Summary
ここでは、生物学的条件下で液体培地中で小説、高アスペクト比のバイオ複合材料を合成するためのプロトコルを提示します。バイオ複合材料は、それぞれ、直径および長さにマイクロメートルのナノメートルスケール。シスチンと組み合わせた銅ナノ粒子（CNPS）および硫酸銅は、合成のための重要なコンポーネントです。
Abstract
このプロトコルの目的は、高アスペクト比の構造を有する2つの新規なバイオ複合材料の合成を記載することです。バイオ複合は、銅ナノ粒子（CNPS）または金属成分に寄与する硫酸銅のいずれかで、銅およびシスチンで構成されています。合成は、生物学的条件（37℃）で液体で行い、自己組織化複合体は、24時間後に形成されます。一旦形成されると、これらの複合材料は、両方の液体培地中で、乾燥した形で非常に安定しています。複合材料の長さは、数ミクロンから、直径25 nmの範囲をマイクロするナノスケールから。エネルギー分散型X線分光法（EDX）を用いて電界放出走査電子顕微鏡は、それが、最終的なナノ複合材料中の硫黄の供給源としてシスチンを確認し、出発CNP材料から不在であった硫黄は、NP由来の線状構造中に存在することを実証しました。これらの線状ナノ·マイクロ複合材料の合成、STRの長さの多様な範囲の間ucturesは、合成容器内で形成されています。合成後の液体混合物の超音波処理は、超音波処理時間の増加とともに平均の長さを減少させることにより、構造物の平均の大きさを制御するのを助けることが示されました。形成された構造は、非常に安定であり、凝集しない、液相中で形成されているので、遠心分離はまた、形成された複合物を濃縮し、分離を補助するために使用することができます。
Protocol
実験1.計画
- 合成に必要な銅ナノ複合材料の量を決定します。その上、少量フラスコ（25 cm 2）で、または材料の調製において以下に示すように、より大きなフラスコの数を選択します。
- この合成には、5％のCO 2と少なくとも40％の湿度で37℃のインキュベーターを使用。このような培養器が利用可能であり、それは繰り返し合成（約24時間）の期間にわたって妨害されないことをことを確認してください。
注意：インキュベーターの繰り返し開閉は確かにナノコンポジット構造の変化した合成をもたらし得る温度変動の原因となります。
材料の作製
- 合成が開始する直前に溶媒に固体材料を添加することにより、実験開始前に、新鮮なすべての材料を準備します。長時間Bの液体中にシスチンと銅の出発物質の原液を維持EFORE実験が推奨されていませんし、変数の結果につながる可能性があります。一度ベンダーから開く、パラフィルムで容器の上部をラップすることによって、乾燥出発材料保ちます。
注：以下のプロトコルは、シスチンの7μlの滅菌水の6643μL、およびCNPSの350μLを使用して25cm 2の細胞培養フラスコ内の反応のための例として使用されています。 - CNPSの少なくとも2ミリグラムを秤量することにより銅ナノ粒子の2 mg / mlの溶液を調製します。皮膚とのCNPSの可能性の接触を防ぐために、このステップの間に使い捨て手袋を着用してください。空の滅菌16ミリリットルのガラスバイアル中のナノ粒子を配置します。
- CNPSを含むバイアルに、2 mg / mlの溶液を作製し、合成を開始する前に、ナノ粒子の分散を提供するために、20秒間、溶液をボルテックスするために、適切な音量に滅菌脱イオン水を加える（少なくとも1ミリリットルの合計容量を推奨します）。これはボルテックスで混合阻害するとして水をバイアルの半分以上の方法を記入しないでください。 CNPSウィルlはすぐにバイアルの底に沈殿し、（黒に灰色）色が暗い表示されます。
- 合成の開始前にCNPSの最大分散を提供するために、室温で17分間、CNP液を超音波処理。定期的にCNPSは、超音波処理のために混合されていることを確認してください。成功した超音波処理後、CNPSを、少なくとも30分間、溶液中に懸濁したままで、溶液の色は暗くなります。
- 合成のための72.9 mg / mlの溶液を作製するためにシスチンの十分な質量を秤量します。シスチンは水に直接溶解しないので、帯電防止計量容器に秤量シスチンを配置します。
- シスチンが完全に溶解するようにシスチンを含む計量容器に、滅菌、1MのNaOHの十分なボリュームを追加。たとえば、72.9 mg / mlの溶液を作製するために、1 M NaOHを100μlの完全シスチンの7.29ミリグラムを溶解します。
- 無菌状態を維持するために、無菌のフロー組織培養フード中でこのステップを実行します。
注意：水酸化ナトリウム1でM濃度は苛性であるため、皮膚と濃NaOHとの接触を防ぐために、このステップの間に使い捨て手袋を着用します
- 滅菌組織培養フードでの作業は、まず滅菌合成フラスコに滅菌水の6643μlのシスチンの7μlを添加し、フラスコのキャップで37℃のインキュベーター内で30分間インキュベートさせる効果的な提供するために、（ルーズ）通気混合。 CNPSは超音波処理工程の後に定住していますので、30秒間ボルテックスすることによって2 mg / mlのCNP液を再懸濁します。
- 合成を開始するために、25cm 2の細胞培養フラスコに滅菌水、50部CNPS、及び949の部品を1部品シスチンを組み合わせる次の成分比を維持するために（滅菌技術を使用して）の合成フラスコに十分なCNPの溶液を加えます。例えば、7ミリリットル合成ボリュームの、シスチン原液の7μL、CNPS350μlの、滅菌水の6643μLを兼ね備えています。それはSECURであるように、フラスコのキャップを取り付けて締めE。
- 合成のためのすべてのコンポーネントを組み合わせた後、静かに4〜5回旋回することによりフラスコ中で混合します。 CO 2インキュベーター中でフラスコを置き、および合成の間、フラスコのうちのガス交換が存在することになるように、キャップを緩めて、フラスコをベント。
- 合成は約24時間インキュベーター内で実行することができます。合成の間、一つは、顕微鏡で眼によって、高度に線形複合体の形成を観察することができます。
注意：構造の形成のプロセスは、構造の検出が最初に困難であるという意味で突然発生する可能性があり、その外観は、高密度化に迅速に移行します。形成は、したがって、24時間前に発生することがあります。構造が大きくなると、その密度が増大したらプロセスは、目で観察することができます。構造体の生成は、後の時点で、顕微鏡下で目視により経時的に観察することができるが、連続的に合成条件を中断し、温度が低下につながります合成結果。 - しっかり合成フラスコをキャップし、冷蔵庫（4℃）で容器を保存することによって、バイオ複合材料の合成を終了します。一度生成構造は、少なくとも1年間はこの形で安定した状態を保ちます。利用コンポーネントを含む合成条件、合成の日付、および終了前に合成のインキュベーション時間でフラスコにラベルを付けます。
硫酸銅を使用した3合成
- 硫酸銅塩とCNPSを置換することによって自己組織化合成を行います。無菌技術を使用して、2 mg / mlの溶液を作製するために滅菌脱イオン水の十分な量で硫酸銅の少なくとも2ミリグラムを溶かします。硫酸銅の結晶が容易にこの濃度で溶液中に行くが、必要に応じて、バイアルをボルテックスし、全ての結晶が溶解されることを保証するために目で点検します。
- 前述のように硫酸銅を調製した後、合成を行うが、硫酸銅とCNPSを置き換えます。
注：出発物質として硫酸銅を用いて自己組織化ナノコンポジットはCNPSから合成した構造に比べて、最終的な形状が、はるかに一貫性のあることが見出されました。 - CNPコンポジット（ステップ2.6）の場合と同様に硫酸銅のバイオ複合材料の合成を終了し、4℃でそれらを長期的に保存します。
4.特性とバイオ複合合成後の取り扱いについて
- CNPSから白色光顕微鏡9による硫酸銅からおよび電子顕微鏡9によって誘導されたバイオ複合材料を特徴づけます。
- 複合体は、フラスコが平坦敷設の数分以内に、フラスコの底面に沈降するように特性評価およびバイオ複合白色光顕微鏡による合成後の検査のために、倒立顕微鏡を使用し、次にフォーカスさせることができます。バイオ複合材料と液体媒体との間のコントラストを最大にするために顕微鏡で明視野設定を使用します。 CNPSと警官から派生複合硫酸ごとに両方の色が不透明に明確に表示されますが、未反応のCNPの凝集体は、色が非常に暗い表示されます。
- 複合材料の画像をキャプチャするために、顕微鏡に接続されたデジタルカメラを使用してください。個々の構造のための長さの範囲が観察されるであろう。
- 特性評価およびバイオ複合材料、合成後の検査のために、4℃で保存した後、フラスコを顕微鏡イメージングを行いながらフォーカス効果的な不明瞭ます冷蔵庫から取り出し、ときに最初に結露を形成するようにフラスコを少なくとも15分間、室温に来ることができます。 RTに平衡化させた後、顕微鏡の結像品質を最大にするために清潔なペーパータオルでフラスコの頂部および底部表面を拭きます。
- 長期的に格納されている複合材料またはイメージング作業する場合、冷蔵庫にある間に形成複合材料の塊を解離するために30秒間、フラスコをボルテックス。ボルテックスした後、反転マイクを有する構造を検査roscope凝集体が解離していることを確認し、必要に応じてボルテックスを繰り返します。
- CNPSを使用して、指定された実験のために、合成の有効性を評価するために、反転白色光顕微鏡を使用してください。例えば、合成時のような異なるパラメータを有するフラスコからのCNP由来のバイオ複合材料に使用される合成フラスコ中の未反応CNPSの有無を記録します。
注：個々のCNPSを光学顕微鏡で観察するには小さすぎるが、未反応のCNPは、高アスペクト比、線形形式になります。合成に成功CNPコンポジットとは対照的に、ラウンド形状と暗いオブジェクトとして表示されます集約し、異なる長さの範囲を持っています。これは一旦形成された個々の構造に分散することが困難である高度に分岐した「ウニ」型構造、になりますように、終了までの時間の長すぎるために合成を行うことは避けてください。 - 有効性を評価するために反転し、白色光顕微鏡を使用して硫酸銅を使用して、指定された実験の合成。硫酸銅は、このプロトコルを使用して溶液中に完全に移行しているため、溶液はCNPSを使用して、合成のソリューションよりも少ない暗い表示されます。そのような終了の前に、合成時と異なる合成条件でフラスコを比較することにより、硫酸銅複合体の大きさと範囲を文書。
注：正常に合成された複合材料は、異なる長さの範囲が表示されます。これは複合材料の高度に分岐した集合体になりますように、終了までの時間の長すぎるために合成を行う避け、「ウニ状」構造でなり、そのうちのいくつかと、一旦形成された個々の構造の中に分散させることは困難です。
- 複合体は、フラスコが平坦敷設の数分以内に、フラスコの底面に沈降するように特性評価およびバイオ複合白色光顕微鏡による合成後の検査のために、倒立顕微鏡を使用し、次にフォーカスさせることができます。バイオ複合材料と液体媒体との間のコントラストを最大にするために顕微鏡で明視野設定を使用します。 CNPSと警官から派生複合硫酸ごとに両方の色が不透明に明確に表示されますが、未反応のCNPの凝集体は、色が非常に暗い表示されます。
- バイオ複合材料を遠心管中の複合体の合成後、遠心分離ソリューションを集中させます。 15mlの遠心管にCNP由来の構造や硫酸銅由来の構造のいずれかの6ミリリットルを追加します。 10分間遠心室温で500×gでペレットを形成します。小さいボリュームの場合、0.6ミリリットルサイズのチューブに溶液中の構造物の500μlを添加します。少なくとも10分間、室温で2000×gで遠心分離し、ペレットを形成します。
- 十分な時間のために（microfugesのために少なくとも10分間）遠心分離した後、構造は慎重にペレット上記上澄み液を除去することにより濃縮して、チューブの底に観察可能なペレットを保存します。硫酸銅から派生バイオ構造は、（黒にグレー）暗いCNPSから派生した色および構造で青色に見えます。
- この管に、より複合材料を追加し、必要に応じて、構造物を濃縮するために、同じチューブ内で処理を繰り返します。濃縮されたペレットを分散させるために、10〜30秒のための所望のチューブに溶液の容量、および渦を追加します。
- 超音波処理の構造はかつてより低い値に構造体の平均集団サイズ（長さ）を移動し、形成されました。ルでのための滅菌脱イオン水や超音波処理中の場所の構造AST 10分。このプロセスを使用して、時間をかけて、構造は（テキストの図6を参照）断片化し、平均長さが小さくなります。反転白色光顕微鏡とデジタルカメラを使用して、さまざまな超音波処理時間を有する複合サイズのドキュメントの変更。
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Representative Results
図1は、この研究に記載の線状バイオ複合材料を形成するために、合成工程のフローチャート図を示しています。出発物質としてCNPSまたは硫酸銅を2 mg / mlの溶液を形成するために滅菌水と組み合わせて、この溶液を混合し、さらに混合物を提供するために超音波処理し、この銅溶液を合成するための以下の割合で混合される：949重量部、滅菌水：50部銅混合物：1部シスチン原液。実際のボリュームは、スケールアップまたは最終合成収率を縮小するために、これらの比率に応じて増減することができます。経時的外観の溶液の変化として、通常の白色光顕微鏡下で、または眼で観察することができる示した、線状バイオ構造が形成されるように、少なくとも2時間のインキュベーション後。
図2は、完全な細胞培養培地Oでこれら線状構造の最初の発見からの代表的な結果を示しています82時間の期間をVER。私たちの研究室では、細胞と癌細胞の正常のCNPSなど、さまざまなナノ材料の潜在的な毒性の評価を行った後、 図2に示した細胞は、ATCC（CRL-2020）からの急成長中の脳の腫瘍細胞株です。これらの細胞のために使用される完全培地の鍵サプリメントは（下記参照および考察セクション）は、これらの線状構造は、培養物中で形成された理由の発見に不可欠なコンポーネントであることが判明シスチン、です。すぐに集計微細構造にCNPSの初期均一な分散（ 図2Aおよび図2B）から、時間をかけてより小さな粒子がクリアされ、より大きな凝集体（ 図2Cおよび2D）に形成されています。最後に、微細な線状構造を有するより大きな凝集体は、非BIOLを使用して、以前に文献で 報告され、「ウニ」型構造を形成し、同じウェル（ 図2E-H）に表示されogical方法6。最後の2つの時点の比較は、69および82時間（それぞれ図2Gおよび2H）において、同一の正確な視野を撮像して示されるように、大きなウニ型構造の開発は、非常に安定したままであることを示しています。
細胞培養物中のこれらの条件下で、これらのウニ様構造が観察された理由を説明するために、我々は、重要な要素を単離することができたかどうかを決定するために培地成分を除去始めました。我々は、細胞培養培地に重要な要素とサプリメントは消去法によって、最終的に自己集合プロセスのための必須成分として同定されたシスチンであったことを発見しました。合成成分を簡略化した細胞を必要とせずに、我々は最終的に、線状のナノ粒子形態から変換するために時間をかけて示すことができ、高アスペクト比（線形）液体中に構造を形成することができる（ 図1を参照）、または任意の他の細胞培養成分（ 図3A-C）。
図4は、透過型電子顕微鏡（TEM）画像ナノ粒子出発物質を捕捉し、線形ナノ構造物（ 図4A）を形成することを含む、電子顕微鏡を用いて発見新規構造の特徴付けを示します。代表的な走査型電子顕微鏡写真（SEM）画像は、材料CNPSを開始するための材料（それぞれ図4B-Fを ）開始のNPから形成された線状構造、及び硫酸銅から形成された線状構造が示されています。
バイオ複合材料は、複合材料の本質的な生物学的成分として、シスチンまたはシスチン由来材料を含有していることを確認するには、形成された構造は、SEM顕微鏡とEDXを用いて分析しました。分析物質からの代表的なスクリーンショットは、 図5に示されている。重要なことに、CNPSからCNPSバイオ複合材料とを比較すると、顕著硫黄ピークはCNP出発物質（ 図5A）には存在しないとする、（ 図5B）が表示されます。材料（ 図5C）を出発物質として硫酸銅を使用したバイオ複合材料は、炭素と窒素のピークは、このバイオためシスチンの存在と一致している、（ 図5D）が表示されます。
このとき、合成中に複合材料の長さと大きさを制御するための方法が同定されていません。しかし、構造体の平均サイズは、合成後に制御することができるかどうかを調べるために、直線状のバイオ複合材料は、図6に示すように、異なる時間超音波処理した。超音波処理時間の増加と、それは線形バイオ複合材料の平均粒径として、減少することが示されました。明視野顕微鏡（ 図6A-D）に示します。形成された複合体を濃縮し、分離する方法としては、遠心分離を用いることができ、 図6Eに示すように-G、目に見えるペレットを使用するボリュームと遠心力に応じて開発することができます。
合成の設計図1.代表的なフローチャートのCuのNP =銅ナノ粒子。のCys =シスチン。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
完全な細胞培養培地で脳腫瘍細胞培養物中の銅バイオ構造の図2の代表的な形成を82時間の合計にわたって追跡代表的な実験では、脳の腫瘍細胞およびCNPS（50μg/ ml）を含有する細胞培養において示されています。パネルAおよびBは、時間0での培養ウェルは、CNPS後のウェルの底に沈降してきました。パネルは、それぞれ、17、24、36、49、69、及び82時間で、その後の時点を示し、CH。パネルGおよびHは、69および82時間目に同じフィールドを表します。すべての画像は、銅材料のコントラストを向上させるために明視野顕微鏡を用いて得ました。スケールバー= A + Bの100ミクロン、F + GのためのCEの50ミクロン、25ミクロンである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
7ミリリットルの全容量と、図1に、プロトコルのセクションに示されているような線形のバイオ複合材料へのCNPSの図3。トランスフォーメーション。CNPSは、シスチン、水と混合しました。パネルAは、時間0での合成容器を示し、パネルBは、3時間を示し、パネルCのSHOWS 6時間。画像が示されているスケールバー（50ミクロン）と明視野顕微鏡を用いて得た。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4.合成バイオ複合材料の電子顕微鏡の特性評価パネル（A）：CNPのTEM形成線形複合有する材料（ラウンド）を開始。パネル（B）及び（C）は、SEMを用いて出発CNPSの特徴付けを示します。パネル（C）は（B）のズーム画像です。パネル（D）は CNPSおよびシスチンから形成された複合体のSEMを示しています。パネル（E）及び（F）は、硫酸銅のバイオ複合材料のSEMを示します。パネル（F）は zoomeです（E）のdイメージ。スケールバーはすべての画像に示されている（A）で= 200nmで、（B）1ミクロン、（C）で500 nmで、（D）、（E）で2ミクロンと1ミクロン、5ミクロン（F ）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
出発物質および合成線形複合材料の図5。EDX（SEM）分析 、元素コンテンツのEDX分析を用いてSEMスキャンサンプルのスクリーンのスナップショット。パネル（A）= CNPSを開始します。パネル（B）= CNPSおよびシスチンからバイオ複合材料。パネル（C）=硫酸銅出発物質、及びパネル（D）は、あちこち複合=硫酸銅およびシスチンメートル。ピーク標識のために、C =カーボン、O =酸素、銅=銅、S =硫黄、およびN =窒素。元素のアイデンティティのためのより大きなラベルは見やすくするための重要なピークの上に配置されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図6線形複合サイズ及び濃度合成後の改変。パネル（AD）に示すように、硫酸銅から合成された線状構造体は、それぞれ、0、15、30、または60分間超音波処理しました。画像はすべての画像に示さ200ミクロンのスケールバーと明視野顕微鏡を用いて得ました。パネル（EG）、遠心分離を用いてバイオ複合材料の濃度：CNPSから誘導線状構造の6ミリリットル（<強い> E）、左及び硫酸銅（Eは 、右）の10分後に、重力下で沈降示されています。 500×gでの遠心分離の10分では、圧縮ペレット（パネルF）が形成されています。 （パネルG）に示すように、同じ材料の小さい容積（500μl）を濃縮した（CNP由 来の構造は右チューブの左側の管と硫酸銅由来の構造に示されている）。 拡大表示するにはここをクリックしてください。この図のバージョン。
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Discussion
CNPSを含むナノ材料の潜在的な毒性効果を評価するが、それは長期的に、CNPSが大きく、凝集形態に最初により分散微粒子分布（ 図2）から変換されたことが観察されました。いくつかの場合において、生物学的条件下で、細胞培養皿に製造されたこれらの高度に凝集形成は、「ウニ」を含む前述の銅を連想させる中央集合から非常に線状突起が形成された6。これは、ここに示す条件で、CNPSの濃度は、このように、培養中の細胞の全てを殺すことはないが、準最大であった細胞に加えることが指摘されるべきである（ 図2参照 ）。これらの初期の観察から、実験はその後、合成Oのために必要な残りの主要コンポーネントを見つけるために、連続して（最終的に細胞自体を含む）細胞培養条件の複数の構成要素を排除することにより継続しましたFリニア銅バイオ複合材料。
我々は、シスチン、元の細胞培養物の補っ成分、正しい生物学的条件下CNPSと組み合わせた場合、EDX分析によって示されるように、金属および生化学成分の両方を含有していた直線性の高いバイオへのナノ粒子形態の変革につながる可能性を発見しました調製したサンプル（ 図5）の走査型電子顕微鏡による。したがって、出発CNP材料中に存在しない硫黄は、銅及び生化学材料シスチンの成分の両方が形成された線状構造のために必須であることを示す、合成されたバイオ複合材料において顕著なピークを示します。
さらに、同様の合成条件を使用したが、硫酸銅とCNPSを置換することにより、高線形バイオ複合材料を形成することもできることが示されました。実際には、硫酸銅およびシスチンを用いた合成は、「クリーナー」を生じる傾向があったアン硫酸銅は、ここで報告された合成の全ての溶媒として使用し、水で十分に可溶性であるので、Dの製品は、その中に未反応CNPSは、これまで存在しませんでした。また、銅 - 硫酸バイオ複合材料の遠心分離の際に明らかになった青い色を保持するのCNP由来の複合体から身を区別しました。
他のグループは、以前の銅シスチン錯体を学び、いくつかの重要な化学的特性を定義しています。例えば、ケーラーらは乾燥時に明らかが、溶液13中で不安定であった微細繊維の形態の銅-システイン複合体の形成を示しました。他の例では、L-シスチン、異なる金属カチオンと複合体形成の研究は、水性媒体14中の銅およびシスチン複合体の形成を確認し、形成された複合体は、複合体形成に寄与する15シスチンから硫黄と、単核または多核であってもよいです。多くの研究が報告書を持っています生物学的システムにおけるシスチンと銅の間の相互作用を編。例えば、生理的pHで、銅（II）は、アミノ酸を含有する複合体16、及び硫黄を形成するためにシミュレートされた血漿中のヒスチジンおよびシスチンで座標イオン雛17における銅の毒性に対して保護的であることが示されました。これらの知見は、このように直線状のバイオ複合材料を形成するための我々の合成方法において出発物質、銅と錯体中のシスチンの本質的な役割をサポートしています。
このとき、合成戦略はまだ直接ここに示した各リニアバイオ複合材料の長さを制御できることが確認されていません。しかし、記載された合成で同定された重要なステップは、次のとおりです。CNPSを組み込んだ合成の場合の出発物質の超音波処理による1）良好な分散。 2）新たに調製CNPS、硫酸銅、および複合体の効果的な合成のためのシステインの使用。 3）フラスコ内の合成はincubatに邪魔されずに残ってすることができますあるいは、少なくとも6時間、 4）「過反応」「ウニ」型、集約された複合材料の形分枝する条件を回避することができます。
合成が完了した後、その構造物の超音波処理は、構造物の平均の大きさ（長さ）を減少させるために有効に利用できることが示されました。小さな構造体を作製するために超音波処理することは、細胞取り込みまたは他のバイオ - 細胞相互作用などの用途に役立つことができます。たように、以前より少なく帯電した（負の）形態9に正から測定されたゼータ電位を変化させシスチンと組み合わせることにより、この合成中CNPSの帯電安定化が報告されています。担当のこの変化は、形成された複合材料は、構造物の取り扱いがはるかに便利になります乾燥形態または液体培地で非常に少ない凝集を示す理由を説明するに役立つことがあります。
これらCNP由来および硫酸銅由来の構造の合成が報告されたoを搭載しているのでUTは、液体培地中で、そのプロセスは、コンポーネントと合成条件の正確な比で、ここで使用ミリリットル合成レシピをスケールアップすることができ、またはダウンミリリットル以上の数百を含むようにし、つまり、非常にスケーラブルであり得ることが予想されます従ってならびに、より最終生成物を得ることが期待されます。原因これらのバイオ複合材料の金属（銅）コンポーネントには、遠心分離（ 図6）によって合成物を濃縮することは非常に簡単です。 CNP出発物質から形成されたバイオ複合はおそらく未反応の銅酸化物ナノ粒子（ 図6）に、一旦ペレットに集中暗い色を保持します。対照的に、ペレットに濃縮硫酸銅バイオ複合材料は、水和18の様々なレベルの硫酸銅の特性に一致する青色を有します。
ここで報告新規合成も意味でスケーラブルである自己組織化LIN耳の構造体は、電子顕微鏡法（ 図4）と従来の白色光顕微鏡を用いて示したように、マイクロスケール、ナノスケールのスケール（ 図3および6）。最近では、操作されたコイルドコイルタンパク質のマイクロファイバーは、蛍光照明19の下で観察されるように形成された繊維に対して許可クルクミンを組み込むことができることが報告されたことは興味深いです。同様の戦略は、イメージングのために、より大きな構造および/または機能強化の生産を提供するために、ここで報告さ線形複合材料にスペーサーまたはタギング剤を組み込むことも可能です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini Vortexer | VWR (https://us.vwr.com) | 58816-121 | |
| CO2 Incubator Model # 2425-2 | VWR (https://us.vwr.com) | Contact vendor | Current model calalog # 98000-360 |
| Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge) | Labnet (http://labnetinternational.com/) | C2500-R | Model Prism R |
| Cell Culture Centrifuge Model Z323K | Labnet (http://labnetinternational.com/) | Contact vendor | Current model Z206A catalog # C0206-A |
| Sonicator (Ultrasonic Cleaner) | Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/) | 1510R-MTH | |
| Balance | Sartorius (http://dataweigh.com) | Model CP225D similar model CPA225D | |
| Olympus IX51 Inverted Light Microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Olympus DP71 microscope digital camera | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| external power supply unit - white light for Olympus microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | TH4-100 | |
| 10X, 20X, and 40X microscope objectives | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html) | model S-4800 | |
| Transmission Electron Microscope | Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html) | model Libra 120 | |
| Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco (http://envirco-hvac.com) | model PNG62675 | Used for sterile cell culture technique |
References
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