Summary
Her præsenterer vi en protokol til at syntetisere nye, high-aspekt forholdet biokompositter under biologiske forhold og i flydende medier. De biokompositter skaleres fra nanometer til mikrometer i diameter og længde, henholdsvis. Kobber nanopartikler (CNPS) og kobbersulfat kombineret med cystin er de vigtigste komponenter til syntese.
Abstract
Målet med denne protokol er at beskrive syntesen af to nye biokompositter med høj sideforhold strukturer. De biokompositter består af kobber og cystin, med enten kobber nanopartikler (CNPS) eller kobber-sulfat bidrager den metalliske komponent. Syntese udføres i væske under biologiske betingelser (37 ° C) og den selv-samlet kompositter formen efter 24 timer. Når det er dannet, disse kompositter er meget stabile i både flydende medier og i en tørret form. Kompositmaterialerne skaleres fra nano- til mikro- interval i længden, og fra nogle få mikrometer til 25 nm i diameter. Feltemissions scanningselektronmikroskopi med Energy Dispersive X-ray spektroskopi (EDX) viste, at svovl var til stede i de NP-afledte lineære strukturer, mens det var fraværende fra udgangsmaterialet CNP materiale, hvilket således bekræfter cystin som kilde til svovl i de endelige nanokompositter . Under syntesen af disse lineære nano- og mikro-kompositter, en bred vifte af længder af structures dannes ved syntesen fartøj. Sonication af den flydende blanding efter syntese blev demonstreret til støtte for kontrollen gennemsnitlige størrelse af de strukturer ved at mindske den gennemsnitlige længde med forøget tid for lydbehandling. Da de dannede strukturer er meget stabile, ikke agglomerere, og er dannet i flydende fase, kan centrifugering også anvendes til at hjælpe med at koncentrere sig og segregerende dannede kompositter.
Protocol
1. Planlægning af forsøg
- Bestem mængden af kobber nanokompositter er nødvendige for syntese. På dette grundlag, vælge en række små mængder kolber (25 cm2) eller større kolber som angivet nedenfor i udarbejdelse af materialer.
- For denne syntese, anvendes en 37 ° C inkubator med 5% CO2 og mindst 40% fugtighed. Sikre, at en sådan inkubator er tilgængelig, og at det ikke vil blive forstyrret gentagne gange over en periode på syntese (ca. 24 timer).
ADVARSEL: Gentagen åbning og lukning af inkubatoren vil helt sikkert medføre temperaturudsving, som kan resultere i ændret syntese af nanocomposite strukturer.
2. Udarbejdelse af materialer
- Forberede alle materialer frisk før starten af et eksperiment, ved at tilføje faste materialer til opløsningsmidler lige før syntese er at begynde. Holde stamopløsninger af cystin og kobber udgangsmaterialer i flydende for lange gange bør eksperimentet anbefales ikke og kan føre til variable resultater. Efter åbning fra leverandøren, holde udgangsmaterialer tørre af indpakning toppen af beholderen med Parafilm.
Bemærk: Den følgende protokol anvendes som et eksempel til omsætning i en 25 cm2 cellekultur kolbe under anvendelse 7 pi cystin, 6643 pi sterilt vand, og 350 pi CNP'er. - Forbered en ml opløsning 2 mg / af kobber nanopartikler ved vejning mindst 2 mg CNP'er. Bær engangshandsker i dette trin for at forhindre mulig kontakt CNP'er med huden. Placer nanopartiklerne i en tom steril 16 ml hætteglas.
- Til hætteglasset indeholdende CNP'er, tilsæt sterilt deioniseret vand i passende volumen til at lave en 2 mg / ml opløsning og vortex opløsningen i 20 sekunder for at tilvejebringe dispergering af nanopartiklerne før syntese starter (mindst 1 ml totalvolumen anbefales). Fyld ikke hætteglasset mere end halvvejs med vand, da dette vil hæmme blanding ved vortex. CNP'er will hurtigt afregne til bunden af hætteglasset og vises mørk i farven (grå til sort).
- Sonikeres CNP opløsning 17 minutter ved stuetemperatur for at tilvejebringe maksimal dispersion af CNP'er før start af syntese. Regelmæssigt kontrollere at sikre, at CNP'er blander grund lydbehandling. Efter en vellykket sonikering, forbliver CNP'er suspenderet i opløsning i mindst 30 minutter, og opløsningen bliver mørk i farven.
- Afvej tilstrækkelig masse af cystin at lave en løsning for syntesen / ml 72,9 mg. Da cystin er ikke direkte opløseligt i vand, skal du placere den afvejede cystin i en antistatisk vejer fartøj.
- Med vejningen beholder indeholdende cystin, tilsæt tilstrækkeligt volumen sterilt, 1 M NaOH, således at cystin opløses fuldstændigt. For eksempel opløses 7,29 mg cystin fuldstændigt i 100 pi 1 M NaOH, for at gøre en opløsning 72,9 mg / ml.
- At opretholde sterile betingelser, udføre dette trin i en steril strømning vævskultur hætte.
ADVARSEL: NaOHved 1 M koncentration er kaustisk, så slid engangshandsker i dette trin for at undgå kontakt af koncentreret NaOH med huden
- Arbejder i en steril vævskultur hætte, tilsættes 7 pi cystin med 6.643 pi sterilt vand til den sterile syntese kolben først, og lad inkuber i 30 minutter i inkubatoren ved 37 ° C med kolben hætten udluftes (løst) for at tilvejebringe effektiv blanding. Resuspender 2 mg / ml CNP opløsningen ved hvirvelbehandling i 30 sek, idet CNP'er vil have afgjort efter sonikeringstrin.
- Tilsæt tilstrækkeligt CNP løsning på syntese kolbe (under anvendelse af steril teknik) for at vedligeholde følgende komponent forhold: kombinere 1 dele cystin, 50 dele Cnps, og 949 dele sterilt vand i en 25 cm2 cellekultur kolbe at starte syntesen. For eksempel til en 7 ml syntese volumen, kombinere 7 pi cystin stamopløsning, 350 pi CNP'er og 6643 pi sterilt vand. Sæt hætten på flasken og stram, så det er secure.
- Efter kombination af alle komponenter til syntesen, forsigtigt blandes i kolben ved omrystning 4-5 gange. Placer kolbe i CO2-inkubator og udluft kolben ved at løsne dækslet, så at der vil være gasudveksling ind og ud af kolben under syntese.
- Tillad syntese til at køre i inkubatoren i ca. 24 timer. Under syntesen, kan man iagttage, med mikroskopi og ved øjet, dannelse af yderst lineære kompositter.
Bemærk: Processen med dannelsen af de strukturer kan ske pludseligt i den forstand, at strukturerne er oprindeligt svært at opdage, så udseende fortsætter hurtigt stigende tæthed. Dannelse kan derfor forekomme, før 24 timer. Fremgangsmåden kan også iagttages med det blotte øje, når strukturerne bliver større og deres densitet øges. Mens generation af strukturerne kan iagttages over tid under mikroskop og ved øjet på senere tidspunkter, kontinuerligt afbryde syntesebetingelserne og temperatur vil føre til dårligsyntese resultaterne. - Afslutte syntesen af biokompositter ved fast capping syntesen kolbe og lagring af fartøjet i køleskab (4 ° C). Struktur, én gang genereret, forbliver stabile denne formular mindst årligt. Mærk kolben med syntesebetingelserne, herunder komponenter anvendes, dato for syntesen, og inkubationstid på syntesen før terminering.
3. Syntese Brug af kobbersulfat
- Foretag selvsamling-syntese ved at udskifte CNP'er med kobber sulfat salt. Ved anvendelse af steril teknik opløses mindst 2 mg kobbersulfat tilstrækkelig mængde sterilt deioniseret vand til fremstilling af en opløsning 2 mg / ml. De kobber-sulfat krystaller nemt gå i opløsning ved denne koncentration, men vortexes hætteglasset, hvis nødvendigt, og inspicere ved øjet for at sikre alle krystaller er opløst.
- Efter fremstilling af kobbersulfat, udfører syntese som beskrevet tidligere, men ved at erstatte CNP'er med kobbersulfat.
Bemærk: Selvstændige samlet nanokompositter hjælp kobbersulfat som udgangsmateriale viste sig at være langt mere konsekvent i endelig form end for konstruktioner syntetiseret fra CNP'er. - Afslutte syntesen af kobbersulfat biokompositter som for CNP kompositter (trin 2.6) og gemme dem langsigtet ved 4 ° C.
4. Karakterisering og håndtering af biokompositter Post-syntese
- Karakterisere biokompositter afledt af CNP'er og fra kobbersulfat ved hvidt lys mikroskopi 9 og ved elektronmikroskopi 9.
- Til karakterisering og kontrol af biokompositter post-syntese ved hvidt lys mikroskopi, anvender et omvendt mikroskop som kompositter vil sedimentere til bunden kolbens overflade inden for få minutter efter lægningen kolben flad, og derefter kan bringes i fokus. Brug kraftige indstilling felt på mikroskopet for at maksimere kontrasten mellem biokompositter og det flydende medium. Kompositter afledt af CNP'er og coppr sulfat vil både blive vist klart for uigennemsigtige i farver, men reagerede CNP aggregater vises meget mørk i farven.
- Bruge et digitalt kamera forbundet til mikroskopet til at tage billeder af kompositter. En række længder til de individuelle strukturer vil blive observeret.
- Til karakterisering og kontrol af biokompositter post-syntese og efter opbevaring ved 4 ° C, tillader kolber til at komme til stuetemperatur i mindst 15 minutter, da kolber vil danne kondens oprindeligt efter udtagning fra køleskab, som vil tilsløre effektiv fokusering under udførelsen af mikroskopi billeddannelse. Efter at ligevægt til RT, tørre den øverste og nederste overflader af kolben med en ren papirserviet for at maksimere mikroskopi billedkvalitet.
- Når du arbejder med eller billedbehandling kompositter, der er gemt langsigtet, vortex kolben 30 sek at dissociere klumper af kompositmaterialer, der danner mens i køleskabet. Efter vortex, inspicere de strukturer med en omvendt microscope at sikre, at aggregater har dissocieret, og gentag hvirvelbehandling efter behov.
- Bruge inverteret hvidt lysmikroskopi at vurdere effektiviteten af syntesen for en given eksperiment ved hjælp CNP'er. For eksempel dokumentere nærvær eller fravær af uomsat CNP'er i syntese kolber anvendes til CNP-afledte biokompositter fra kolber med forskellige parametre, såsom tidspunktet for syntese.
Bemærk: Individuel CNP'er er for små til at observere med et lysmikroskop, men uomsat CNP aggregater vil fremstå som runde-form og mørke objekter, i modsætning til de med held syntetiserede CNP-kompositter, som vil have en høj-formatforhold, lineær form, og vil have en række forskellige længder. Undgå at udføre syntese for længe af en tidsperiode før ophør, da dette vil resultere i stærkt forgrenede "urchin" type strukturer, som er vanskelige at dispergere i individuelle strukturer når de er dannet. - Bruge inverteret hvidt lysmikroskopi at vurdere virkningenaf syntesen for en given eksperiment ved hjælp kobbersulfat. Da kobber sulfat går helt i opløsning ved hjælp af denne protokol, vil løsningen synes mindre mørk end løsningen fra syntesen ved hjælp CNP'er. Dokumentere størrelsen og omfanget af kobber sulfat kompositter ved at sammenligne kolber med forskellige syntese forhold som tidspunktet for syntese før opsigelsen.
Bemærk: Succesfuld syntetiserede kompositter vil vise en række forskellige længder. Undgå at udføre syntese for længe af en tidsperiode før ophør, da dette vil resultere i stærkt forgrenede aggregater af kompositter, hvoraf nogle vil være "urchin-lignende" i struktur, og som er vanskelige at dispergere i individuelle strukturer når de er dannet .
- Til karakterisering og kontrol af biokompositter post-syntese ved hvidt lys mikroskopi, anvender et omvendt mikroskop som kompositter vil sedimentere til bunden kolbens overflade inden for få minutter efter lægningen kolben flad, og derefter kan bringes i fokus. Brug kraftige indstilling felt på mikroskopet for at maksimere kontrasten mellem biokompositter og det flydende medium. Kompositter afledt af CNP'er og coppr sulfat vil både blive vist klart for uigennemsigtige i farver, men reagerede CNP aggregater vises meget mørk i farven.
- At koncentrere biokompositter post-syntese, centrifuge opløsninger af kompositmaterialer i et centrifugerør. Tilsæt 6 ml af enten CNP-afledte strukturer eller kobbersulfat-afledte strukturer til et 15 ml centrifugerør. Centrifugeres i 10 minved 500 xg ved stuetemperatur til dannelse af en pellet. For mindre mængder, tilsættes 500 pi strukturer i løsning på 0,6 ml mellemstore rør. Der centrifugeres ved 2.000 xg ved stuetemperatur i mindst 10 min til dannelse af en pellet.
- Efter centrifugering i tilstrækkelig tid (mindst 10 min for microfuges), gemme det observerbare pellet i bunden af røret, hvor strukturerne er koncentreret ved omhyggeligt at fjerne supernatantvæsken over pelleten. Biokomposit strukturer afledt kobbersulfat forekommer blåt og strukturer afledt CNP'er er mørkere (grå til sort).
- Tilføje flere kompositter til dette rør og gentage processen i det samme rør til at koncentrere strukturer, hvis det ønskes. At dispergere de koncentrerede pellets, tilføje det ønskede volumen af opløsning til røret, og vortex i 10-30 sek.
- Soniker strukturer når de er dannet, for at flytte den gennemsnitlige populationsstørrelse (længder) af strukturerne til lavere værdier. Placer strukturer i sterilt deioniseret vand og soniker i least 10 min. Under anvendelse af denne proces med tiden strukturer blive fragmenteret og mindre i gennemsnitlig længde (se figur 6 i teksten). Dokument ændringer i sammensatte størrelser med forskellige lydbehandling gange med et omvendt hvidt lys mikroskop og digitalkamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et flow-chart skematisk af syntesetrin til dannelse af de lineære biokompositter beskrevet i dette arbejde. CNP'er eller kobbersulfat som udgangsmaterialer kombineres med sterilt vand til dannelse af en opløsning 2 mg / ml, denne opløsning blandes og sonikeret for at tilvejebringe en jævn blanding, og dette kobber opløsning blandes derefter i følgende forhold til syntese: 949 dele steril vand: 50 dele kobber blanding: 1 del cystin stamopløsning. De faktiske mængder kan øges eller mindskes i henhold til disse forhold til at skalere op eller nedtrappe den endelige syntese udbytte. Efter inkubation i mindst 2 timer som angivet, er lineære biokomposit strukturer dannes der over tid kan observeres under normale hvidt lys-mikroskopi eller ved øjet som de flydende ændringer opløsning i udseende.
Figur 2 viser et repræsentativt resultat fra den oprindelige opdagelse af disse lineære strukturer i komplet celledyrkningsmedier over en periode på 82 timer. Vores laboratorium udførte evaluering af den potentielle toksicitet af forskellige nanomaterialer, herunder CNP'er på normale celler og kræftceller, og cellerne er vist i figur 2 er en hurtigt voksende hjernetumor cellelinje fra ATCC (CRL-2020). Et centralt supplement til den komplette medier, der anvendes til disse celler er cystin, som viste sig at være en væsentlig forudsætning til opdagelsen af, hvorfor disse lineære strukturer blev formning i kulturerne (se nedenfor og diskussion afsnit). Fra en indledende selv dispersion af CNP'er som hurtigt aggregere til mikrostrukturer (figur 2A og 2B), over tid de mindre partikler cleares og større aggregater dannes (figurerne 2C og 2D). Endelig større aggregater med fine, lineære strukturer forekommer i de samme boringer (figur 2E-H), der udgør de "urchin" type strukturer tidligere er rapporteret i litteraturen ved hjælp af ikke-biological metoder 6. Sammenligning af de sidste to tidspunkter, på 69 og 82 timer (figur 2G og 2H, henholdsvis), viser, at udviklingen af de store urchin type strukturer forbliver ret stabil, som angivet ved billeddannelse af samme nøjagtige område.
At forklare, hvorfor disse Urchin-lignende strukturer under disse betingelser i cellekulturer blev observeret, begyndte vi at fjerne medier komponenter for at bestemme, om de væsentlige elementer kunne isoleres. Vi opdagede, at et centralt element og supplement til cellekulturmedier var cystin, som ved udelukkelsesmetoden blev til sidst identificeret som et væsentligt element for selvstændige samleprocessen. Ved at forenkle syntese komponenter (se figur 1), kunne vi i sidste ende danne høj formatforhold (lineær) strukturer i flydende, som kunne påvises over tid for at omdanne fra nanopartikel formularen lineær form, uden behov for celler, eller et af den anden cellekultur komponenter (figur 3A-C).
Figur 4 viser karakteriseringen af de opdaget hidtil ukendte strukturer ved hjælp af elektronmikroskopi, herunder en transmissionselektronmikroskopi (TEM) billedfangst nanopartikel udgangsmateriale og dannelse af lineære nanostrukturer (figur 4A). Repræsentativt scanningselektronmikrografi (SEM) billeder er vist for udgangsmateriale CNP'er, lineære strukturer dannet af NPS og lineære strukturer dannet af kobbersulfat udgangsmateriale (fig 4B-F, henholdsvis).
At kontrollere, at biokompositter indeholdt cystin eller cystin afledt materiale som en væsentlig biologisk bestanddel af kompositter, blev de dannede strukturer analyseres ved hjælp EDX med SEM mikroskopi. Repræsentative skærmbilleder fra analyserede materialer er vist i figur 5. Vigtigt er det, når man sammenligner CNP'er og biokompositter fra CNP'er, en fremtrædendesvovl peak vises (figur 5B), hvilket ikke er til stede i CNP udgangsmaterialet (figur 5A). For biokompositter igennem kobbersulfat som udgangsmateriale (figur 5C), carbon- og nitrogenkilder toppe vises (figur 5D), hvilket er i overensstemmelse med tilstedeværelsen af cystin for dette biokomposit.
På dette tidspunkt, har en fremgangsmåde til styring af længden og størrelsen af kompositmaterialer under syntesen ikke blevet identificeret. Men for at undersøge, om gennemsnitlige størrelse af strukturer kunne kontrolleres efter syntese blev lineære biokompositter sonikeret i forskellige tidsrum som vist i figur 6. Med øget tid for lydbehandling blev det vist, at den gennemsnitlige størrelse af de lineære biokompositter faldt, som vist ved lysfeltmikroskopi (figurerne 6A-D). Som en fremgangsmåde til koncentrering og adskillelse dannede kompositter, kan centrifugering anvendes, og som vist i fig 6E-G, Kan en synlig pille udvikles afhængigt af mængder og centrifugalkraft, der anvendes.
Figur 1. Repræsentativ rutediagram for syntese design Cu NPS = kobber nanopartikler.; Cys = cystin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentativ dannelse af kobber biokomposit strukturer i hjernen tumor cellekulturer med komplet cellekulturmedier. Et repræsentativt eksperiment spores over en alt 82 timer er vist i cellekultur indeholdende hjerne tumorceller og CNP'er (50 ug / ml). Panel A og B viserkulturbrøndene på tidspunktet 0 efter CNP'er har løst til bunden af brønden. Paneler ch vise efterfølgende tidspunkter på 17, 24, 36, 49, 69, og 82 timer, henholdsvis. Paneler G og H repræsenterer den samme felt ved 69 og 82 timer. Alle billeder blev opnået under anvendelse brightfield mikroskopi at forbedre kontrasten af kobber materiale. Scale barer = 100 mikrometer for A + B, 50 mikron for CE, og 25 mikron for F + G. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Transformation af CNP'er lineære biokompositter. CNP'er blev kombineret med cystin og vand som angivet i figur 1 og i protokol sektion med et samlet volumen på 7 ml. Panel A viser syntesen fartøj ved tid 0, panel B viser 3 timer, og felt C shOWS 6 timer. Billeder blev opnået ved hjælp brightfield mikroskopi med skala bar angivet (50 mikrometer). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Elektronmikroskopi karakterisering af syntetiserede biokompositter Panel (A):. TEM af CNP udgangsmateriale (rund) med dannelse af lineære kompositter. Paneler (B) og (C) viser karakterisering af udgangsmaterialet CNP'er hjælp SEM. Panel (C) er et zoomet billede af (B). Panel (D) viser SEM af kompositmaterialer dannet af CNP'er og cystin. Paneler (E) og (F) viser SEMs af kobber sulfat biokompositter. Panel (F) er en ZOOMEd billede af (E). Scale barer er angivet i billeder og = 200 nm i (A), 1 mikron i (B), 500 nm i (C), 5 mikron i (D), 2 mikron i (E), og 1 mikrometer i (F ). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. EDX (SEM) analyse af udgangsmaterialer og syntetiseret lineære kompositter. Screen snapshots af SEM scannede prøver ved hjælp af EDX analyse for elementært indhold. Panel (A) = start CNP'er; Panel (B) = biokompositter fra CNP'er og cystin; Panel (C) = kobbersulfat udgangsmateriale, og panel (D) = kompositter from kobbersulfat og cystin. For peak mærkning, C = carbon, O = oxygen, Cu = kobber, S = svovl, og N = nitrogen. Større etiketter til elementært identitet er blevet placeret over de vigtigste toppe for let visning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Ændring af lineære komposit størrelse og koncentration efter syntese. Lineære strukturer syntetiseret fra kobbersulfat blev sonikeret i 0, 15, 30, eller 60 minutter, henholdsvis, som vist i panelerne (AD). Billeder blev opnået under anvendelse brightfield mikroskopi med Målestokken på 200 mikron angivet i alle billeder. Paneler (EG), koncentration af biokompositter anvendelse af centrifugering: 6 ml lineære strukturer afledt af CNP'er (<strong> E, venstre) og kobbersulfat (E, højre) er vist afregning under tyngdekraft efter 10 min. Med 10 min centrifugering ved 500 x g, er en komprimeret pellet dannet (panel F). Et mindre volumen (500 ul) af det samme materiale blev koncentreret som vist i (panel G) (CNP-afledte konstruktioner er vist i de venstre rør og kobbersulfat-afledte strukturer i den rigtige rør). Venligst klik her for et større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens evaluere potentielle toksiske virkninger af nanomaterialer, herunder CNP'er, blev det observeret, at på lang sigt, blev CNP'er forvandlet fra et oprindeligt mere spredt partikulært distribution til en større, aggregeret form (figur 2). I nogle tilfælde er disse yderst aggregerede formationer, som blev produceret i cellekultur skålen, under biologiske betingelser, der dannes stærkt lineære fremspring fra den centrale aggregat, der minder om tidligere beskrevet kobber- indeholdende "søpindsvin" 6. Det skal bemærkes, at under betingelserne vist her, er koncentrationen af CNP'er sat til cellerne var submaksimal, således ikke at dræbe alle de celler i kultur (se figur 2). Fra disse indledende bemærkninger og eksperimenter fortsatte derefter ved at fjerne successivt flere komponenter af celledyrkningsbetingelser de (herunder i sidste ende cellerne selv) for at finde de resterende nøglekomponenter nødvendige for syntese of lineære kobber biokompositter.
Vi opdagede, at cystin, en kompletteret komponent af de oprindelige cellekulturer, når de kombineres med CNP'er under de korrekte biologiske forhold, kan resultere i transformation af nanopartikelform til en yderst lineær biokomposit der indeholdt både metal og biokemiske komponenter som angivet ved EDX-analyse ved scanningselektronmikroskopi af de fremstillede prøver (figur 5). Således svovl, som ikke er til stede i udgangsmaterialet CNP materiale, viser en fremtrædende top i de syntetiserede biokompositter, hvilket indikerer, at både kobber og komponenter af den biokemiske materiale cystin er afgørende for de dannede lineære strukturer.
Det blev endvidere vist, at ved anvendelse af lignende syntesebetingelser, men ved at erstatte CNP'er med kobbersulfat, stærkt lineære biokompositter kunne også dannes. Faktisk syntese under anvendelse kobbersulfat og cystin tendens til at resultere i "renere" enD produkter, idet ingen uomsat CNP'er var altid til stede, idet kobbersulfat er fuldt opløseligt i vand, som blev anvendt som opløsningsmiddel i alle synteserne rapporteret her. Yderligere, kobber-sulfat biokompositter adskiller sig fra CNP-afledte kompositter i at fastholde en blå farve, som var tydelige ved centrifugering af materialet.
Andre grupper har tidligere studeret kobber-cystin komplekser og defineret nogle vigtige kemiske egenskaber. For eksempel Kahler et al. Demonstrerede dannelsen af kobber-cystin-komplekser i form af fine fibre, som var indlysende ved tørring, men ustabilt i opløsning 13. I andre eksempler kompleksdannelse studier med L-cystin og forskellige metalkationer, bekræfter kobber og cystin kompleksdannelse i et vandigt medium 14 og dannede komplekser kan være én- eller flerkernet, med svovl fra cystin bidrager til kompleksdannelse 15. En række undersøgelser har rapportened interaktioner mellem cystin og kobber i biologiske systemer. For eksempel ved fysiologisk pH, kobber (II) ioner koordinere med histidin og cystin i simuleret plasma til at danne komplekser 16 og svovlholdige aminosyrer viste sig at være beskyttende mod kobbertoksicitet i kyllinger 17. Disse fund støtter dermed den væsentlige rolle, som cystin i kompleksdannelse med kobber udgangsmateriale i vores syntesemetoder til dannelse af lineære biokompositter.
På dette tidspunkt er endnu ikke blevet identificeret en syntesestrategi, der direkte kan styre længden af individuelle lineære biokompositter vist her. Imidlertid er de kritiske trin identificeret i den beskrevne syntese omfatter: 1) god dispersion ved lydbehandling af udgangsmaterialer i tilfælde af syntese inkorporerer CNP'er; 2) anvendelse af frisk fremstillet CNP'er, kobbersulfat, og cystin til effektiv syntese af kompositter; 3) at tillade syntese i kolben at forblive uforstyrret i incubateller i mindst 6 timer, og 4) at undgå "over-reaktion" betingelser, som forgrenede "urchin" -type, aggregerede kompositter form.
Efter syntese er afsluttet, blev det vist, lydbehandling af strukturerne kan udnyttes effektivt til at reducere den gennemsnitlige størrelse (længde) af strukturerne. Sonikering at gøre mindre strukturer kan støtte i applikationer såsom celle optagelse eller andre biokomposit-cellulære interaktioner. Som tidligere er blevet rapporteret, opkræve stabilisering af CNP'er i løbet af denne syntese ved at kombinere med cystin ændret den målte zetapotentiale fra positiv til en mindre opladet (negativ) formular 9. Denne ændring i ladning kan hjælpe med at forklare, hvorfor de dannede kompositter viser meget lidt aggregering i tørret form eller flydende medier, hvilket gør håndteringen af de strukturer meget mere praktisk.
Da den rapporterede syntese af disse CNP-afledte og kobbersulfat-afledte konstruktioner udføres out i flydende medier, forventes det, at fremgangsmåden kan være yderst skalerbar, hvilket betyder, at med det rette forhold mellem komponenter og syntesebetingelserne, kunne milliliter syntese opskriften her anvendes skaleres op eller ned for at omfatte mange hundrede milliliter eller mere, og ville således forventes at give mere endelige produkt, så godt. På grund af det metal (kobber) -delen af disse biokompositter, er det ganske ligetil at koncentrere syntetiseret produkt ved centrifugering (figur 6). Biokompositter dannet af CNP udgangsmateriale bevarer en mørkere farve en gang koncentreret til en pellet, muligvis på grund af uomsatte kobberoxid nanopartikler (figur 6). Til sammenligning, kobbersulfat biokompositter når koncentreret til en pellet har en blå farve, i overensstemmelse med egenskaberne af kobbersulfat med forskellige niveauer af hydrering 18.
Romanen syntese rapporteret her er også skalerbar i den forstand, at selv-samlet linøre strukturer skalere fra nanoskala til mikroskala som vist ved hjælp af elektronmikroskopi (figur 4) og traditionel hvid lysmikroskopi (figur 3 og 6). Det er interessant at bemærke, at for nylig, manipulerede coiled-coil protein mikrofibre blev rapporteret at kunne inkorporere curcumin som tilladt for de dannede fibre, der skal observeres under fluorescensbelysning 19. Lignende strategier kan være muligt at inkorporere afstandsstykker eller tagging agenter i de lineære kompositter rapporteres her for at give produktionen af større strukturer og / eller forbedringer for billedbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini Vortexer | VWR (https://us.vwr.com) | 58816-121 | |
| CO2 Incubator Model # 2425-2 | VWR (https://us.vwr.com) | Contact vendor | Current model calalog # 98000-360 |
| Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge) | Labnet (http://labnetinternational.com/) | C2500-R | Model Prism R |
| Cell Culture Centrifuge Model Z323K | Labnet (http://labnetinternational.com/) | Contact vendor | Current model Z206A catalog # C0206-A |
| Sonicator (Ultrasonic Cleaner) | Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/) | 1510R-MTH | |
| Balance | Sartorius (http://dataweigh.com) | Model CP225D similar model CPA225D | |
| Olympus IX51 Inverted Light Microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Olympus DP71 microscope digital camera | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| external power supply unit - white light for Olympus microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | TH4-100 | |
| 10X, 20X, and 40X microscope objectives | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html) | model S-4800 | |
| Transmission Electron Microscope | Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html) | model Libra 120 | |
| Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco (http://envirco-hvac.com) | model PNG62675 | Used for sterile cell culture technique |
References
- Klinman, J. P. The copper-enzyme family of dopamine beta-monooxygenase and peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase: resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation. The Journal of biological chemistry. 281, 3013-3016 (2006).
- Uauy, R., Olivares, M., Gonzalez, M. Essentiality of copper in humans. The American journal of clinical nutrition. 67, 952S-959S (1998).
- Karlsson, H. L., Cronholm, P., Gustafsson, J., Copper Moller, L. oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes. Chemical research in toxicology. 21, 1726-1732 (2008).
- Parekh, G., et al. Layer-by-layer nanoencapsulation of camptothecin with improved activity. International journal of pharmaceutics. 465, 218-227 (2014).
- Harrington, M. J., Masic, A., Holten-Andersen, N., Waite, J. H., Fratzl, P. Iron-clad fibers: a metal-based biological strategy for hard flexible coatings. Science. 328, 216-220 (2010).
- Keyson, D., et al. CuO urchin-nanostructures synthesized from a domestic hydrothermal microwave method. Materials Research Bulletin. 43, 771-775 (2008).
- Liu, B., Zeng, H. C. Mesoscale organization of CuO nanoribbons: formation of 'dandelions'. J Am Chem Soc. 126, 8124-8125 (2004).
- Peng, M., et al. Controllable synthesis of self-assembled Cu2S nanostructures through a template-free polyol process for the degradation of organic pollutant under visible light. Materials Research Bulletin. 44, 1834-1841 (2009).
- Deodhar, S., Huckaby, J., Delahoussaye, M., DeCoster, M. A. High-Aspect Ratio Bio-Metallic Nanocomposites for Cellular Interactions. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 64, 012014 (2014).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12, 47-53 (2010).
- Wiogo, H. T., Lim, M., Bulmus, V., Yun, J., Amal, R. Stabilization of magnetic iron oxide nanoparticles in biological media by fetal bovine serum (FBS). Langmuir. 27, 843-850 (2011).
- Yunker, P. J., Still, T., Lohr, M. A., Yodh, A. G. Suppression of the coffee-ring effect by shape-dependent capillary interactions. Nature. 476, 308-311 (2011).
- Kahler, H., Lloyd Jr, B., Eden, M. Electron Microscopic and Other Studies on a Copper–Cystine Complex. The Journal of Physical Chemistry. 56, 768-770 (1952).
- Furia, E., Sindona, G. Complexation of L-cystine with metal cations. Journal of Chemical & Engineering Data. 55, 2985-2989 (2010).
- Hawkins, C., Perrin, D. Polynuclear Complex Formation. II. Copper (II) with Cystine and Related Ligands. Inorganic Chemistry. 2, 843-849 (1963).
- Hallman, P., Perrin, D., Watt, A. E. The computed distribution of copper (II) and zinc (II) ions among seventeen amino acids present in human blood plasma. Biochem. J. 121, 549-555 (1971).
- Jensen, L. S., Maurice, D. V. Influence of sulfur amino acids on copper toxicity in chicks. The Journal of nutrition. 109, 91-97 (1979).
- Lee, Y., Choi, J. R., Lee, K. J., Stott, N. E., Kim, D. Large-scale synthesis of copper nanoparticles by chemically controlled reduction for applications of inkjet-printed electronics. Nanotechnology. 19, 415604 (2008).
- Hume, J., et al. Engineered coiled-coil protein microfibers. Biomacromolecules. 15, 3503-3510 (2014).
