Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att syntetisera nya, höga sidoförhållande biokompositer under biologiska förhållanden och i flytande medier. De biokompositer skala från nanometer till mikrometer i diameter och längd, respektive. Kopparnanopartiklar (CNP: er) och kopparsulfat i kombination med cystin är de viktigaste komponenterna för syntes.
Abstract
Målet med detta protokoll är att beskriva syntesen av två nya biokompositer med hög bildformat strukturer. De biokompositer består av koppar och cystin, med antingen koppar nanopartiklar (CNP: er) eller kopparsulfat bidrar metallkomponenten. Syntes utförs i vätska under biologiska förhållanden (37 ° C) och själv monterade kompositer form efter 24 timmar. När bildas, dessa kompositer är mycket stabila i både vätskemedium och i en torkad form. Komposit skala från nano- till mikro varierar i längd, och från några få mikrometer till 25 nm i diameter. Fältemissionssvepelektronmikroskop med energidispersiv röntgenspektroskopi (EDX) visade att svavel var närvarande i de NP-härledda linjära strukturer, medan det var frånvarande från utgångs CNP material, vilket sålunda bekräftar cystin som källa för svavel i de slutliga nanokompositer . Under syntes av dessa linjära nano- och mikro kompositer, ett varierat utbud av längder av structures bildas i synteskärlet. Sonikering av den flytande blandningen efter syntes demonstrerades att bistå i att kontrollera medelstorlek av strukturerna genom att minska medellängden med ökad tid av sonikering. Eftersom de formade strukturerna är mycket stabila, inte agglomererar, och bildas i vätskefas, kan centrifugering också användas för att hjälpa till att koncentrera och segregerande bildade kompositer.
Protocol
1. Planering av experiment
- Bestäm volymen av koppar nanokompositer som behövs för syntes. På grundval av detta, välj ett antal små volym kolvar (25 cm 2), eller större flaskor som anges nedan vid framställning av material.
- För denna syntes använda en 37 ° C inkubator med 5% CO2 och minst 40% fuktighet. Se till att en sådan inkubator är tillgängliga och att det inte kommer att upprepade gånger störd under perioden syntes (cirka 24 timmar).
VARNING: Upprepad öppning och stängning av inkubatorn kommer säkert att leda till temperaturvariationer som kan leda till förändrad syntes av nanokomposit strukturer.
2. Beredning av material
- Förbered allt material färska innan ett experiment, genom att tillsätta fasta material mot lösningsmedel precis innan syntesen är att börja. Att hålla stamlösningar av cystin och kopparutgångsmaterial i flytande under långa tider böre experimentet rekommenderas inte och kan leda till olika resultat. Öppnad från leverantören, hålla utgångsmaterial torra genom att linda upp behållaren med Parafilm.
Obs: Följande protokoll används som ett exempel för reaktion i en 25 cm 2 cellkultur kolv med hjälp av 7 il cystin, 6643 il sterilt vatten, och 350 pl CNP: er. - Bered en 2 mg / ml lösning av kopparnanopartiklar genom att väga upp åtminstone 2 mg CNP: er. Använd engångshandskar under detta steg för att förhindra eventuell kontakt CNP: er med huden. Placera nanopartiklar i en tom steril 16 ml glasflaska.
- Till flaska innehållande CNP: er, tillsätt sterilt avjoniserat vatten i lämplig volym för att göra en 2 mg / ml lösning och skaka lösningen i 20 sekunder för att ge spridning av nanopartiklar innan syntes startar (åtminstone 1 ml total volym rekommenderas). Fyll inte flaskan mer än halvvägs med vatten eftersom detta kommer att hindra att blanda genom att vortexa. CNP: er wilJag snabbt lösa till botten av flaskan och kommer att visas en mörk färg (grått till svart).
- Sonikera CNP lösning för 17 minuter vid RT för att ge maximal spridning av CNP: er innan start av syntesen. Kontrollera regelbundet att se till att CNP: er blandar grund av ultraljudsbehandling. Efter en lyckad ultraljudsbehandling, förblir CNP: er suspenderade i lösning under minst 30 minuter och lösningen kommer att vara mörk i färgen.
- Väg upp tillräcklig massa av cystin för att göra en 72,9 mg / ml lösning för syntesen. Eftersom cystin inte är direkt löslig i vatten, placera den vägda cystin i en antistatisk vågkärlet.
- Till vägningskärl innehållande cystin, tillsätt tillräcklig volym sterilt, 1 M NaOH, så att cystin fullständigt upplöses. Exempelvis upplöses 7,29 mg cystin fullständigt i 100 pl av 1 M NaOH, för att göra en 72,9 mg / ml lösning.
- För att upprätthålla sterila förhållanden, genomföra detta steg i en steril flödesvävnadsodling huva.
VARNING: NaOHvid 1 M koncentration är frätande, så bär engångshandskar under detta steg för att förhindra kontakt koncentrerad NaOH med huden
- Att arbeta i en steril vävnadsodling huva, tillsätt 7 il cystin med 6643 | il sterilt vatten till det sterila syntes kolven först, och låt inkubera under 30 min i inkubatorn vid 37 ° C med kolven locket ventileras (i frihet) för att åstadkomma effektiv blandning. Resuspendera 2 mg / ml CNP-lösning genom att vortexa i 30 sekunder, sedan CNP: er kommer att ha fast efter sonikeringssteg.
- Tillsätt tillräckligt med CNP-lösning till syntes kolv (med användning av steril teknik) för att bibehålla följande komponentförhållanden: kombinera en delar cystin, 50 delar CNP: er, och 949 delar sterilt vatten i en 25 cm 2-cellkultur kolv för att starta syntesen. Till exempel för en 7 ml syntesvolym, kombinera 7 pl av cystin stamlösning, 350 | il av CNP: er, och 6643 | il sterilt vatten. Sätt tillbaka locket på flaskan och dra åt så att den är secure.
- Efter att kombinera alla komponenter för syntes, blanda försiktigt i kolven genom att snurra 4-5 gånger. Placera kolven i CO-2-inkubator och ventilera kolven genom att lossa locket så att det kommer att finnas gasutbyte in och ut ur kolven under syntes.
- Tillåt syntesen för att köras i inkubatorn under cirka 24 timmar. Under syntes kan man observera, med mikroskopi och med ögat, bildning av höggradigt linjära kompositer.
Obs: Processen för bildning av strukturerna kan hända plötsligt i den meningen att strukturerna är initialt svåra att upptäcka, då utseende fortsätter snabbt till en ökande densitet. Bildning kan därför ske innan 24 timmar. Processen kan också ses med blotta ögat när strukturer blir större och deras täthet ökar. Medan alstringen av strukturer kan observeras över tid under mikroskop och med ögat vid senare tidpunkter, kontinuerligt avbryta syntesbetingelserna och temperatur kommer att leda till dåligsyntesresultat. - Terminate syntes av biokompositer genom tätt capping synteskolv och lagra kärlet i kylskåp (4 ° C). Strukturer, en gång genereras, förblir stabila i denna form under minst ett år. Märk flaskan med syntesbetingelserna, inklusive komponenter som används, tidpunkten för syntesen, och inkubationstid av syntesen före terminering.
3. Syntes Använda Kopparsulfat
- Genomför självorganisering syntes genom att ersätta CNP: er med kopparsulfatsalt. Med användning av steril teknik, upplösa åtminstone 2 mg kopparsulfat i en tillräcklig volym av sterilt avjoniserat vatten till en 2 mg / ml lösning. De kopparsulfatkristaller enkelt gå i lösning vid denna koncentration, men virvel flaskan om det behövs, och kontrollera med blotta ögat att se alla kristaller löses.
- Efter framställning av kopparsulfat, utför syntes såsom beskrivits tidigare, men med ersättning av CNP: er med kopparsulfat.
Obs: Själv monterade nanokompositer använder kopparsulfat som utgångsmaterial befanns vara mycket mer konsekvent i slutlig form än för konstruktioner syntetiserade från CNP: er. - Avsluta syntesen av kopparsulfat biokompositer som för CNP kompositer (steg 2,6) och lagra dem långsiktigt vid 4 ° C.
4. Karakterisering och hantering av biokompositer Post-syntes
- Karakterisera biokompositer härrör från CNP: er och från kopparsulfat med vitt ljus mikroskopi 9 och genom elektronmikroskopi 9.
- För karakterisering och kontroll av biokompositer efter syntes av vitt ljus mikroskopi, använda ett inverterat mikroskop som kompositer kommer att avgöra till botten ytan av kolven inom några minuter om kolven platt, och kan sedan föras i fokus. Använd ljusa fältet inställningen på mikroskopet för att maximera kontrasten mellan biokompositer och det flytande mediet. Kompositer härrörande från CNP: er och copper sulfat kommer både vara klar till ogenomskinlig färg, men reagerade CNP aggregat visas mycket mörk i färgen.
- Använd en digitalkamera som är ansluten till mikroskop för att ta bilder av kompositer. En rad av längder för de enskilda strukturerna kommer att observeras.
- För karakterisering och kontroll av biokompositer efter syntes och efter lagring vid 4 ° C, tillåta flaskor att komma till rumstemperatur under minst 15 minuter som kolvar bildar kondens initialt vid avlägsnande från kylskåpet, som kommer att skymma effektiv fokusering vid utförandet av mikroskopi avbildning. Efter att jämvikt till RT, torka av topp- och bottenytorna i kolven med en ren pappershandduk för att maximera mikroskopi bildkvalitet.
- När du arbetar med eller avbildnings kompositer som har lagrats på lång sikt, virvel kolven under 30 sekunder för att dissociera klumpar av kompositer som bildar samtidigt i kylskåpet. Efter virvling inspektera strukturer med en inverterad microscope att aggregaten har dissocierade, och upprepa virvling vid behov.
- Använd inverterad vit ljusmikroskop för att bedöma effekten av syntesen för en given experiment med CNP: er. Exempelvis dokumentera närvaron eller frånvaron av oreagerad CNP: er i syntes kolvar som används för CNP-härledda biokompositer från kolvar med olika parametrar, såsom tid för syntes.
Obs: Individuell CNP: er är för liten för att följa med ett ljusmikroskop, men oreagerad CNP aggregat visas som rund form och mörka föremål, i motsats till de framgångsrikt syntetiserade CNP-kompositer som kommer att ha en hög bildförhållande, linjär form, och kommer att ha en rad olika längder. Undvik att utföra syntes alltför länge av en tid innan uppsägningen, eftersom detta kommer att resultera i hög grad grenade "urchin" typ strukturer, som är svåra att sprida i enskilda strukturer gång bildats. - Använd inverterad vit ljusmikroskop för att utvärdera effektav syntesen för ett givet experiment med användning av kopparsulfat. Eftersom kopparsulfat går helt i lösning med hjälp av detta protokoll, kommer lösningen att framstå som mindre mörk än lösningen från syntes med användning av CNP: er. Dokumentera storleken och omfattningen av kopparsulfat kompositer genom att jämföra kolvar med olika syntesbetingelser såsom tid för syntes före uppsägningen.
Obs: Framgångsrikt syntetiserade kompositer kommer att visa en mängd olika längder. Undvik att utföra syntes för alltför länge på en tid innan upphörande, eftersom detta kommer att resultera i hög grad grenade aggregat av kompositer, av vilka några kommer att vara "sjöborreliknande" i struktur, och som är svåra att dispergera i individuella strukturer gång bildats .
- För karakterisering och kontroll av biokompositer efter syntes av vitt ljus mikroskopi, använda ett inverterat mikroskop som kompositer kommer att avgöra till botten ytan av kolven inom några minuter om kolven platt, och kan sedan föras i fokus. Använd ljusa fältet inställningen på mikroskopet för att maximera kontrasten mellan biokompositer och det flytande mediet. Kompositer härrörande från CNP: er och copper sulfat kommer både vara klar till ogenomskinlig färg, men reagerade CNP aggregat visas mycket mörk i färgen.
- Att koncentrera biokompositer efter syntesen, centrifug lösningar av kompositer i ett centrifugrör. Lägg 6 ml av antingen CNP-härledda strukturer eller kopparsulfat, härledda strukturer till ett 15 ml centrifugrör. Centrifugera i 10 minvid 500 xg vid rumstemperatur för att bilda en pellet. För mindre volymer, tillsätt 500 pl strukturer i lösning till 0,6 ml stora rör. Centrifugera vid 2000 x g vid rumstemperatur under åtminstone 10 min för att bilda en pellet.
- Efter centrifugering under tillräckligt lång tid (åtminstone 10 min för microfuges), spara observerbar pellet vid botten av röret där strukturerna koncentreras genom försiktigt avlägsnande av supematantvätskan ovanför pelleten. Biokompositer strukturer som härrör från kopparsulfat visas blå i färg och struktur som härrör från CNP: er är mörkare (grått till svart).
- Lägg till fler kompositer till detta rör och upprepa processen i samma rör att koncentrera strukturer om så önskas. Att dispergera de koncentrerade pelletar, lägg den önskade volymen av lösning till röret, och vortexblanda i 10-30 sek.
- Sonikera strukturer gång bildats, för att flytta den genomsnittliga befolkningens storlek (längd) av de strukturer till lägre värden. Placera strukturer i sterilt avjoniserat vatten och sonikeras under least 10 min. Med användning av denna process, med tiden, strukturer blir fragmenterade och mindre i genomsnittlig längd (se figur 6 i texten). Dokument förändringar i komposit storlekar med olika sonication gånger med en inverterad vitt ljusmikroskop och digitalkamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar ett flödesschema som schematiskt av de syntessteg för att bilda de linjära biokompositer som beskrivs i detta arbete. CNP: er eller kopparsulfat som utgångsmaterial kombineras med sterilt vatten för att bilda en 2 mg / ml lösning, blandas denna lösning och sonikerades för att åstadkomma en jämn blandning, och denna kopparlösning blandas sedan i följande förhållande för syntes: 949 delar steril vatten: 50 delar koppar blandning: 1 del cystin stamlösning. Den faktiska volymer kan ökas eller minskas i enlighet med dessa förhållanden att skala upp eller skala ner den slutliga syntesutbyte. Efter inkubering under åtminstone 2 h såsom anges, är linjära biokompositmaterial strukturer bildas, vilka med tiden kan observeras under normalt vitt ljus mikroskopi eller genom ögat som de förändringar flytande lösning i utseende.
Figur 2 visar ett representativt resultat från den första upptäckten av dessa linjära strukturer i fullständigt cellodlingsmedia over en period av 82 h. Vårt laboratorium utförde utvärdering av den potentiella toxiciteten av olika nanomaterial, inklusive CNP: er på normala celler och cancerceller, och cellerna som visas i figur 2 är en snabbväxande hjärntumör cellinje från ATCC (CRL-2020). En viktig tillägg till den fullständigt medium som används för dessa celler är cystin, som visade sig vara den viktigaste förutsättningen till upptäckten av varför dessa linjära strukturer bildas i kulturerna (se nedan och diskussion avsnitt). Från en första jämn fördelning av CNP: er som snabbt aggregat i mikro (figurerna 2A och 2B), under tiden de mindre partiklarna bort och större aggregat bildas (figurerna 2C och 2D). Slutligen större aggregat med fina, linjära strukturer visas i samma brunnar (figur 2E-H), som bildar "Urchin" typstrukturer tidigare rapporterats i litteraturen som använder icke-Biological metoder 6. Jämförelse av de slutliga två tidpunkterna, vid 69 och 82 h (fig 2G och 2H, respektive), visar att utvecklingen av de stora sjöborre typstrukturer förblir ganska stabil, såsom indikeras genom avbildning av samma exakta fältet.
För att förklara varför dessa urchin-liknande strukturer under dessa förhållanden i cellkulturer observerades, började vi eliminera media komponenter för att avgöra om de väsentliga delarna kunde isoleras. Vi upptäckte att en nyckelkomponent och komplement till cellodlingsmedia var cystin, som genom uteslutningsmetoden slutligen identifierades som en viktig komponent för självmonteringsprocessen. Genom att förenkla synteskomponenterna (se figur 1), kunde vi slutligen bilda förhållande hög bild (linjär) strukturer i flytande form, som kan visas över tiden för att omvandla från nanopartiklar form linjär form, utan behov av celler, eller någon av den andra cellenodlingskomponenter (figurerna 3A-C).
Figur 4 visar karaktärisering av de upptäckta nya strukturer med hjälp av elektronmikroskopi, inklusive ett transmissionselektronmikroskop (TEM) bildtagande nanopartikel utgångsmaterial och formning av linjära nanostrukturer (figur 4A). Representativa svepelektronmikrofotografi (SEM) bilder visas för utgångsmaterial CNP: er, linjära strukturer som bildats från de nationella parlamenten, och linjära strukturer bildade av kopparsulfat utgångsmaterial (figurerna 4B-F, respektive).
För att kontrollera att biokompositer innehöll cystin eller cystin-härlett material som en viktig biologisk komponent i komposit, var de bildade strukturer analyseras med hjälp av EDX med SEM mikroskopi. Representativa skärmdumpar från analyserade material visas i figur 5. Viktigt när man jämför CNP: er och biokompositer från CNP: er, en framståendesvavel toppen eluerar (Figur 5B), vilket inte är närvarande i CNP utgångsmaterialet (figur 5A). För biokompositer som använder kopparsulfat som utgångsmaterial (fig 5C), kol- och kvävetoppar visas (Figur 5D), vilket överensstämmer med närvaron av cystin för denna biokompositmaterial.
Vid denna tid, har inte identifierat en metod för att styra längden och storleken av kompositer under syntes. Men för att undersöka om genomsnittliga storleken av strukturer kunde kontrolleras efter syntes gjordes linjära biokompositer sonikerades under olika tidsperioder, såsom visas i fig 6. Med ökad tid av sonikering, visades det att den genomsnittliga storleken på de linjära biokompositer minskade, såsom visas av ljusfältsmikroskopi (fig 6A-D). Som en metod för att koncentrera och segregerande bildade kompositer, kan centrifugeringen användas, och som visas i figurerna 6E-G, Kan en synlig pellet utvecklas beroende på volymer och centrifugalkraft som används.
Figur 1. Representant flödesschema för syntes utformning Cu nationella parlamentens = kopparnanopartiklar. Cys = cystin. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa bildning av koppar biokompositmaterial strukturer i hjärnan tumörcellkulturer med fullständig cellodlingsmedier. Ett representativt experiment spårade under sammanlagt 82 h visas i cellkultur innehållande hjärntumörceller och CNP: er (50 | ig / ml). Paneler A och B visarkulturbrunnarna vid tiden 0, när CNP: er har sjunkit till botten av brunnen. Paneler ch visa efterföljande tidpunkter vid 17, 24, 36, 49, 69, och 82 timmar, respektive. Paneler G och H representerar samma område vid 69 och 82 timmar. Alla bilder erhölls med användning av bright mikroskopi för att förbättra kontrast kopparmaterial. Skala barer = 100 mikron för A + B, 50 mikron för CE och 25 mikron för F + G. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Transformation av CNP: er till linjära biokompositer. CNP: er kombinerades med cystin och vatten såsom anges i fig 1 och i protokollenheten med en total volym av 7 ml. Panel A visar synteskärl vid tiden 0, visar panelen B 3 timmar, och panel C shows 6 h. Bilder erhölls med användning av bright mikroskopi med skal anges (50 mikron). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Elektronmikroskopi karakterisering av syntetiserade biokompositer Panel (A). TEM av CNP utgångsmaterial (rund) med formnings linjära kompositer. Paneler (B) och (C) visar karaktärisering av utgångs CNP: er med användning av SEM. Panel (C) är en inzoomad bild av (B). Panel (D) visar SEM av kompositer bildade av CNP: er och cystin. Paneler (E) och (F) visar SEM av kopparsulfat biokompositer. Panel (F) är en zoomed bild av (E). Skalstrecken är indikerade i alla bilder och = 200 nm i (A), en mikron i (B), 500 nm i (C), 5 mikron i (D), 2 mikron i (E), och 1 mikron (F ). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. EDX (SEM) analys av utgångsmaterial och syntetiserade linjära kompositer. Screen ögonblicksbilder av SEM skannade prover med EDX analys för elementärt innehåll. Panel (A) = start CNP: er; Panel (B) = biokompositer från CNP: er och cystin; Panel (C) = kopparsulfat utgångsmaterial, och Panel (D) = kompositer tillbakam kopparsulfat och cystin. För topp märkning, C = kol, O = syre, Cu = koppar, S = svavel och N = kväve. Större etiketter för elementärt identitet har placerats ovanför nyckel toppar för enkel visning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Modifiering av linjär komposit storlek och koncentration eftersyntes. Linjära strukturer syntetiserade från kopparsulfat sonikerades under 0, 15, 30, eller 60 minuter, respektive, såsom visas i panelerna (AD). Bilder erhölls med användning av bright mikroskopi med skala bar på 200 mikron som anges i alla bilder. Paneler (EG), koncentration av biokompositer med hjälp av centrifugering: 6 ml av linjära strukturer som härrör från CNP: er (<strong> E, vänster) och kopparsulfat (E, höger) visas sedimente under gravitation efter 10 min. Med 10 minuter centrifugering vid 500 xg, är en sammanpressad pellet bildas (panel F). En mindre volym (500 l) av samma material koncentrerades som visas i (panel G) (CNP-härledda konstruktioner visas i den vänstra röret och kopparsulfat, härrörande strukturer i rätt rör). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan utvärdera potentiella toxiska effekter av nanomaterial inklusive CNP: er, konstaterades att på lång sikt, har CNP: er förvandlats från ett initialt mer spridda partiklar distribution till en större, aggregerad form (Figur 2). I vissa fall är dessa mycket aggregerade formationer som producerats i cellodlingsskål, under biologiska förhållanden, bildas mycket linjära prognoser från den centrala aggregat, som påminner om tidigare beskrivits koppar- innehåller "sjöborrar" 6. Det bör påpekas att under de förhållanden som visas här, koncentrationen av CNP: er sattes till cellerna var sub-maximal, alltså inte döda alla celler i odling (se figur 2). Från dessa inledande observationer utfördes experiment fortsatte sedan genom att eliminera successivt flera beståndsdelar i cellodlingsförhållanden (inklusive slutändan cellerna själva) för att hitta de återstående viktiga komponenter som behövs för syntes of linjära koppar biokompositer.
Vi upptäckte att cystin, en kompletterad komponent av den ursprungliga cellkulturer, i kombination med CNP: er under rätt biologiska förhållanden, kan resultera i omvandling av nanopartikelform till en mycket linjär biokompositmaterial som innehöll både metall och biokemiska komponenter som indikeras av EDX analys genom svepelektronmikroskopi av de framställda proverna (Figur 5). Sålunda, svavel, vilket inte är närvarande i utgångs CNP material, visar en framträdande topp i de syntetiserade biokompositer, vilket indikerar att både koppar och komponenter i den biokemiska materialet cystin är väsentliga för de bildade linjära strukturer.
Det visades vidare att genom att använda liknande syntesbetingelser, men ersätta CNP: er med kopparsulfat, mycket linjära biokompositer kan också bildas. I själva verket syntes med användning av kopparsulfat och cystin tenderade att resultera i "renare" svd produkter, i det att ingen oreagerad CNP: er var ständigt närvarande, eftersom kopparsulfat är fullständigt löslig i vatten, som användes som ett lösningsmedel i alla synteserna som rapporteras här. Vidare, koppar-sulfat biokompositer utmärkte sig från CNP-härledda kompositer behålla en blå färg som var uppenbara vid centrifugering av materialet.
Andra grupper har tidigare studerat koppar cystin komplex och definieras några viktiga kemiska egenskaper. Exempelvis Kahler et al. Påvisade bildningen av koppar-cystin-komplex i form av fina fibrer, som var uppenbara vid torkning men instabil i lösning 13. I andra exempel, komplex studier med L-cystin och olika metallkatjoner bekräftar koppar och cystin komplexbildningen i ett vattenhaltigt medium 14 och bildade komplexen kan vara mononukleära eller polynukleära, med svavel från cystin bidrar till komplexbildningen 15. Ett antal studier har rapported interaktioner mellan cystin och koppar i biologiska system. Till exempel, vid fysiologiskt pH, koppar (II) joner samordna med histidin och cystin i simulerad plasma för att bilda komplex 16, och svavelinnehållande aminosyror visade sig vara skyddande mot kopparförgiftning i kycklingar 17. Dessa resultat stödjer därför den viktiga roll som cystin i komplex med kopparutgångsmaterial i våra syntesmetoder för att bilda linjära biokompositer.
Vid denna tid ännu inte har identifierat en syntesstrategi som direkt kan kontrollera längden på enskilda linjära biokompositer som visas här. Men de kritiska steg som anges i den beskrivna syntesen inkluderar: 1) god dispersion genom ultraljudsbehandling av utgångsmaterial i fråga om syntes införliva CNP: er; 2) användning av nygjord CNP: er, kopparsulfat, och cystin för effektiv syntes av kompositer; 3) att tillåta syntes i kolven att förbli ostörd i incubateller i minst 6 timmar; och 4) undviker "överreaktion" förhållanden under vilka grenade "gatubarn" -typ, aggregerade kompositer form.
Efter syntes är fullbordad, visade det sig att sonikering av strukturerna kan användas effektivt för att minska den genomsnittliga storleken (längd) av strukturerna. Sonikering för att göra mindre strukturer kan hjälpa till vid applikationer såsom cell upptag eller andra biokompositmaterial cellulära interaktioner. Som tidigare har rapporterats, ladda stabilisering av CNP: er under denna syntes genom att kombinera med cystin förändrat den uppmätta zetapotentialen från positivt till en mindre laddade (negativ) årskurs 9. Denna förändring i laddning kan hjälpa till att förklara varför de bildade komposit visar mycket liten aggregation i torkad form eller flytande form, vilket gör hanteringen av strukturerna mycket mer praktiskt.
Eftersom den rapporterade syntesen av dessa CNP-härledda och kopparsulfat-härledda konstruktioner utförs oUT i flytande medier, är det planerat att processen kan vara mycket skalbar, vilket innebär att med det korrekta förhållandet av komponenter och syntesförhållanden, milliliter syntes recept som används här kan skalas upp eller ner för att inkludera flera hundra milliliter eller mer, och skulle således förväntas ge mer slutprodukt, liksom. På grund av att metallen (koppar) komponent i dessa biokompositer, är det ganska enkelt att koncentrera syntetiserade produkten genom centrifugering (Figur 6). Biokompositer bildade av CNP utgångsmaterial behåller en mörkare färg gång koncentrerade till en pellet, möjligen på grund av oreagerade kopparoxid nanopartiklar (Figur 6). I jämförelse, kopparsulfat biokompositer när koncentrerade till en pellet har en blå färg, som överensstämmer med egenskaperna hos kopparsulfat med olika nivåer av hydrering 18.
Den nya syntesen redovisas här är också skalbar i den meningen att den själv monterade linörat strukturer skala från nanoskala till mikroskala som visas med elektronmikroskopi (Figur 4) och traditionella vitt ljusmikroskop (fig 3 och 6). Det är intressant att notera att nyligen konstruerade ringlad-spiralproteinmikro rapporterades som kan innehålla curcumin som tillåts för de bildade fibrerna som ska observeras under fluorescens belysning 19. Liknande strategier kan vara möjligt att införliva distansorgan eller märkningsmedel i linjära kompositer rapporteras här för att ge produktion av större strukturer och / eller förbättringar för avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini Vortexer | VWR (https://us.vwr.com) | 58816-121 | |
| CO2 Incubator Model # 2425-2 | VWR (https://us.vwr.com) | Contact vendor | Current model calalog # 98000-360 |
| Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge) | Labnet (http://labnetinternational.com/) | C2500-R | Model Prism R |
| Cell Culture Centrifuge Model Z323K | Labnet (http://labnetinternational.com/) | Contact vendor | Current model Z206A catalog # C0206-A |
| Sonicator (Ultrasonic Cleaner) | Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/) | 1510R-MTH | |
| Balance | Sartorius (http://dataweigh.com) | Model CP225D similar model CPA225D | |
| Olympus IX51 Inverted Light Microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Olympus DP71 microscope digital camera | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| external power supply unit - white light for Olympus microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | TH4-100 | |
| 10X, 20X, and 40X microscope objectives | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html) | model S-4800 | |
| Transmission Electron Microscope | Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html) | model Libra 120 | |
| Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco (http://envirco-hvac.com) | model PNG62675 | Used for sterile cell culture technique |
References
- Klinman, J. P. The copper-enzyme family of dopamine beta-monooxygenase and peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase: resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation. The Journal of biological chemistry. 281, 3013-3016 (2006).
- Uauy, R., Olivares, M., Gonzalez, M. Essentiality of copper in humans. The American journal of clinical nutrition. 67, 952S-959S (1998).
- Karlsson, H. L., Cronholm, P., Gustafsson, J., Copper Moller, L. oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes. Chemical research in toxicology. 21, 1726-1732 (2008).
- Parekh, G., et al. Layer-by-layer nanoencapsulation of camptothecin with improved activity. International journal of pharmaceutics. 465, 218-227 (2014).
- Harrington, M. J., Masic, A., Holten-Andersen, N., Waite, J. H., Fratzl, P. Iron-clad fibers: a metal-based biological strategy for hard flexible coatings. Science. 328, 216-220 (2010).
- Keyson, D., et al. CuO urchin-nanostructures synthesized from a domestic hydrothermal microwave method. Materials Research Bulletin. 43, 771-775 (2008).
- Liu, B., Zeng, H. C. Mesoscale organization of CuO nanoribbons: formation of 'dandelions'. J Am Chem Soc. 126, 8124-8125 (2004).
- Peng, M., et al. Controllable synthesis of self-assembled Cu2S nanostructures through a template-free polyol process for the degradation of organic pollutant under visible light. Materials Research Bulletin. 44, 1834-1841 (2009).
- Deodhar, S., Huckaby, J., Delahoussaye, M., DeCoster, M. A. High-Aspect Ratio Bio-Metallic Nanocomposites for Cellular Interactions. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 64, 012014 (2014).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12, 47-53 (2010).
- Wiogo, H. T., Lim, M., Bulmus, V., Yun, J., Amal, R. Stabilization of magnetic iron oxide nanoparticles in biological media by fetal bovine serum (FBS). Langmuir. 27, 843-850 (2011).
- Yunker, P. J., Still, T., Lohr, M. A., Yodh, A. G. Suppression of the coffee-ring effect by shape-dependent capillary interactions. Nature. 476, 308-311 (2011).
- Kahler, H., Lloyd Jr, B., Eden, M. Electron Microscopic and Other Studies on a Copper–Cystine Complex. The Journal of Physical Chemistry. 56, 768-770 (1952).
- Furia, E., Sindona, G. Complexation of L-cystine with metal cations. Journal of Chemical & Engineering Data. 55, 2985-2989 (2010).
- Hawkins, C., Perrin, D. Polynuclear Complex Formation. II. Copper (II) with Cystine and Related Ligands. Inorganic Chemistry. 2, 843-849 (1963).
- Hallman, P., Perrin, D., Watt, A. E. The computed distribution of copper (II) and zinc (II) ions among seventeen amino acids present in human blood plasma. Biochem. J. 121, 549-555 (1971).
- Jensen, L. S., Maurice, D. V. Influence of sulfur amino acids on copper toxicity in chicks. The Journal of nutrition. 109, 91-97 (1979).
- Lee, Y., Choi, J. R., Lee, K. J., Stott, N. E., Kim, D. Large-scale synthesis of copper nanoparticles by chemically controlled reduction for applications of inkjet-printed electronics. Nanotechnology. 19, 415604 (2008).
- Hume, J., et al. Engineered coiled-coil protein microfibers. Biomacromolecules. 15, 3503-3510 (2014).
