Summary
Здесь мы приводим протокол к синтезу новых, высоких соотношение сторон биокомпозитов в биологических условиях и в жидких средах. В биокомпозиты шкале от нанометров до микрометров в диаметре и длиной, соответственно. Наночастицы меди (ЧАЭС) и сульфата меди в сочетании с цистина являются ключевыми компонентами для синтеза.
Abstract
Цель этого протокола заключается в описании синтез двух новых биокомпозитов с высокой соотношением сторон структур. В биокомпозиты состоят из меди и цистина, либо с наночастицами меди (ЧАЭС) или медного купороса, способствующего металлический компонент. Синтез проводят в жидкости в биологических условиях (37 ° C) и самоорганизующихся композитов форме после 24 часов. После образования эти композиты обладают высокой стабильностью в обоих жидких сред и в сухом виде. Композиты масштабироваться от нано- до микро- диапазон в длину, и от нескольких микрон до 25 нм в диаметре. Выбросов поле сканирующей электронной микроскопии с энергетической дисперсии рентгеновской спектроскопии (EDX) показал, что сера присутствует в НП-производных линейных структур, в то время как она отсутствовала из исходного материала CNP, таким образом подтверждая цистина в качестве источника серы в конечных нанокомпозитов , Во время синтеза этих линейных нано- и микро-композитов, разнообразных длин улuctures формируется в синтез судна. Ультразвуком жидкую смесь после синтеза был продемонстрирован, чтобы помочь в контроле средний размер структур путем уменьшения средней длины с увеличением времени обработки ультразвуком. Поскольку образованные структуры обладают высокой стабильностью, не агломерации, и образуются в жидкой фазе, центрифугирование также может быть использован для помощи в концентрации и сегрегации, образованные композитов.
Protocol
1. Планирование экспериментов
- Определить объем медных нанокомпозитов, необходимых для синтеза. На этой основе, выбрать количество мелких флаконах объемом 25 см (2), или больших колбах, как указано ниже, в подготовке материалов.
- Для этого синтеза, использовать 37 ° C инкубатор с 5% СО 2 и по меньшей мере 40% влажности. Убедитесь, что такое инкубатор доступен и что она не будет повторно нарушена в течение периода синтеза (примерно 24 ч).
ВНИМАНИЕ: Повторное открытие и закрытие инкубатора, безусловно, вызывают колебания температуры, которые могут привести к изменению синтеза нанокомпозитных структур.
2. Подготовка материалов
- Подготовьте все материалы свежие до начала эксперимента, путем добавления твердых материалов к действию растворителей перед синтез чтобы начать. Ведение исходных растворов цистина и медь исходных материалов в жидкости в течение долгого времени бEfore эксперимент не рекомендуется и может привести к переменным успехом. После вскрытия от поставщика, продолжают исходных материалов сухих обертыванием верхней части контейнера с парафильмом.
Примечание: следующий протокол используется в качестве примера для реакции в 25 см колбы культуры 2 клеток с использованием 7 мкл цистина, 6643 мкл стерильной воды, и 350 мкл ЧАЭС. - Приготовьте 2 мг / мл раствора наночастиц меди путем взвешивания, по меньшей мере 2 мг CNPS. Одноразовые перчатки во время этого шага, чтобы предотвратить возможный контакт с ЧАЭС с кожей. Поместите наночастиц в пустой стерильной 16 мл стеклянный флакон.
- Во флакон, содержащий CNPS, добавить стерильной деионизированной воды в соответствующем объеме, чтобы сделать 2 мг / мл раствора, и вихрь решение в течение 20 сек, чтобы обеспечить дисперсию наночастиц перед началом синтеза (по крайней мере, 1 мл общего объема рекомендуется). Не заполняйте флакон более половины пути с водой, так как это будет препятствовать смешивания встряхиванием. ЧАЭС Вильл быстро оседают на дне флакона и темным цветом (серый до черного).
- Разрушать ультразвуком решение для CNP 17 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить максимальную дисперсию ЧАЭС до начала синтеза. Периодически проверяйте, чтобы убедиться, что ЧАЭС смешиваете в связи с ультразвуком. После успешного ультразвуком, ЧАЭС остаются взвешенными в растворе в течение по крайней мере 30 мин и решение будет темного цвета.
- Взвесить достаточную массу цистина, чтобы сделать 72,9 мг Раствор / мл для синтеза. Так цистина непосредственно не растворим в воде, поместить взвешенное цистина в антистатический весом судна.
- Для взвешивания сосуд, содержащий цистин, добавить достаточный объем стерильной, 1 М NaOH, так что цистин полностью растворяется. Например, растворите 7,29 мг цистин полностью в 100 мкл 1 М NaOH, чтобы 72.9 мг / мл раствора.
- Для поддержания стерильных условий, осуществлять этот шаг в стерильной поток тканевой культуры капот.
ВНИМАНИЕ: NaOHна 1 М концентрации каустической, так что носить одноразовые перчатки во время этого шага, чтобы предотвратить контакт концентрированного NaOH с кожей
- Работа в стерильной капот культуры ткани, добавить 7 мкл цистина с 6643 мкл стерильной воды в стерильной колбе сначала синтеза, и пусть инкубировать в течение 30 мин в термостате при 37 ° С с крышкой флакона вентилируемые (свободные), чтобы обеспечить эффективное смешивание. Ресуспендируют 2 мг / мл раствора CNP встряхиванием в течение 30 сек, так CNPS будет решен после стадии обработки ультразвуком.
- Добавьте достаточное решение CNP в синтез колбу (с использованием стерильных), чтобы сохранить следующие соотношения компонентов: 1 объединить части цистин, 50 частей ЧАЭС и 949 части стерильной воды в 25 см 2 колбу клеток культуры, чтобы начать синтез. Например, для синтеза объема 7 мл, сочетают 7 мкл исходного раствора цистина, 350 мкл CNPS и 6643 мкл стерильной воды. Установите крышку на колбу и затянуть так, чтобы она SECURе.
- После объединения всех компонентов для синтеза, осторожно перемешать в колбе, вращая 4-5 раз. Поместите колбу в CO 2, инкубаторе и вентиляционные колбу, ослабив крышку так, что будет газообмен и из колбы в процессе синтеза.
- Разрешить синтеза работать в инкубаторе в течение приблизительно 24 часов. Во время синтеза, можно наблюдать, с микроскопией и на глаз, формирование высокой линейных композитов.
Примечание: процесс формирования структур может произойти внезапно в том смысле, что структуры первоначально трудно обнаружить, а затем появление быстро переходит к увеличению плотности. Поэтому формирование может происходить до 24 часов. Процесс также может наблюдаться на глаз сразу структуры становятся больше и их плотность увеличивается. В то время как поколение структур можно наблюдать в течение долгого времени под микроскопом и на глаз в более поздние моменты времени, постоянно прерывая условий синтеза и температуры приведет к беднымРезультаты синтеза. - Завершить синтез биокомпозитов от плотно укупорки синтез колбу и хранения судна в холодильнике (4 ° С). Структуры, порожденные однажды, остаются стабильными в этом виде, по крайней мере год. Этикетка колбу с условиями синтеза, в том числе компонентов, используемых, дата синтеза и времени инкубации синтеза до расторжения.
3. Синтез Использование медного купороса
- Провести синтез самосборки заменой ЧАЭС с медной сульфатной соли. Использование метода стерилизации, растворяются по меньшей мере, 2 мг меди сульфата в достаточном объеме стерильной деионизированной воды, чтобы сделать 2 мг / мл раствора. Кристаллы сульфата меди легко переходят в раствор при этой концентрации, но вихрь флакон, если это необходимо, и проверить на глаз, чтобы гарантировать, что все кристаллы растворяют.
- После подготовки сульфата меди, осуществить синтез, как описано выше, но с заменой CNPS с сульфатом меди.
Примечание: Самоорганизующиеся нанокомпозитов с использованием сульфата меди в качестве исходного материала, оказались гораздо более последовательным в окончательной форме, чем для структур, синтезированных из CNPS. - Завершить синтез сульфата меди биокомпозитов за CNP композитов (шаг 2.6) и хранить их долгосрочные при 4 ° С.
4. Характеристика и обращение биокомпозитов после синтеза
- Охарактеризовать биокомпозитов полученные от ЧАЭС и от медного купороса белым световой микроскопии 9 и с помощью электронной микроскопии 9.
- Для определения характеристик и проверки биокомпозитов после синтеза белым световой микроскопии, использовать инвертированный микроскоп, как композитов будет располагаться на нижней поверхности колбы в течение нескольких минут укладки колбу плоской, а затем могут быть введены в фокусе. Используйте параметр светлого поля на микроскопе, чтобы максимизировать контраст между биокомпозитов и жидкой среде. Композиты, полученные из ЧАЭС и КСза купороса и появляются ясно непрозрачными в цвете, но не вступившие в реакцию агрегаты CNP появится очень темный цвет.
- Используйте цифровой камерой, подключенной к микроскопу для захвата изображений из композитов. Будет наблюдаться диапазон длин для отдельных структур.
- Для характеристики и осмотра биокомпозитов после синтеза и после хранения при 4 ° С, позволяют колбы прийти к комнатной температуре в течение не менее 15 мин, как колбы образуют конденсат изначально при удалении от холодильника, который будет затруднять эффективное фокусировки при проведении томографии микроскопии. После выдерживания уравновешивание до комнатной температуры, протереть верхнюю и нижнюю поверхности колбы с чистым бумажным полотенцем, чтобы максимизировать качество изображения микроскопии.
- При работе или изображений композитов, которые были сохранены в долгосрочной перспективе, вихревые колбы в течение 30 сек отделить скопления композитов, которые образуют в то время как в холодильнике. После встряхивания, осмотрите структуры с перевернутой микрофономroscope чтобы гарантировать, что агрегаты диссоциируют, и повторить вортексе по мере необходимости.
- Используйте перевернутую белый световой микроскопии, чтобы оценить эффективность синтеза для данного эксперимента с использованием ЧАЭС. Например, документ на наличие или отсутствие непрореагировавшего CNPS в синтезе колбах, используемых для CNP-производных биокомпозитов из колбы с различными параметрами, такими как время синтеза.
Примечание: Индивидуальные ЧАЭС слишком малы, чтобы наблюдать с помощью оптического микроскопа, но не вступивший в реакцию CNP агрегатов появится в круглом виде и темных объектов, в отличие от синтезированных успешно CNP-композитов, которые будут иметь высокую соотношение, линейную форму, и будет иметь ряд различных длин. Избегайте проведения синтеза слишком долго из период времени до окончания, так как это приведет к сильно разветвленных "ежа" структур типа, которые трудно диспергировать в отдельных структурах, образованных раз. - Используйте перевернутую белый световой микроскопии для оценки эффективностисинтеза для данного эксперимента с использованием сульфата меди. Так, сульфат меди идет полностью в раствор, используя этот протокол, решение будет казаться менее темные, чем решение от синтеза с использованием ЧАЭС. Документ размер и степень медного купороса композитов путем сравнения колбы с разными условиями синтеза, такие как время синтеза до расторжения.
Примечание: Успешно синтезированные композиционные покажет спектр различных длин. Избегайте проведения синтеза слишком долго из период времени до окончания, так как это приведет к сильно разветвленных агрегатов из композиционных материалов, некоторые из которых будут "ежа, как" по своей структуре, и которые трудно диспергировать в отдельных структурах, образованных раз ,
- Для определения характеристик и проверки биокомпозитов после синтеза белым световой микроскопии, использовать инвертированный микроскоп, как композитов будет располагаться на нижней поверхности колбы в течение нескольких минут укладки колбу плоской, а затем могут быть введены в фокусе. Используйте параметр светлого поля на микроскопе, чтобы максимизировать контраст между биокомпозитов и жидкой среде. Композиты, полученные из ЧАЭС и КСза купороса и появляются ясно непрозрачными в цвете, но не вступившие в реакцию агрегаты CNP появится очень темный цвет.
- Сосредоточить биокомпозитов пост-синтез, центрифуг решения композитов в центрифужную пробирку. Добавить 6 мл либо CNP-производных структур или сульфат меди, полученных структур в 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга в течение 10 минпри 500 х г при комнатной температуре с образованием гранул. Для небольших объемов, добавьте 500 мкл структур в растворе 0,6 мл размера трубы. Центрифуга на 2000 мкг при комнатной температуре в течение по крайней мере 10 минут для получения гранул.
- После центрифугирования в течение достаточного времени (по крайней мере, 10 мин) для microfuges, сохранить наблюдаемый осадок на дне пробирки, где структуры концентрируют путем тщательного удаления надосадочной жидкости над осадком. Биокомпозита структуры, полученные из сульфата меди появляются синего цвета и структуры, полученных от ЧАЭС темнее (серый до черного).
- Добавить еще композитов для этой трубки и повторите процесс в той же трубе, чтобы сконцентрироваться структуры, если это необходимо. Для разгона концентрированных гранул, добавление нужного объема раствора к трубке, и вихрь в течение 10-30 сек.
- Соникатные структуры после формирования, чтобы переместить средний размер популяции (длины) структур к меньшим значениям. Место структур в стерильной деионизированной воды и разрушать ультразвуком в течение по крайней леАСТ 10 мин. Используя этот процесс, в течение долгого времени, структуры становятся фрагментированным и меньше средней длины (рисунок 6 текста). Изменения документов в композитных размеров с различными временами ультразвуком с использованием перевернутый белый световой микроскоп и цифровую камеру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана блок-схема Схема стадий синтеза с образованием линейных биокомпозитов, описанные в данной работе. CNPS или сульфат меди в качестве исходных материалов в сочетании с стерильной водой, чтобы образовать 2 мг / мл раствора в этот раствор смешивают и обрабатывают ультразвуком, чтобы обеспечить равномерное смеси, и этот медный раствор затем смешивают в следующем соотношении синтеза: 949 частей стерильной вода: 50 частей меди смесь: 1 часть цистина раствор. Фактические объемы могут быть увеличены или уменьшены в соответствии с этими отношениями, чтобы увеличить или уменьшать конечный выход синтеза. После инкубации в течение по крайней мере 2 ч, как указано, линейные биокомпозит структуры формируются в течение долгого времени, который можно наблюдать при нормальном белого световой микроскопии или на глаз, как жидких растворов изменений во внешнем виде.
Рисунок 2 показывает характерный результат, от начального открытия этих линейных структур в полной среде для культивирования клеток OVer период 82 ч. Наша лаборатория проведения оценки потенциальной токсичности различных наноматериалов, в том числе ЧАЭС на нормальные клетки и раковые клетки и клетки, показанные на рисунке 2, являются быстрорастущие опухоли линии клеток мозга от АТСС (CRL-2020). Ключевым дополнением к полной среде, используемой для этих клеток цистин, который оказался важным компонентом к открытию, почему эти линейные структуры формирования в культурах (см ниже и обсуждение раздела). Из первоначального даже дисперсии ЧАЭС, которые быстро агрегат в микроструктур (рис 2А и 2В), в течение долгого времени мелкие частицы удаляются и крупные агрегаты образуются (рис 2С и 2D). Наконец, крупные агрегаты с мелкими, линейных сооружений появляются в одних и тех же скважин (рис 2E-H), образуя "ежей" структуры типа сообщалось ранее в литературе, используя не-биолogical методы 6. Сравнение последних двух временных точках, при 69 и 82 ч (рис 2G и 2H, соответственно), показывает, что развитие больших структур типа ежа остается достаточно стабильным, как указано визуализации точно такой же поле.
Чтобы объяснить, почему наблюдались эти ежа, как структуры в этих условиях в клеточных культурах, мы начали ликвидацию медиа компоненты, чтобы определить, если существенные элементы могут быть изолированы. Мы обнаружили, что ключевым компонентом и дополнением к клеточной культуральной среде была цистин, который в процессе ликвидации в конечном счете идентифицирован в качестве основного компонента для процесса самосборки. Путем упрощения компоненты синтеза (рисунок 1), мы могли бы в конечном счете образуют высокой пропорции (линейный) структуры в жидкости, что может быть показано с течением времени, чтобы перейти от наночастиц формы в линейной форме, без необходимости клеток, или любой из другую клеткукультура компоненты (3А-С).
Фиг.4 показывает характеристику обнаружили новые структуры с помощью электронной микроскопии, в том числе просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) захвата изображения наночастиц исходного материала и образования линейных наноструктур (фиг.4А). Представитель помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM) изображения отображаются для исходного материала CNPS, линейные структуры, образованные из наночастиц, и линейных структур, образованных из сульфата меди исходного материала (цифры 4B-F, соответственно).
Чтобы убедиться, что биокомпозиты содержал цистин или цистина полученный материал в качестве основного компонента биологической композитов, сформированные структуры были проанализированы с помощью EDX с SEM микроскопии. Представительства скриншоты из анализируемых материалов показано на рисунке 5. Важно отметить, что при сравнении ЧАЭС и биокомпозитов от ЧАЭС, видныйпоявляется пик серы (5В), который не присутствует в CNP исходного вещества (фиг.5А). Для биокомпозитов сульфата меди с использованием в качестве исходного материала (5С), появляются углерода и азота пиков (рис 5D), что согласуется с наличием цистина в этом биокомпозита.
В это время, способ управления длину и размер композитов в процессе синтеза не был идентифицирован. Тем не менее, чтобы исследовать, если средний размер структур может контролироваться после синтеза, линейные биокомпозиты обрабатывают ультразвуком в течение различных периодов времени, как показано на рисунке 6. С увеличением времени обработки ультразвуком, было показано, что средний размер линейных биокомпозитов уменьшилось, так как Показано, яркий микроскопии (6А-D). В качестве способа концентрирования и разделения, образованные композитов, центрифугирование можно использовать, и, как показано на фиг 6Е-G, Видно осадок могут быть разработаны в зависимости от объемов и центрифугирования сил, используемых.
Рисунок 1. Представитель блок-схема конструкции синтеза Си ИГ = наночастицы меди. Cys = цистин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Представитель образование меди биокомпозит структур головного мозга в культурах опухолевых клеток с полной среде для культивирования клеток. Репрезентативного эксперимента отслеживали в течение в общей сложности 82 часов показана на культуре клеток головного мозга, содержащий опухолевые клетки и CNPS (50 мкг / мл). Панели и В шоукультуральные скважин на время 0, после ЧАЭС поселились в нижней части хорошо. Панели CH показать последующие моменты времени, в 17, 24, 36, 49, 69 и 82 ч, соответственно. Панели G и Н представляют то же поле в 69 и 82 часов. Все изображения были получены с использованием светлого микроскопии для повышения контрастности медного материала. Масштабные полоски = 100 мкм для A + B, 50 мкм для CE, и 25 мкм для F + G. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Трансформация CNPS к линейным биокомпозитов. CNPS были объединены с цистина и воды, как показано на рисунке 1, а в разделе протокола с общим объемом 7 мл. Панель А показывает синтез сосуд в момент времени 0, панель В показывает 3 ч, и панель С шпотоки 6 ч. Изображения были получены с использованием светлого микроскопии с масштабной шкалы, указанной (50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Электронная микроскопия характеристика синтезированных биокомпозитов панель ():. ТЕМ из CNP исходного материала (круглый) с формированием линейных композитов. Панели (B) и (C) показывают характеристик исходного CNPS помощью сканирующего электронного микроскопа. Панель (С) представляет собой увеличенное изображение (В). Панель (D) показывает, SEM композитов, образованных из ЧАЭС и цистина. Панели (E) и (F), шоу SEM-меди сульфат биокомпозитов. Панель (Р) zoomeтрехмерное изображение (Е). Масштабной линейки указаны во всех изображений и = 200 нм (а), 1 мкм (б), 500 нм (C), 5 мкм (D), 2 мкм (Е), и 1 мкм в (F ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок (СЭМ) анализ 5. EDX исходных материалов и синтезированных линейных композитов. Экран снимки SEM отсканированных образцов с использованием анализа EDX на содержание элементов. Панель () = начиная ЧАЭС; Панель (B) = биокомпозитов из ЧАЭС и цистина; Панель (С) = сульфат меди исходный материал, и панель (D) = композитов сюдам сульфат меди и цистин. Для пика маркировки, C = углерод, кислород O =, Cu = медь, S = серы и азота N =. Большие этикетки для элементарного идентичности были размещены выше ключевых пиков для удобства просмотра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Изменение линейных размеров композитного и концентрация сообщению синтеза. Линейные структуры синтезированных из сульфата меди обрабатывают ультразвуком в течение 0, 15, 30, или 60 мин, соответственно, как показано на панели (AD). Изображения были получены с использованием светлого микроскопии с масштабной линейки 200 мкм, указанных во всех изображений. Панели (EG), концентрация биокомпозитов помощью центрифугирования: 6 мл линейных структур, полученных из ЧАЭС (<сильный> Е, слева) и сульфата меди (Е, справа) показаны урегулирования под действием силы тяжести через 10 мин. С 10 мин центрифугирования при 500 мкг, уплотняется осадок образуется (панель F). Меньший объем (500 мкл) из того же материала была сосредоточена, как показано в (панели G) (CNP-производные структуры показаны в левой трубки и сульфат меди, полученных структур в правой трубе). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы смотреть больше Версия этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При оценке потенциальных токсических эффектов наноматериалов, включая ЧАЭС, было отмечено, что в течение длительного срока, ЧАЭС были преобразованы из первоначально более дисперсной распределения частиц в большей, агрегированной форме (рисунок 2). В некоторых случаях, эти высоко агрегированные образования, которые были произведены в клеточной культуре блюдо, в биологических условиях, формируется очень линейные прогнозы от центрального агрегата, напоминающие описанному ранее медью, содержащие "ежей" 6. Следует отметить, что в условиях, показанных здесь, концентрация CNPS добавляли к клеткам была субмаксимальной, таким образом, не убивая все клетки в культуре (рисунок 2). Из этих начальных наблюдений, эксперименты были затем продолжил, устраняя последовательно несколько компонентов условий для культивирования клеток (в том числе в конечном счете самих клеток), чтобы найти остальные основные компоненты, необходимые для синтеза OF линейные медные биокомпозиты.
Мы обнаружили, что цистин, в дополненную компонент исходных культур клеток, в сочетании с CNPS под правильным биологических условий, может привести к трансформации виде наночастиц в высокой линейной биокомпозита, что содержит как металл и биохимические компоненты, как указано анализа EDX с помощью сканирующей электронной микроскопии подготовленных образцов (рисунок 5). Таким образом, серы, который не присутствует в исходном материале CNP, показывает заметную пик синтезированных биокомпозитов, указывающий, что и медь и компоненты биохимического материала цистина являются существенными для формируемых линейных структур.
Кроме того, было показано, что при использовании аналогичных условий синтеза, но с заменой CNPS сульфатом меди, высокой линейностью биокомпозиты также может быть сформирована. На самом деле, синтез с использованием сульфата меди и цистин, как правило, приводит к "чистки" анD продукты, в том, что не вступивший в реакцию CNPS не было всегда присутствует, так как сульфат меди полностью растворим в воде, который был использован в качестве растворителя всех синтезах сообщенных здесь. Кроме того, медно-сульфатные биокомпозиты отличились от CNP-полученных композитов в сохранении синий цвет, который был очевидными после центрифугирования материала.
Другие группы, ранее изучал медно-цистин комплексы и определены некоторые ключевые химические свойства. Например, кэлеровым др. Показали, формирование медно-цистина комплексов в виде тонких волокон, которые были очевидны при сушке, но нестабильными в растворе 13. В других примерах, комплексообразование исследования с L-цистина и различных катионов металлов подтверждает образование медь и цистин комплекс в водной среде 14 и образованные комплексы могут быть мононуклеарных или полициклической, с серы из цистина, способствующего образованию сложного 15. Ряд исследований докладEd взаимодействия между цистина и меди в биологических системах. Например, при физиологическом значении рН, меди (II), ионы координировать с гистидина и цистина в моделируемой плазмы с образованием комплексов 16 и серосодержащие аминокислоты было показано, что защищает от токсичности меди в цыплят 17. Эти данные, таким образом, поддерживает важную роль цистина в комплексообразования с медной исходного материала в наших методов синтеза для формирования линейных биокомпозитов.
В это время стратегия синтеза еще не установлено, что может непосредственно контролировать длину отдельных линейных биокомпозитов показанных здесь. Однако критические шаги, указанные в описанном синтезе включают: 1) хорошее рассеивание обработкой ультразвуком из исходных материалов в случае синтеза, включающего CNPS; 2) использовать свежеприготовленного ЧАЭС, медного купороса и цистина для эффективного синтеза композитов; 3) позволяет синтеза в колбе оставаться в покое в incubatили по крайней мере 6 часов; и 4) избегая "более-реакции" условия, в которых разветвленной "ежа" типа, агрегированные композиты форму.
После завершения синтеза, было показано, что обработка ультразвуком структур можно эффективно использовать, чтобы уменьшить средний размер (длину) структур. Ультразвуком, чтобы мелкие структуры может помочь в таких приложениях, как поглощение клеток или других биокомпозит-клеточных взаимодействий. Как сообщалось ранее, зарядить стабилизации ЧАЭС во время этого синтеза в сочетании с измененной цистина измеренное дзета-потенциал от положительного до менее заряженной (отрицательной) формы 9. Это изменение заряда может помочь объяснить, почему образованные композитов показать очень мало агрегацию в сухом виде или жидких средах, что делает обработку структур гораздо удобнее.
Так отчетный синтеза этих CNP-производных и сульфат меди, полученных структур осуществляется оут в жидких средах, можно ожидать, что этот процесс может быть масштабируемой, это означает, что при правильном соотношении компонентов и условий синтеза, миллилитра синтеза рецепт используется здесь может быть расширены вверх или вниз, чтобы включать в себя многие сотни миллилитров или более, и Таким образом, можно было бы ожидать, чтобы получить больше конечного продукта, а также. Из-за металла (медь) компонента этих биокомпозитов, это довольно просто сосредоточиться синтезированный продукт путем центрифугирования (рис 6). Биокомпозитов, образованные из CNP исходного материала сохраняют темный цвет, как только концентрированный в гранулы, возможно, из-за вступивших в реакцию наночастиц оксида меди (рис 6). В сравнении, сульфат меди биокомпозиты при концентрировании в гранулы имеют синий цвет, в соответствии со свойствами сульфата меди с различными уровнями гидратации 18.
Синтез роман сообщили здесь также масштабируемая в том смысле, что самоорганизующихся линуха структуры масштабироваться от нано-масштабе в микро-масштабе, как показано с помощью электронной микроскопии (рис 4) и традиционное белое световой микроскопии (рис 3 и 6). Интересно отметить, что в последнее время, сконструированные белковые микроволокна биспиральных сообщалось, что может включать куркумин что позволило сформированные волокна необходимо соблюдать при освещении флуоресцентной 19. Аналогичные стратегии можно будет включить распорки или мечения агентов в линейных композитов сообщили здесь, чтобы предоставить продукцию более крупные структуры и / или увеличения для визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini Vortexer | VWR (https://us.vwr.com) | 58816-121 | |
| CO2 Incubator Model # 2425-2 | VWR (https://us.vwr.com) | Contact vendor | Current model calalog # 98000-360 |
| Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge) | Labnet (http://labnetinternational.com/) | C2500-R | Model Prism R |
| Cell Culture Centrifuge Model Z323K | Labnet (http://labnetinternational.com/) | Contact vendor | Current model Z206A catalog # C0206-A |
| Sonicator (Ultrasonic Cleaner) | Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/) | 1510R-MTH | |
| Balance | Sartorius (http://dataweigh.com) | Model CP225D similar model CPA225D | |
| Olympus IX51 Inverted Light Microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Olympus DP71 microscope digital camera | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| external power supply unit - white light for Olympus microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | TH4-100 | |
| 10X, 20X, and 40X microscope objectives | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html) | model S-4800 | |
| Transmission Electron Microscope | Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html) | model Libra 120 | |
| Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco (http://envirco-hvac.com) | model PNG62675 | Used for sterile cell culture technique |
References
- Klinman, J. P. The copper-enzyme family of dopamine beta-monooxygenase and peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase: resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation. The Journal of biological chemistry. 281, 3013-3016 (2006).
- Uauy, R., Olivares, M., Gonzalez, M. Essentiality of copper in humans. The American journal of clinical nutrition. 67, 952S-959S (1998).
- Karlsson, H. L., Cronholm, P., Gustafsson, J., Copper Moller, L. oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes. Chemical research in toxicology. 21, 1726-1732 (2008).
- Parekh, G., et al. Layer-by-layer nanoencapsulation of camptothecin with improved activity. International journal of pharmaceutics. 465, 218-227 (2014).
- Harrington, M. J., Masic, A., Holten-Andersen, N., Waite, J. H., Fratzl, P. Iron-clad fibers: a metal-based biological strategy for hard flexible coatings. Science. 328, 216-220 (2010).
- Keyson, D., et al. CuO urchin-nanostructures synthesized from a domestic hydrothermal microwave method. Materials Research Bulletin. 43, 771-775 (2008).
- Liu, B., Zeng, H. C. Mesoscale organization of CuO nanoribbons: formation of 'dandelions'. J Am Chem Soc. 126, 8124-8125 (2004).
- Peng, M., et al. Controllable synthesis of self-assembled Cu2S nanostructures through a template-free polyol process for the degradation of organic pollutant under visible light. Materials Research Bulletin. 44, 1834-1841 (2009).
- Deodhar, S., Huckaby, J., Delahoussaye, M., DeCoster, M. A. High-Aspect Ratio Bio-Metallic Nanocomposites for Cellular Interactions. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 64, 012014 (2014).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12, 47-53 (2010).
- Wiogo, H. T., Lim, M., Bulmus, V., Yun, J., Amal, R. Stabilization of magnetic iron oxide nanoparticles in biological media by fetal bovine serum (FBS). Langmuir. 27, 843-850 (2011).
- Yunker, P. J., Still, T., Lohr, M. A., Yodh, A. G. Suppression of the coffee-ring effect by shape-dependent capillary interactions. Nature. 476, 308-311 (2011).
- Kahler, H., Lloyd Jr, B., Eden, M. Electron Microscopic and Other Studies on a Copper–Cystine Complex. The Journal of Physical Chemistry. 56, 768-770 (1952).
- Furia, E., Sindona, G. Complexation of L-cystine with metal cations. Journal of Chemical & Engineering Data. 55, 2985-2989 (2010).
- Hawkins, C., Perrin, D. Polynuclear Complex Formation. II. Copper (II) with Cystine and Related Ligands. Inorganic Chemistry. 2, 843-849 (1963).
- Hallman, P., Perrin, D., Watt, A. E. The computed distribution of copper (II) and zinc (II) ions among seventeen amino acids present in human blood plasma. Biochem. J. 121, 549-555 (1971).
- Jensen, L. S., Maurice, D. V. Influence of sulfur amino acids on copper toxicity in chicks. The Journal of nutrition. 109, 91-97 (1979).
- Lee, Y., Choi, J. R., Lee, K. J., Stott, N. E., Kim, D. Large-scale synthesis of copper nanoparticles by chemically controlled reduction for applications of inkjet-printed electronics. Nanotechnology. 19, 415604 (2008).
- Hume, J., et al. Engineered coiled-coil protein microfibers. Biomacromolecules. 15, 3503-3510 (2014).
