Summary
Aquí se presenta un protocolo para sintetizar nuevos, biocomposites elevada relación de aspecto en condiciones biológicas y en medios líquidos. Los biocomposites escala de nanómetros a micrómetros de diámetro y longitud, respectivamente. Nanopartículas de cobre (CNP) y sulfato de cobre en combinación con cistina son los componentes clave para la síntesis.
Abstract
El objetivo de este protocolo es describir la síntesis de dos nuevos biocomposites con estructuras de elevada relación de aspecto. Los biocomposites consisten en cobre y cistina, ya sea con nanopartículas de cobre (CNP) o sulfato de cobre contribuye el componente metálico. La síntesis se llevó a cabo en un líquido en condiciones biológicas (37 ° C) y la forma composites autoensambladas después de 24 hr. Una vez formados, estos compuestos son muy estables tanto en medios líquidos y en una forma seca. Los materiales compuestos escala de la nano- a micro gama de longitud, y desde unos pocos micrómetros a 25 nm de diámetro. Emisión de campo microscopía electrónica de barrido con espectroscopia de rayos X de energía dispersiva (EDX) demostró que el azufre estaba presente en las estructuras lineales derivados de NP, mientras que estaba ausente de material de partida CNP, confirmando así la cistina como la fuente de azufre en los nanocompuestos finales . Durante la síntesis de estos nano y micro-compuestos lineales, una amplia gama de longitudes de structures se forma en el recipiente de síntesis. La sonicación de la mezcla líquida después de la síntesis se demostró para ayudar a controlar el tamaño promedio de las estructuras por la disminución de la longitud media con un aumento del tiempo de sonicación. Dado que las estructuras formadas son muy estables, no se aglomeran, y están formados en fase líquida, centrifugación también puede ser usada para ayudar en la concentración y la segregación de los materiales compuestos formados.
Protocol
1. Planificación de Experimentos
- Determinar el volumen de nanocompuestos de cobre necesarios para la síntesis. Sobre esa base, elegir un número de frascos pequeños volumen (25 cm2), o frascos más grandes, como se indica a continuación en la preparación de materiales.
- Para esta síntesis, utilizar una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 y al menos 40% de humedad. Asegúrese de que una incubadora tal está disponible y que no será perturbado en repetidas ocasiones durante el periodo de síntesis (aproximadamente 24 hr).
PRECAUCIÓN: apertura repetida y el cierre de la incubadora sin duda causar fluctuaciones de temperatura que pueden resultar en la síntesis alterada de las estructuras de nanocompuestos.
2. Preparación de los materiales
- Preparar todos los materiales frescos antes del inicio de un experimento, mediante la adición de materiales sólidos a los disolventes justo antes de la síntesis es comenzar. Mantener las soluciones stock de los materiales de partida de cistina y cobre en líquido para tiempos largos bntes no se recomienda el experimento y puede conducir a resultados variables. Una vez abierto desde el proveedor, mantener los materiales secos envolviendo la parte superior del recipiente con Parafilm de partida.
Nota: El siguiente protocolo se utiliza como un ejemplo para la reacción en un 25 cm 2 frasco de cultivo celular usando 7 l de cistina, 6643 l de agua estéril, y 350 l de CNP. - Preparar una solución de 2 mg / ml de las nanopartículas de cobre pesando al menos 2 mg de CNP. Use guantes desechables durante este paso para evitar el posible contacto con la piel del CNP. Coloque las nanopartículas en una estéril 16 ml vial vaso vacío.
- Para el vial que contiene CNP, añadir agua desionizada estéril en el volumen adecuado para hacer una solución de 2 mg / ml y agitar la solución durante 20 segundos para proporcionar una dispersión de las nanopartículas antes del comienzo de síntesis (se recomienda al menos 1 ml de volumen total). No llene el camino vial más de la mitad con agua ya que esto inhibirá la mezcla por agitación. CNP will asiente rápidamente a la parte inferior del vial y aparecerá de color oscuro (gris a negro).
- Sonicar la solución CNP por 17 minutos a temperatura ambiente para proporcionar la dispersión máxima de CNP antes del inicio de la síntesis. Revise periódicamente para asegurarse de que los CNP se mezclaba debido al tratamiento con ultrasonidos. Después de una sonicación éxito, CNP permanecen suspendidas en solución durante al menos 30 min y la solución será de color oscuro.
- Pesar masa suficiente de cistina para hacer una solución / ml 72,9 mg para la síntesis. Desde cistina no es directamente soluble en agua, coloque la cistina pesaron en un recipiente de pesada antiestático.
- Para el recipiente que contiene cistina pesaje, añadir un volumen suficiente de estéril, 1 M NaOH, de modo que la cistina se disuelve completamente. Por ejemplo, se disuelven 7,29 mg de cistina completamente en 100 l de 1 M NaOH, para hacer una solución 72,9 mg / ml.
- Para mantener condiciones estériles, llevar a cabo este paso en un tejido flujo campana de cultivo estéril.
PRECAUCIÓN: NaOHa 1 M de concentración es cáustico, así que use guantes desechables durante este paso para evitar el contacto de NaOH concentrado con la piel
- Trabajando en una campana de cultivo de tejido estéril, añadir 7 l de cistina con 6643 l de agua estéril al matraz estéril primera síntesis, y dejar incubar durante 30 min en la incubadora a 37 ° C con la tapa de matraz ventilada (suelto) para proporcionar eficaz de mezcla. Resuspender la solución de 2 mg / ml CNP por agitación durante 30 segundos, ya que los CNP se han asentado después de la etapa de sonicación.
- Añadir suficiente solución CNP en el matraz de síntesis (utilizando una técnica estéril) para mantener las relaciones de los componentes siguientes: 1 combinar partes cistina, 50 partes CNP, y 949 partes de agua estéril en un matraz de cultivo de 2 células 25 cm para iniciar la síntesis. Por ejemplo, para un volumen de síntesis 7 ml, combinar 7 l de solución de cistina Stock, 350 l de CNP, y 6.643 l de agua estéril. Vuelva a colocar la tapa en el frasco y apriete de modo que sea sege.
- Después de combinar todos los componentes para la síntesis, mezclar suavemente en el matraz por agitación 4-5 veces. Colocar el frasco en la incubadora de CO 2 y ventilar el frasco aflojando el tapón de modo que no habrá intercambio de gases en y fuera del matraz durante la síntesis.
- Permita que la síntesis se ejecute en la incubadora durante aproximadamente 24 horas. Durante la síntesis, se puede observar, con microscopía y por el ojo, la formación de materiales compuestos altamente lineales.
Nota: El proceso de formación de las estructuras puede ocurrir de repente en el sentido de que las estructuras son inicialmente difícil de detectar, a continuación, apariencia procede rápidamente a una densidad creciente. Por lo tanto, la formación puede ocurrir antes de las 24 horas. El proceso también puede ser observado por el ojo una vez que las estructuras se hacen más grandes y aumenta su densidad. Mientras que la generación de las estructuras se puede observar con el tiempo bajo el microscopio y por el ojo en puntos de tiempo posteriores, interrumpiendo continuamente las condiciones de síntesis y la temperatura dará lugar a pobreresultados de la síntesis. - Terminar síntesis de biocomposites por tapado herméticamente el matraz de síntesis y el almacenamiento de la embarcación en un refrigerador (4 ° C). Estructuras, una vez generados, se mantienen estables en esta forma por lo menos durante un año. Etiquetar el matraz con condiciones de síntesis, incluyendo componentes utilizados, fecha de la síntesis, y tiempo de incubación de la síntesis antes de la terminación.
3. Síntesis Uso de sulfato de cobre
- Llevar a cabo la síntesis de auto-ensamblaje mediante la sustitución de los CNP con sal de sulfato de cobre. Utilizando una técnica estéril, disolver al menos 2 mg de sulfato de cobre en un volumen suficiente de agua desionizada estéril para hacer una solución de 2 mg / ml. Los cristales de sulfato de cobre fácilmente entran en solución a esta concentración, pero vórtice el vial si es necesario, e inspeccionar por ojo para asegurar que todos los cristales se disuelven.
- Después de la preparación del sulfato de cobre, llevar a cabo la síntesis como se describe anteriormente, pero sustituyendo los CNP con el sulfato de cobre.
Nota: nanocompuestos autoensambladas utilizando sulfato de cobre como material de partida se encontraron a ser mucho más coherente en forma final que para estructuras sintetizados a partir de los CNP. - Terminar la síntesis de biocomposites sulfato de cobre como para materiales compuestos CNP (paso 2.6) y almacenarlos a largo plazo a 4 ° C.
4. Caracterización y Manejo de Biocomposites post-síntesis
- Caracterizar biocomposites derivados de CNP y de sulfato de cobre por la luz blanca de la microscopía 9 y por microscopía electrónica 9.
- Para la caracterización y la inspección de biocomposites post-síntesis por la luz de microscopía blanco, usar un microscopio invertido como compuestos se depositan en la superficie inferior del frasco dentro de unos pocos minutos de la puesta del matraz plana, y luego se pueden poner en el foco. Utilice el ajuste de campo claro en el microscopio para maximizar el contraste entre biocomposites y el medio líquido. Compuestos derivados de CNP y la policíapor tanto el sulfato se aparecerá claro a opaco en color, pero los agregados CNP sin reaccionar aparecerá muy oscuro en color.
- Utilice una cámara digital conectada al microscopio para capturar imágenes de los materiales compuestos. Se observó un intervalo de longitudes para las estructuras individuales.
- Para la caracterización y la inspección de biocomposites post-síntesis y después de almacenamiento a 4 ° C, permiten frascos para llegar a la temperatura ambiente durante al menos 15 minutos como frascos formarán condensación inicialmente después de la retirada de la nevera, que oscurecer eficaz centrarse en el ejercicio de formación de imágenes de microscopía. Después de permitir el equilibrado a TA, limpie las superficies superior e inferior del matraz con una toalla de papel limpia para maximizar la calidad de imagen de microscopía.
- Cuando se trabaja con imágenes o materiales compuestos que se han almacenado a largo plazo, vórtice del frasco durante 30 segundos para disociar grupos de compuestos que se forman mientras que en el refrigerador. Después vórtex, inspeccione las estructuras con un micrófono invertidaroscope para asegurar que los agregados han disociado, y repetir vórtex según sea necesario.
- Utilice la luz blanca microscopía invertida para evaluar la eficacia de la síntesis para un experimento dado usando CNP. Por ejemplo, documentar la presencia o ausencia de los CNP sin reaccionar en matraces de síntesis utilizados para biocomposites derivados de CNP de frascos con diferentes parámetros tales como el tiempo de síntesis.
Nota: Individual CNP son demasiado pequeños para observar con un microscopio de luz, pero que no ha reaccionado CNP agregados aparecerá como redondo y objetos oscuros, en contraste con los CNP-materiales compuestos han sintetizado con éxito que tendrá una alta relación de aspecto, forma lineal, y tendrá una gama de diferentes longitudes. Evitar realizar síntesis para demasiado largo de un período de tiempo antes de la terminación, ya que esto dará lugar a muy ramificadas estructuras tipo "de erizo", que son difíciles de dispersar en estructuras individuales, una vez formados. - Utilice invertido microscopio de luz blanca para evaluar la eficaciade la síntesis para un experimento dado usando sulfato de cobre. Desde el sulfato de cobre va completamente en solución usando este protocolo, la solución aparecerá menos oscuro que la solución de síntesis utilizando CNP. Documentar el tamaño y la extensión de los materiales compuestos de sulfato de cobre mediante la comparación de frascos con diferentes condiciones de síntesis tales como el tiempo de síntesis antes de la terminación.
Nota: Los compuestos sintetizados con éxito se mostrará una gama de diferentes longitudes. Evitar realizar síntesis para demasiado largo de un período de tiempo antes de la terminación, ya que esto dará lugar a agregados altamente ramificadas de compuestos, algunos de los cuales serán "erizo-like" en la estructura, y que son difíciles de dispersar en estructuras individuales, una vez formados .
- Para la caracterización y la inspección de biocomposites post-síntesis por la luz de microscopía blanco, usar un microscopio invertido como compuestos se depositan en la superficie inferior del frasco dentro de unos pocos minutos de la puesta del matraz plana, y luego se pueden poner en el foco. Utilice el ajuste de campo claro en el microscopio para maximizar el contraste entre biocomposites y el medio líquido. Compuestos derivados de CNP y la policíapor tanto el sulfato se aparecerá claro a opaco en color, pero los agregados CNP sin reaccionar aparecerá muy oscuro en color.
- Concentrar biocomposites post-síntesis, las soluciones de centrífuga de composites en un tubo de centrífuga. Añadir 6 ml de cualquiera de las estructuras derivadas-CNP o estructuras de sulfato de cobre-derivado a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar durante 10 minutosa 500 xg a temperatura ambiente para formar un pellet. Para volúmenes más pequeños, añadir 500 l de estructuras en solución a 0,6 ml tubos de tamaño. Centrifugar a 2000 xg a temperatura ambiente durante al menos 10 min para formar un pellet.
- Después de centrifugar durante un tiempo suficiente (al menos 10 min para microfuges), guardar el precipitado observable en la parte inferior del tubo donde las estructuras se concentran eliminando cuidadosamente el líquido sobrenadante por encima del sedimento. Estructuras biocompuesto derivados de sulfato de cobre aparecen de color azul y estructuras derivadas de los CNP son más oscuros (gris a negro).
- Añadir más compuestos a este tubo y repetir el proceso en el mismo tubo para concentrar las estructuras si se desea. Para dispersar a los gránulos concentrados, añadir el volumen deseado de solución al tubo, y agitar durante 10 a 30 segundos.
- Estructuras sonicado una vez formado, para mover el tamaño de la población media (longitudes) de las estructuras a valores más bajos. Coloque las estructuras en agua desionizada estéril y sonicado durante al least 10 min. Utilizando este proceso, con el tiempo, las estructuras se fragmentan y más pequeño en longitud media (véase la figura 6 del texto). Documentar los cambios en los tamaños de compuestos con diferentes tiempos de sonicación utilizando un microscopio de luz blanca invertida y cámara digital.
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Representative Results
La figura 1 muestra un diagrama de flujo esquemático de las etapas de síntesis para formar los biocomposites lineales descritos en este trabajo. CNP o sulfato de cobre como materiales de partida se combinan con agua estéril para formar una solución 2 mg / ml, esta solución se mezcla y se sometió a ultrasonidos para proporcionar una mezcla homogénea, y esta solución de cobre se mezcla a continuación en la siguiente relación para la síntesis de: 949 partes estéril agua: 50 partes de la mezcla de cobre: 1 parte de solución de cistina de valores. Los volúmenes reales pueden aumentar o disminuir de acuerdo a estas relaciones de escala hacia arriba o abajo de la escala de rendimiento síntesis final. Después de la incubación durante al menos 2 horas, como se indica, se forman estructuras biocompósitos lineales que con el tiempo se puede observar bajo luz blanca normal microscopía o por el ojo como los cambios en la apariencia de soluciones líquidas.
La Figura 2 muestra un resultado representativo desde el descubrimiento inicial de estas estructuras lineales en completa cultivo de células o mediosVer un período de 82 horas. Nuestro laboratorio está llevando a cabo la evaluación de la toxicidad potencial de los diferentes nanomateriales, incluidos los CNP en las células normales y células cancerosas, y las células que se muestran en la Figura 2 es una de rápido crecimiento línea de células tumorales del cerebro de la ATCC (CRL-2020). Un suplemento clave para el medio completo utilizado para estas células es cistina, que resultó ser el componente esencial para el descubrimiento de por qué estas estructuras lineales se estaban formando en los cultivos (ver a continuación y sección de discusión). De una dispersión uniforme inicial de CNP que rápidamente agregada en microestructuras (Figuras 2A y 2B), con el tiempo las partículas más pequeñas se borran y agregados más grandes se forman (Figuras 2C y 2D). Por último, los agregados más grandes con estructuras lineales finas aparecen en los mismos pozos (Figuras 2E-H), formando las estructuras "erizo de" tipo previamente reportados en la literatura utilizando no biolmétodos ogical 6. Comparación de los dos últimos puntos de tiempo, en 69 y 82 hr (Figuras 2G y 2H, respectivamente), muestra que el desarrollo de las grandes estructuras de tipo erizo permanece bastante estable, como se indica por la formación de imágenes del mismo campo exacta.
Para explicar por qué se observaron estas estructuras de erizo como en estas condiciones en los cultivos celulares, empezamos a eliminar componentes de medios para determinar si los elementos esenciales podrían ser aislados. Descubrimos que un componente clave y suplemento a los medios de cultivo celular se cistina, que por el proceso de eliminación fue identificado en última instancia, como un componente esencial para el proceso de auto-ensamblaje. Al simplificar los componentes de síntesis (véase la Figura 1), podríamos en última instancia formar alta relación de aspecto (lineal) estructuras en forma líquida, que podría ser mostrado en el tiempo para transformar de forma de nanopartículas de forma lineal, sin la necesidad de las células, o cualquiera de la otra celdacomponentes de cultivo (Figuras 3A-C).
La Figura 4 muestra la caracterización de las nuevas estructuras descubiertas utilizando microscopía electrónica, incluyendo una microscopía electrónica de transmisión (TEM) de captura de imagen de nanopartículas de material de partida y la formación de nanoestructuras lineales (Figura 4A). Imágenes representativas micrografía electrónica de barrido (SEM) se muestran para material de partida CNP, estructuras lineales formados a partir de los NPs, y estructuras lineales formadas a partir de sulfato de cobre material de partida (Figuras 4B-F, respectivamente).
Para verificar que los biocomposites contenían cistina o material derivado de cistina como un componente biológico esencial de los materiales compuestos, las estructuras formadas fueron analizados utilizando EDX con microscopía SEM. Capturas de pantalla representativas de los materiales analizados se muestran en la Figura 5. Es importante destacar que, al comparar los CNP y biocomposites del CNP, un prominenteaparece pico de azufre (Figura 5b), que no está presente en el material de partida CNP (Figura 5A). Para los biocomposites utilizando sulfato de cobre como material (Figura 5C), aparecen picos de carbono y nitrógeno (Figura 5D), que es consistente con la presencia de cistina para este biocomposite de partida.
En este momento, un método para controlar la longitud y el tamaño de los materiales compuestos durante la síntesis no ha sido identificado. Sin embargo, para investigar si el tamaño promedio de las estructuras podría ser controlado después de la síntesis, biocomposites lineales se sonicaron para diferentes períodos de tiempo como se muestra en la Figura 6. Con el aumento de tiempo de sonicación, se demostró que el tamaño medio de las biocomposites lineales disminuido, según se muestra por microscopía de campo brillante (Figuras 6A-D). Como un método para concentrar y la segregación de los materiales compuestos formados, centrifugación se puede utilizar, y como se muestra en las Figuras 6E-G, Un sedimento visible puede ser desarrollado dependiendo de los volúmenes y de las fuerzas de centrifugación utilizados.
Figura 1. Diagrama de flujo Representante de diseño de la síntesis de nanopartículas de Cu PN = cobre.; Cys = cistina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Representante formación de estructuras biocompósitos cobre en cultivos de células tumorales cerebrales con medios de cultivo celular completa. Un experimento representativo rastreado durante un total de 82 hr se muestra en cultivo celular que contiene células tumorales cerebrales y CNP (50 g / ml). Los paneles A y B muestranlos pocillos de cultivo en el tiempo 0, después de CNP han depositado en el fondo del pozo. Paneles CH Mostrar puntos de tiempo posteriores a los 17, 24, 36, 49, 69 y 82 horas, respectivamente. Paneles G y H representan el mismo campo a los 69 y 82 h. Todas las imágenes se obtuvieron usando microscopía de campo claro para mejorar el contraste de material de cobre. Las barras de escala = 100 micras para A + B, de 50 micrones para CE y 25 micrones para F + G. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La transformación de los CNP a biocomposites lineales. CNPs se combinaron con cistina y agua como se indica en la Figura 1 y en la sección de protocolo con un volumen total de 7 ml. El panel A muestra el recipiente de síntesis en el tiempo 0, el panel B muestra 3 horas, y el panel C shujos de 6 horas. Las imágenes fueron obtenidas mediante microscopía de campo claro con barra de escala indicada (50 micras). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Electron caracterización microscopía de biocomposites sintetizados Panel (A):. TEM del CNP material de partida (redonda) con los compuestos lineales que forman. Los paneles (B) y (C) muestran la caracterización de los CNP de partida utilizando SEM. El panel (C) es una imagen ampliada de (B). Panel (D) muestra SEM de los materiales compuestos formados a partir de los CNP y cistina. Paneles (E) y (F) muestran SEM de las biocomposites sulfato de cobre. Grupo (F) es un Zoomeimagen d de (E). Las barras de escala se indican en todas las imágenes y = 200 nm en (A), 1 micra de (B), 500 nm en (C), 5 micras de (D), 2 micras de (E), y 1 micra de (F ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. EDX (SEM) el análisis de los materiales de partida y compuestos lineales sintetizados. Instantáneas de la pantalla del SEM muestras digitalizadas mediante el análisis EDX para el contenido elemental. El panel (A) = iniciar CNP; El panel (B) = biocomposites de CNP y cistina; El panel (C) = material de sulfato de cobre de partida, y el panel (D) = compuestos frosulfato de cobre m y cistina. Para el etiquetado de pico, C = carbono, O = oxígeno, Cu = cobre, S = azufre, y N = nitrógeno. Etiquetas más grandes para la identidad elemental se han colocado por encima de los picos principales para facilitar la visualización. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 6. Modificación de tamaño compuesto lineal y la síntesis posterior concentración. Estructuras lineales sintetizados a partir de sulfato de cobre se sometió a ultrasonidos durante 0, 15, 30, o 60 min, respectivamente, como se muestra en los paneles (AD). Las imágenes fueron obtenidas mediante microscopía de campo claro con barra de escala de 200 micras indicados en todas las imágenes. Paneles (EG), concentración de biocomposites usando centrifugación: 6 ml de estructuras lineales derivados de CNP (<strong> E, izquierda) y sulfato de cobre (E, derecha) se muestran sedimentación por gravedad después de 10 min. Con 10 minutos de centrifugación a 500 xg, un gránulo compactado se forma (panel F). Un volumen más pequeño (500 l) del mismo material se concentró como se muestra en (panel G) (estructuras derivadas-CNP se muestran en las estructuras de sulfato derivado de tubos de cobre y de izquierda en el tubo de la derecha). Haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.
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Discussion
Mientras que la evaluación de potenciales efectos tóxicos de los nanomateriales incluyendo CNP, se observó que en el largo plazo, CNP fueron transformados de una distribución de partículas más dispersa inicialmente a una forma más grande, agregada (Figura 2). En algunos casos, estas formaciones altamente agregados que se produjeron en la placa de cultivo de células, en condiciones biológicas, formaron proyecciones altamente lineales del agregado central, que recuerda cobre descrito anteriormente que contienen "erizos" 6. Cabe señalar que en las condiciones mostradas aquí, la concentración de los CNP añadió a las células fue sub-máxima, por lo tanto no matar todas las células en cultivo (véase la Figura 2). A partir de estas observaciones iniciales, los experimentos se continuaron eliminando sucesivamente más componentes de las condiciones de cultivo celular (incluyendo en última instancia las propias células) para encontrar los componentes clave restantes necesarios para la síntesis of biocomposites cobre lineales.
Descubrimos que la cistina, un componente suplementado de los cultivos celulares originales, cuando se combina con los CNP en las condiciones biológicas correctas, podría resultar en la transformación de la forma de nanopartículas en una biocomposite altamente lineal que contenía tanto el metal y componentes bioquímicos como se indica por el análisis EDX por microscopía electrónica de barrido de las muestras preparadas (Figura 5). Por lo tanto, azufre, que no está presente en el material de partida CNP, muestra un pico prominente en las biocomposites sintetizados, lo que indica que tanto cobre y componentes de la cistina material de bioquímica son esenciales para las estructuras lineales formados.
Se demostró además que mediante el uso de condiciones de síntesis similares, pero reemplazando CNPs con sulfato de cobre, también se podrían formar biocomposites altamente lineales. De hecho, la síntesis utilizando sulfato de cobre y cistina tendía a provocar "más limpio" enproductos d, en que no CNPs sin reaccionar fueron siempre presente, ya que el sulfato de cobre es completamente soluble en agua, que se utilizó como disolvente en todas las síntesis divulgados aquí. Además, biocomposites cobre-sulfato se distinguieron de compuestos derivados de CNP en la retención de un color azul que era evidentes tras la centrifugación del material.
Otros grupos han estudiado previamente los complejos de cobre-cistina y definido algunas propiedades químicas clave. Por ejemplo, Kahler et al. Demostró la formación de complejos de cobre-cistina en forma de fibras finas, que eran evidentes después del secado pero inestable en solución 13. En otros ejemplos, los estudios de complejación con L-cistina y diferentes cationes metálicos confirma la formación de complejos de cobre y cistina en un medio acuoso 14 y complejos formados pueden ser mononuclear o polinuclear, con el azufre de cistina que contribuye a la formación del complejo 15. Una serie de estudios tiene informeinteracciones ed entre cistina y cobre en sistemas biológicos. Por ejemplo, a pH fisiológico, de cobre (II) iones coordinar con histidina y cistina en plasma simulado para formar complejos 16, y aminoácidos que contienen azufre, se mostró a ser protector contra la toxicidad del cobre en polluelos 17. Por tanto, estos resultados apoyan el papel esencial de cistina en complejos con cobre material de partida en nuestros métodos de síntesis para formar biocomposites lineales.
En este momento una estrategia de síntesis aún no ha sido identificado que puede controlar directamente la longitud de biocomposites lineales individuales mostrados aquí. Sin embargo, los pasos críticos identificados en la síntesis descrita incluyen: 1) buena dispersión por sonicación de materiales de partida en el caso de la síntesis de la incorporación de los CNP; 2) el uso de recién preparada CNP, sulfato de cobre, y cistina para la síntesis eficaz de los materiales compuestos; 3) lo que permite la síntesis en el matraz permanezca inalterado en el incubato por lo menos 6 horas; y 4) evitando condiciones "sobre-reacción" en las que ramificados tipo "erizo", forma compuestos agregados.
Después de que se completó la síntesis, se demostró que la sonicación de las estructuras se puede utilizar eficazmente para disminuir el tamaño promedio (longitud) de las estructuras. La sonicación para hacer estructuras más pequeñas pueden ayudar en aplicaciones tales como la captación celular u otras interacciones-biocompósitos celular. Como se ha informado anteriormente, cargue estabilización del CNP durante esta síntesis mediante la combinación con cistina alterado el potencial zeta medido de positivo a una forma menos acusada (negativo) 9. Este cambio en la carga puede ayudar a explicar por qué los compuestos formados muestran muy poca agregación en forma seca o medios líquidos, lo que hace que el manejo de las estructuras mucho más conveniente.
Desde la síntesis informado de estas estructuras de sulfato de cobre derivado de CNP-derivados y se lleva out en medios líquidos, se anticipa que el proceso puede ser altamente escalable, lo que significa que con la proporción correcta de los componentes y las condiciones de síntesis, la receta síntesis mililitro utilizado aquí podría escalarse hacia arriba o abajo para incluir muchos cientos de mililitros o más, y que por lo tanto se espera que produzca más producto final, también. Debido al componente de metal (cobre) de estas biocomposites, es bastante sencillo para concentrar producto sintetizado por centrifugación (Figura 6). Biocomposites formados a partir de material de partida CNP retienen un color más oscuro, una vez se concentró en un gránulo, posiblemente debido a las nanopartículas de óxido de cobre sin reaccionar (Figura 6). En comparación, biocomposites sulfato de cobre cuando se concentra en un gránulo tienen un color azul, de acuerdo con las propiedades de sulfato de cobre con varios niveles de hidratación 18.
La novela síntesis descrita aquí también es escalable en el sentido de que la lin auto-ensambladoestructuras del oído escala de la nano-escala a la escala micro como se muestra mediante microscopía electrónica (Figura 4) y la luz de microscopía blanco tradicional (Figuras 3 y 6). Es interesante observar que se informaron microfibras de proteínas espiral de la bobina recientemente, de ingeniería que podrían incorporar la curcumina que permitió las fibras formadas que se observaron bajo fluorescencia iluminación 19. Estrategias similares pueden ser posible incorporar separadores o agentes de marcado en los materiales compuestos lineales reportados aquí para proporcionar la producción de estructuras y / o mejoras más grandes para las imágenes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini Vortexer | VWR (https://us.vwr.com) | 58816-121 | |
| CO2 Incubator Model # 2425-2 | VWR (https://us.vwr.com) | Contact vendor | Current model calalog # 98000-360 |
| Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge) | Labnet (http://labnetinternational.com/) | C2500-R | Model Prism R |
| Cell Culture Centrifuge Model Z323K | Labnet (http://labnetinternational.com/) | Contact vendor | Current model Z206A catalog # C0206-A |
| Sonicator (Ultrasonic Cleaner) | Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/) | 1510R-MTH | |
| Balance | Sartorius (http://dataweigh.com) | Model CP225D similar model CPA225D | |
| Olympus IX51 Inverted Light Microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Olympus DP71 microscope digital camera | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| external power supply unit - white light for Olympus microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | TH4-100 | |
| 10X, 20X, and 40X microscope objectives | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html) | model S-4800 | |
| Transmission Electron Microscope | Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html) | model Libra 120 | |
| Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco (http://envirco-hvac.com) | model PNG62675 | Used for sterile cell culture technique |
References
- Klinman, J. P. The copper-enzyme family of dopamine beta-monooxygenase and peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase: resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation. The Journal of biological chemistry. 281, 3013-3016 (2006).
- Uauy, R., Olivares, M., Gonzalez, M. Essentiality of copper in humans. The American journal of clinical nutrition. 67, 952S-959S (1998).
- Karlsson, H. L., Cronholm, P., Gustafsson, J., Copper Moller, L. oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes. Chemical research in toxicology. 21, 1726-1732 (2008).
- Parekh, G., et al. Layer-by-layer nanoencapsulation of camptothecin with improved activity. International journal of pharmaceutics. 465, 218-227 (2014).
- Harrington, M. J., Masic, A., Holten-Andersen, N., Waite, J. H., Fratzl, P. Iron-clad fibers: a metal-based biological strategy for hard flexible coatings. Science. 328, 216-220 (2010).
- Keyson, D., et al. CuO urchin-nanostructures synthesized from a domestic hydrothermal microwave method. Materials Research Bulletin. 43, 771-775 (2008).
- Liu, B., Zeng, H. C. Mesoscale organization of CuO nanoribbons: formation of 'dandelions'. J Am Chem Soc. 126, 8124-8125 (2004).
- Peng, M., et al. Controllable synthesis of self-assembled Cu2S nanostructures through a template-free polyol process for the degradation of organic pollutant under visible light. Materials Research Bulletin. 44, 1834-1841 (2009).
- Deodhar, S., Huckaby, J., Delahoussaye, M., DeCoster, M. A. High-Aspect Ratio Bio-Metallic Nanocomposites for Cellular Interactions. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 64, 012014 (2014).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12, 47-53 (2010).
- Wiogo, H. T., Lim, M., Bulmus, V., Yun, J., Amal, R. Stabilization of magnetic iron oxide nanoparticles in biological media by fetal bovine serum (FBS). Langmuir. 27, 843-850 (2011).
- Yunker, P. J., Still, T., Lohr, M. A., Yodh, A. G. Suppression of the coffee-ring effect by shape-dependent capillary interactions. Nature. 476, 308-311 (2011).
- Kahler, H., Lloyd Jr, B., Eden, M. Electron Microscopic and Other Studies on a Copper–Cystine Complex. The Journal of Physical Chemistry. 56, 768-770 (1952).
- Furia, E., Sindona, G. Complexation of L-cystine with metal cations. Journal of Chemical & Engineering Data. 55, 2985-2989 (2010).
- Hawkins, C., Perrin, D. Polynuclear Complex Formation. II. Copper (II) with Cystine and Related Ligands. Inorganic Chemistry. 2, 843-849 (1963).
- Hallman, P., Perrin, D., Watt, A. E. The computed distribution of copper (II) and zinc (II) ions among seventeen amino acids present in human blood plasma. Biochem. J. 121, 549-555 (1971).
- Jensen, L. S., Maurice, D. V. Influence of sulfur amino acids on copper toxicity in chicks. The Journal of nutrition. 109, 91-97 (1979).
- Lee, Y., Choi, J. R., Lee, K. J., Stott, N. E., Kim, D. Large-scale synthesis of copper nanoparticles by chemically controlled reduction for applications of inkjet-printed electronics. Nanotechnology. 19, 415604 (2008).
- Hume, J., et al. Engineered coiled-coil protein microfibers. Biomacromolecules. 15, 3503-3510 (2014).
