), bu proteinin GFP etiketli versiyonları çok benzer olmuştur. Hücreleri DNA hasarı indüksiyon sonrası 1 saat Tespit ve TEM için numune hazırlama, MDC1 hasar izleri kolayca (floresan verilerine çok iyi geldi çekirdekler arasında koyu çizgili, normal TEM modunda ultra ince kesitler, tespit edilmiştir Şekil 3-5). Protein dağılımı bakıldığında, azot sinyali açık bir artış, lazer hasar siteleri gözlenebilir. Bu esas olarak polimerize Diamino neden olduğu Burada işaret edilmelidir azot bakımından zengin ve miniSOG sinyalini güçlendirir nobenzidine yerine sadece zarar parça onarım proteinlerinin birikimi sayesinde daha tamir proteini etiketledi. Hasar parçalarını yapısı ile çekirdeğin geri kalanında kromatin yapısını karşılaştıran net bir farklılık göstermektedir. Hasarlı kromatin (diğer bir deyişle, Şekil 3'te kesik çizgilerle içinde gösterilmiştir) daha nükleolazma kalın sırtlar meydana ışınlanmamış kromatin, aksine yoğunluğu azaltılmış görüntülenir. Hasar parçaları içinde, nükleik asitten MDC1-miniSOG protein açısından zengin ama ücretsiz (Şekil 3 II2, IIb, IIc ve illa oklarla vurgulanan) nükleer organları (200-300 nm) da gözlenebilir. Bu teknik olmadan kromatin-serbest yapılar olarak bu nükleer organları tanımlamak için çok zor olurdu. Aynı zamanda MDC1 bilinen biyokimya tarafından tahmin değil zarar sitelerine karmaşıklık ek bir düzeyini göstermektedir.
MDC1 transfekte edilmiş hücreler daha önce tarif edilen hasar gibi aynı şartlar kullanılarak oluşturulan 53BP1 (Şekil 4) hasar yolu bakıldığında ntent ">, çok benzer sonuçlar foto-oksidasyonu ile hazırlanır. sinyali gözlemlenebilir miniSOG kalabalık ve kromatin kıvrımları arasındaki boşluğu doldurdu. Ağır lekeli nükleer organları da (Şekil 4 D, E, F bir okla vurgulanır) gözlenebilir.Rad52-GFP yapıları ile deneylerden, bu Rad52 küçük parlak microcompartements lazer kaynaklı hasar yolu boyunca 24 oluşturacak bilinmektedir. Geleneksel ışık mikroskobu çözünürlüğü limiti nedeniyle, onlar hasarlı DNA'nın ilgili ne kadar büyük bu yapılar gerçekten ve nasıl belli olmuştur. Kurucu Rad52-miniSOG-mCherry ifade lazer ışınlanmış U2OS çekirdeklerinde TEM görüntüsünün baktığımızda, bu kurumların büyüklüğü ortalama (150-250 nm) olmak ölçüldü. İşte buHatta daha da şaşırtıcı ESI ile bu odakların bakmak. Önceki örneklerde aksine, Rad52-miniSOG mCherry odakları zarar yolu boyunca çok farklı bir şekilde organize edilebilir gibi görünmektedir ve protein içeren ve iç içinde tespit edilebilir bir nükleik asitleri temin edilen kompakt bir nükleer gövde benzeri yapılar gibi görünmektedir. Bizim kombine miniSOG ve ESI yaklaşımla elde edilen hasarlı bölgelerde nükleik asit / protein ilişkisi bakarak dayanarak, DNA tamir odaklarının yüzeyinde ziyade iç gerçekleşecek olabileceğini düşündürmektedir.
Şekil 5 benzer sonuçlar Şekil düşük görüntü 3-III Şekil. Hasarlı bölgede kromatin daha olmayan ışınlanmış bölgelerde kromatin (kırmızı çizgiler ile özetlenen alanı görmek) ile karşılaştırıldığında yoğunluğu azaltılmış gibi görünüyor.
Gamma ışınlanmış hücreleri
Lazer Mikro-ışınlama quickl için uygun bir araçtır ikenDNA lezyonlarının sitelere alımı için floresan etiketi içeren y testi proteinleri, karmaşık hasar (çift zincir kırıkları, tek iplikli molaları, baz hasarı ve cyclopyrimidine dimerleri) 25 büyük miktarda oluşturur. Daha doğrudan DNA çift zincir kırıkları etrafında oluşturan bölmeleri incelemek amacıyla, biz gama ışınlarına maruz hücrelerin tek tek DSBs etrafında oluşturan DRFs incelendi.
Stabil 53BP1-miniSOG-mCherry ifade eden U2OS hücreleri gama ışınlama 2 Gy maruz kalan ve ışınlama yarım saat sonra tespit edildi. Nükleolazma dağılmış büyük odaklar karakteristik desen (Şekil 6Ia) gözlenebilir. Diaminobenzidin fotoğraf oksidasyonu sonra floresan MCherry sinyalleri floresan mikrograflarında yerleşmişti pozisyonlarda ortaya çıkan karanlık noktalar elektron mikrograflar (Şekil 6Ib ve c) görülebilir. Bu noktalar görüntüleri TEM ilişkili olabilirki (Şekil 6Id e) düşük büyütme alınmıştır. Çapı yaklaşık 1-1.5 um olduğu ortaya çıktı, bu odakların, ESI görüntüleri, ilginç bir yapı gösteriyordu. Kromatin İnce şeritler yaklaşık iki kalınlığının 53BP1 proteini ile serpiştirilmiş gibi görünüyordu.
Diğer deneylerde, hücreler radyasyon daha yüksek miktarda maruz bırakıldı ve daha sonraki zaman noktalarında daha büyük odaklar oluşturmak ve son derece ince bölümler bunları bulmayı kolaylaştırmak için, (3 saat ve 6 saat sonra, sırasıyla) (Şekil 7) sabit. Ayrı ayrı nükleoprotein ve protein harita edebiliyoruz, çünkü ESI odaklarının yapısı zamanla yeniden görünür olduğunu ortaya koymaktadır. Odak 53BP1 proteinin nispi miktarı, kromatin, daha fazla çevresel pozisyon alır iken arttırdığı görülmektedir.
53BP1 odakları da görünür beri altı çoğaltmak bölgelerinde G1 hücrelerinde "şifreli odakları" olarak hücreleri olmayan ışınlanmışd DNA 26,27, bu odaklar da görüntülendi. Bunlar şifreli odaklar radyasyon kaynaklı odaklar protein göreceli yüksek miktarda liman gibi görünüyor ve kromatin ilginç düzenli bir yapı gösterirler.
Bu nedenle, miniSOG yöntemi kullanılarak DNA tamir odaklar bileşenleri görselleştirme DNA hasar bölgelerinin belirlenmesi ve kromatin Etiketli onarımı proteini nisbetle dağılımının haritasının çıkartılması yardımcı olur.
ESI görüntüde görülebilir yapıların Şekil 1. Genel Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Fare embriyosu akciğer fibroblast (A) ESI görüntüsü. Kromatin sırtlar (sarı) çekirdek plazması (camgöbeği) interkromatin sp doldurarak çevriliace. Çekirdek nükleer gözenek kompleksleri (mavi) tarafından kesilir periferik heterokromatin ve chromocenters (sol alt) ile çevrilidir. Çekirdekçikler açıkça onların renklerine göre ayrılabilir. Bu nükleik asit, protein nisbetle miktarı, kromatin olduğundan daha nükleolar yapıda daha yüksek olmasından kaynaklanmaktadır. Çekirdeğin dışında, mitokondri ve (nükleik asit yönünden zengin) ribozomlar kolayca tespit edilebilir.
Görüntünün sol üst oyuk protein açısından zengin parçacıklar olarak görülebilir bir çekirdek ve sentrozomlarla (oklara bakınız), (B) Görüntü.
Bir metafaz plakadan (C) Kesit. Son derece yoğun metafaz kromozomları sol alt köşesine sol üst köşesinden yayılan bir diske uyumlu hale getirmiştir. Azot yüksek konsantrasyonları bazı kromozomların yüzeyinde görebilir. Bu alanlar kinetokorlar (oklara bakınız).
(Üst sıra) satırda ilk iki resim fosfor ve azot oranı haritalar gösteriyor. Üst üste son resmi RGB renk uzayında bindirilmiş bu element haritalar gösteriyor. Sarı yapılar, fosfor ve azot varlığını yansıtmaktadır nükleoproteinleri temsil etmektedir. (Alt sıra) birinci resim esas numunedeki nükleik asit dağılımı ortaya fosfor haritasını gösterir. Orta resim nükleik asit-tükenmiş / negatif stru dağılımını göstermektedir ctures. Bu azot haritadan fosfor haritası çıkarılarak hesaplandı. Sağ alt resim nükleik asit harita ve subtraktif renk alanı protein haritasının bir birleştirme göstermektedir. Bu renk kompozit bireysel yapıların belirlenmesine yardımcı olmak ve nükleoprotein olarak sınıflandırmak veya nükleoprotein değil kullanılmalıdır. Fosfor ve azot bereket kantitatif bilgiler net fosfor ve azot net gri tonlama haritalardan veya üst satırda olduğu gibi katkı renkler kullanılarak oluşturulan kompozit görsel toplanan olmalıdır. 
Çok renkli ESI resmin Şekil 2. Yaratılış 
Stabil MDC1-miniSOG-mCherry ifade U2OS hücrelerinin Şekil 3. Lazer Mikro ışınlama. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ic yeşil meydanda tarafından vurgulanan (II) alanı, büyütülmüş ve normal iletim modu (Ha) ve ESI (IIb) gösterilmiştir. IIc hasar parçanın sinyali ile ESI görüntünün bir kaplamasını göstermektedir. Hasar parça sinyali üst görüntü eşikleme elde edildi.
(III), lazer mikro yapısı örnekleri,lazer hasarlı alanı dışında -irradiated kromatin ve kromatin.
Stabil 53BP1-miniSOG-mCherry ifade eden hücrelerin Şekil 4. Lazer Mikro ışınlama. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sol kolon: (A) Floresan, (B) Geleneksel TEM ve çekirdeği ışınlanmış aynı lazer mikro (C) ESI görüntü.
Sağ sütun: (D) Geleneksel TEM, (E) ESI ve (D) eşikleme ile segmente edilmiş miniSOG sinyali ile ESI görüntü (F) Yerleşimi (adım 6.10 bakınız)
Stabil Rad52-miniSOG-mCherry ifade ve lazer mikro-ışınlama zarar Şekil 5. U2OS hücre hattı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sol alttaki bir hasar parça ile bir microirradiated lazer U2OS çekirdeğini gösteren düşük büyütme TEM görüntüsü ile bir floresan görüntü (A) Yerleşimi.
Bir lazer mikro (B) Temsilcisi konfokal floresan mikroskobu görüntü hasarı parça (kırmızı sinyal) boyunca küçük odaklar karakteristik desen gösteren Rad52-miniSOG-mCherry ifade Hoechst lekeli çekirdeği (mavi) ışınlanmış.
(C) Geleneksel TEM, (D) ESI,
Bütün çekirdeğin bağlamında lazer kaynaklı hasar parçayı gösteren stabil bir şekilde Rad52-miniSOG-mCherry ifade başka U2OS çekirdeğin (G) ESI görüntüsü.
Şekil stabil 53BP1-miniSOG-mCherry ifade 6. U2OS hücreleri 2 Gy ile ışınlanmış ve 30 dakika sonra düzeltildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
(I) 'in: a) Floresans görüntüsü gama ışını ile indüklenen 53BP1 odakları gösteren. b) fotopolimerizasyon sonra ışık görüntü Bulaşan. c) Oviletilen ışık görüntü ile floresan erlay. d) Düşük büyütme TEM görüntüsü (siyah şerit) bir TEM ızgara bar var. düşük büyütme TEM görüntüsü ile floresan görüntü e) Yerleşimi.
Normal TEM ve ESI modunda kaydedilen iletilen ışık görüntüde bir yıldızla işaretlenen (II) Hasar odağı. a) Sıfır kaybı, b) ESI, c) Fosfor, d) Protein e) Kaplama ESI ve sıfır kayıp görüntüden parçalı sinyali.
Normal TEM ve ESI modunda kaydedilen floresan görüntüde bir çarpı ile işaretlenmiş (III) Hasar odağı. a) Sıfır kaybı, b) ESI, c) Fosfor, d) Protein e) Kaplama ESI ve sıfır kayıp görüntüden parçalı sinyali.
Işınlama farklı zamanlarda sonra odaklar arasındaki odaklar yapıda Şekil 7. Değişiklikleri. < / strong> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
U2OS 53BP1 miniSOG MCherry hücreleri 3 saat (1A-E, FJ) ve sırasıyla 6 saat (2A-E, FJ) sonra sabit gama ışınlama 6 Gy maruz. 3 şifreli odak (AE) gösteren bir ışınlanmamış U2OS 53BP1 miniSOG MCherry çekirdeği gösterir. ESI resimler için ESI (nükleik asit ve protein), nükleik asit (tek başına), protein (tek başına), ESI (nükleik asit ve protein) sunulan + miniSOG sinyal bölümlenmiştir.
Osmiyum tetroksit post fiksasyon ihmal edildiğinde Şekil 8. DNA onarım odakları hala geleneksel iletim modunda görebilir. arge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ozmiyum tetroksit ile muamele olmayan bir örnek iki 53BP1 odaklar gösteren U2OS çekirdeğinin ultraince bölüm (50 nm). (A), geleneksel TEM modunda, bile kontrast güçlendirilmeden DAB polimer tarafından boyanan siteleri görmek mümkündür ağır metal leke. (B) odaklarının kontrast ayrıca (çoğul saçılma olaylardan o kökenli tüm elektronları uzakta filtreleme) sıfır kayıp görüntüleri alarak gelişmiş olabilir.
Haritalama fosfor için optimal enerji penceresi ayarlarının Şekil 9. Belirlenmesi
(A) 120 eV 155 eV sonrası kenarı ile fosfor ve ön kenar için kaydedilen Elemental oran haritası.
İçerik "> (B) Element oranı haritası 120 eV 175 eV sonrası kenarı ile fosfor ve ön kenar kaydetti.(C) 120 eV enerji kaybı ve aksine en iyi kombinasyonunu belirlemek için 140-200eV enerji kaybına arasında değişen bir değişken son kenar pencere sabit bir ön kenarı penceresinden fosfor oranı haritaları hesaplamak. Aynı fosfor bakımından zengin ve fosfor fakir bölge yayılan bir çizgi-tarama parlak yoğunluğu farkı ve dimmestpixel 175 eV enerji kaybı sonrası kenar resim seçildi yüksek kontrast değerlerini (dinamik aralık) gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ESI özellikle fosfor bakımından zengin olan alanlar harita yapabiliyor çünkü çekirdeğinde kromatin ve ribonükleoproteinlerin farklı durumları incelemek için mükemmel bir araç olarak hizmet verebilir. Bu derinden bir elektron mikroskobu ile elde edilen ve spesifik olmayan zıt yöntemleri bağımlı değildir olabilir ayrıntı miktarını artırır. ESI bir dezavantajı aynı hızlanan gerilimde geleneksel TEM daha ince kesitler gerektirir. Bu seri bölümleri ile çalışan veya tomografik yöntemlerle 28 kullanılarak aşılabilir.
Bilgi bir çok fosfor ve azot dağılımları bakarak elde edilebilir olsa da, bazı proteinlerin dağılımının haritasının çıkartılması mümkün ilgi çekicidir. Yöntem, bu çalışmada sunulan ile, ESI diaminobenzidin site-spesifik polimerizasyona dayalıdır; yöntemleri ile kombine edilebilir olduğu gösterilmiştir. Bu yöntem, bir fu ilave etmemesine karşınESI için ll yeni bir renk, bir protein dağılımının haritasının açıkça yararlıdır. Bu kromatin etkileşim proteinler için geçerlidir. Bir çalışmada, birden fazla protein popülasyonu görselleştirmek için ihtiyacı varsa önceden foto-oksidasyon 9, ön gömme boyama olarak uygulandığında, immünolojik kullanarak etiketleme yöntemleri hala kullanılabilir. Kararlı hücre çizgileri ile karşılaştırıldığında, geçici transfeksiyonlar ekspresyon seviyeleri hücreler arasında önemli ölçüde değişebilir ve bu nedenle sabit etiketli protein benzer miktarlarda eksprese eden birden fazla hücreleri bulmak için yapabilir bir dezavantaja sahiptir. Bu nedenle, stabil hücre hatlarının oluşturulması tavsiye edilir. Bununla birlikte, fluoresans görüntü kullanılarak protein ekspresyonunun nispi miktarını hakim ve geçici transfeksiyonu takiben ara madde ifade ile hücreleri seçmek mümkündür.
MiniSOG füzyon etiketini kendisi flüoresan ise de, kuantum verimi GFP (0,37 vs 0.6) 10 önemli ölçüde daha kötüdür. PurpmCherry gibi ek floresan protein etiketi ekleyerek karşılıklı mikroskopi ose, miniSOG uyarma oluşur tekli oksijenin üretiminin olmadan canlı hücrelerde görüntüleme sağlar. MiniSOG ile işaretlenmiş olan proteinlerin ekspresyon seviyesi, DAB-ihtiva eden tampon maddesi içinde oksijen miktarı ve pH da foto-oksidasyon hızını etkileyebilir. Bazen, çünkü fotoğraf oksidasyon reaksiyonunun ışık bağımlılığı ilgili bölge homojen foto-oksidasyonu gerçekleştirmek için oldukça sorunlu olabilir. Uzun süreli foto-oksidasyon spesifik olmayan boyama ve ESI öğeli özel sinyallerin algılanmasını karmaşıklaştırabilir numunede çok fazla ağır metal birikimi, yol açabilir. Foto-oksitleme işlemi bu nedenle genellikle lamel birkaç hücre içeren çok küçük bir bölgesi, normal olarak boyanır oldukça zaman alıcıdır.
Biz miniSOG kombinasyonu yapışık hu bir tek tabaka kullanarak ESI ile etiketli proteinlerin göstermiştirAdam kanseri hücre hattı. Prensip olarak, yöntem, aynı zamanda sürece miniSOG-etiketli makul seviyelerde protein ve uzun saydamlık ve oksijen difüzyon ifade etmek mümkündür ve DAB gibi herhangi bir başka örnek (maya, bakteri, doku embriyo) uygulanabilir Uygun foto-oksidasyon ve böylece homojen boyama sağlamak için yeterli derecede yüksek. Süspansiyon hücreleri için, bu tür poli-L-lisin gibi bir yapıştırıcı kullanılarak bir kapak slip üzerinde hücrelerin yerini sabitlemek için avantajlı olacaktır. Kalın numuneler için, daha düşük bir sayısal diyafram ile hedefleri daha homojen bir aydınlatma elde edecek, ancak fotoğraf okside daha uzun sürer.
. Osmiyum tetroksit kullanımı dahil - Biz mümkün olduğunca tarafından Shu ve arkadaşları 10 yayınlanmış orijinal protokole yakın miniSOG-etiketli füzyon proteinlerinin kullanımını sunduk. Orada o ayrı tercihen DAB-polimerler ve membranlarda yatırılması gelen, osmiyum tetroksit bazı reaktivite gösteriyor ki gözlenebilir venumunenin biyolojik bir materyal (10 Şekil 3) çoğu üzerinde birikme. Osmiyum tetroksit 45 eV bir element kenarı vardır. Bu sinyal ve plazmonlar numune geçişi sırasında birden enerji kaybı olayları tabi numune artışları ve tek elektronların kalınlığı olarak elektron enerji kaybı spektrum üzerinde bindirilmiş olabilir. Yüksek OsO 4 konsantrasyonları numune hazırlamada kullanılan, bu fosfor element haritaları kalitesini sınırlayabilir. Daha önce 10 Kullanılmıyor ne göre anlamlı derecede düşük olduğu biz burada kullanmış konsantrasyonları, kaliteli fosfor haritaların üretimi sağladı. Kullanarak bir deneyde miniSOG yüksek OsO 4 konsantrasyonları talepleri etiketli proteinlerin, hala iyi fosfor haritası oluşturulmasını sağlar iyi konsantrasyon ampirik olarak tespit edilmesi gerekecektir.
Bu DNA tamir odaklarda oluşturan DAB polimer sufficie olduğunu buldukozmiyum tetroksit ile post-fiksasyon ihmal bile (daha iyi kontrast veya sıfır kaybı modunda) ntly alışılmış TEM modunda görüldüğü üzere, yoğun (bakınız Şekil 8). Bu şekilde kaydedildi sinyallerin segmentasyon osmiyum ile tedavi edildi örnekleri kullanarak gibi sağlam oldu. Görüntülenmiştir zorundadır nükleer protein bağlı olarak, oluşturduğu yapıların büyüklüğü ve membran sistemleri görselleştirmek için gerekliliği, osmiyum tetroksit kullanılması gerekli olmayabilir ve ihmal fosfor elementi imzasını maskeleme potansiyelini ortadan kaldıracaktır.
ESI 18,29,30 kullanan diğer yayınlara göre gürültü en az miktarda element oranı haritaları oluşturmak amacıyla öncesi ve sonrası kenar resimler için farklı ayarlar kullandık. Biz ampirik el yazması sunulan ayarları belirledik (şekil 9). Kenarlarda seçilen ayarlar Ele düzeltmek için gitmelidirtoplama pencereleri sürece zihinsel haritalar numunede mevcut olan diğer unsurları ile örtüşen. Bizim durumumuzda, kükürt gibi bir eleman olabilir. (Amino asitler metionin ve sistein oluşur) sülfür konsantrasyonu son derece düşüktür ve sadece önemsiz bir miktarda hesaplanan harita katkıda bulunmasından dolayı biz dezavantajları daha ağır basar Burada kullanılan ayarlar kullanılarak elde daha iyi bir S / N oranı inanıyoruz Bu örnekteki kükürt izleri doğabilecek.
Biz ESI ve TEM teknikleri ile kombine DNA onarım proteinleri MDC1, 53BP1 ve Rad52 kullanarak nanometre çözünürlüklerde DRFs ultra yapısını ortaya çıkardı. Kromatin ve bireysel DSB onarım protein lokalizasyonu organizasyonu bu yaklaşımı kullanarak çözüldü. Kromatin sırtlar arasındaki boşluğu doldurmak için lazer mikro-ışınlama DNA ve onarım proteinleri eğilimi izleyen DNA lezyonları zengin etki Onların yerelleştirme gördü. Rad52 durumunda, pla içindeys homolog rekombinasyon bir rol, lazer zarar iz boyunca nükleer vücut gibi küresel yapılar oluşumu gözlenmiştir ve bu durum, diğer test edilen iki protein aksine oldu. Hasar gamma ışıması tarafından uygulandığında, 53BP1 zarar kromatin yaklaşık odaklar oluşturdu. Odaklarda kromatin ve protein göreli kompozisyonu ve pozisyon zamanla değiştirmek gibi görünüyor. Bu proteinlerin ve kromatin organizasyonu hasarlı kromatin yanı sıra değişiklikleri ve nükleer organlarının kompozisyonu arasındaki ilişki tüm kolayca doğrudan bu özelliklerini değerlendirmek olamaz zıt maddeler uranyum kullanan ve kurşun geleneksel aydınlık mikroskobu ise ESI tekniği kullanılarak elde edilebilir. Böylece, bu teknik özellikle DNA üzerinde etkili süreçler için yapı-işlev ilişkilerinin, çalışma için yüksek potansiyeli göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
- Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).
- Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
- Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
- Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
- Egerton, R. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
- Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041 (2011).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
- Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
- Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
- Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
- Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
- Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
- Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
- Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
- Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
- Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).
- Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
- Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
- Aronova, M. A., et al. Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
- Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
- Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).
