Summary
Aqui apresentamos um protocolo para sintetizar novos, de alta relação de aspecto biocompósitos condições biológicas e em meio líquido. Os biocompósitos escala de nanómetros a micrómetros de diâmetro e de comprimento, respectivamente. Nanopartículas de cobre (CNPS) e sulfato de cobre combinados com a cistina são os componentes chave para a síntese.
Abstract
O objetivo deste protocolo é descrever a síntese de duas novas biocompósitos com estruturas de relação de aspecto de alta. Os biocompósitos composto de cobre e cistina, quer com nanopartículas de cobre (CNPS) ou sulfato de cobre contribuindo o componente metálico. A síntese é levada a cabo no estado líquido sob condições biológicas (37 ° C) e sob a forma de compósitos auto-montada após 24 h. Uma vez formados, estes compostos são altamente estáveis em ambos os meios líquidos e em uma forma seca. Os compósitos escala nano a partir do micro- gama de comprimento, e de alguns microns a 25 nm de diâmetro. A microscopia electrónica de varrimento com emissão de campo espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDX), demonstrou que o enxofre estava presente nas estruturas lineares NP-derivados, que não foi encontrada a partir do material de partida CNP, confirmando assim cistina como a fonte de enxofre nos nanocompósitos finais . Durante a síntese destes nano e micro-compósitos lineares, uma variada gama de comprimentos de structures é formada no reactor de síntese. A sonicação da mistura líquida após a síntese foi demonstrado para ajudar a controlar a dimensão média das estruturas, diminuindo a duração média com o aumento do tempo de sonicação. Uma vez que as estruturas formadas são altamente estáveis, não se aglomeram, e são formadas na fase líquida, centrifugação, também podem ser utilizados para auxiliar na concentração e segregar compósitos formados.
Protocol
1. Planejamento de Experimentos
- Determinar o volume de nanocompósitos de cobre necessário para a síntese. Nessa base, escolha um número de frascos de pequeno volume (25 cm2), ou frascos maiores, como indicado a seguir na preparação de materiais.
- Para esta síntese, utilizar uma temperatura de 37 ° C incubadora com 5% de CO 2 e, pelo menos, 40% de humidade. Assegure-se que uma tal incubadora está disponível e que não será perturbado repetidamente ao longo do período de síntese (aproximadamente 24 horas).
CUIDADO: abertura e fecho repetido da incubadora certamente irá causar flutuações de temperatura que podem resultar na síntese de alteração das estruturas nanocompósito.
2. Preparação de Materiais
- Prepare todos os materiais frescos antes do início de uma experiência, através da adição de materiais sólidos para solventes direita antes da síntese é para começar. Manter as soluções concentradas de cistina e cobre materiais de partida em líquido por longos vezes bntes a experiência não é recomendado e pode levar a resultados variáveis. Uma vez aberta a partir do fornecedor, continuo materiais secos envolvendo a parte superior do recipiente com Parafilm partida.
Nota: O protocolo seguinte é utilizado como um exemplo para a reacção, em 25 cm2 de frasco de cultura de células utilizando 7 ul de cistina, 6643 uL de água estéril, e 350 ul de CNPs. - Prepare a / ml solução 2 mg de nanopartículas de cobre pesando, pelo menos, 2 mg de CNPs. Usar luvas descartáveis, durante este passo para evitar possível contato de CNPs com a pele. Coloque as nanopartículas em um frasco vazio estéril 16 ml de vidro.
- Para o frasco contendo CNPs, adicionar água desionizada estéril no volume apropriado para produzir uma solução 2 mg / ml e a solução vortex durante 20 segundos para proporcionar dispersão das nanopartículas, antes do início de síntese (pelo menos 1 ml de volume total é recomendado). Não encha o mais de meio caminho frasco com água, pois isso irá inibir a mistura em vórtice. CNPs will rapidamente se depositar no fundo do frasco e aparece de cor escura (cinza ao preto).
- Sonicar a solução CNP por 17 minutos à temperatura ambiente para proporcionar dispersão máxima de CNPs antes do início da síntese. Verifique periodicamente para se certificar de que CNPs estão misturando devido a sonicação. Após uma sonicação bem sucedida, CNPs permanecem suspensas na solução durante pelo menos 30 min e a solução será de cor escura.
- Pesar massa suficiente de cistina para produzir uma solução / ml 72,9 mg para a síntese. Desde cistina não é diretamente solúvel em água, coloque o cistina pesava um recipiente de pesagem antiestática.
- Para a pesagem recipiente que contém cistina, adicionar um volume suficiente de NaOH 1 M estéril, de modo que a cistina dissolve-se completamente. Por exemplo, dissolve-se 7,29 mg de cistina completamente em 100 ul de NaOH 1 M, para fazer um / ml de solução 72,9 mg.
- Para manter condições estéreis, realizar esta etapa em um tecido fluxo cultura capô estéril.
CUIDADO: NaOHem 1 M concentração é cáustico, por isso use luvas descartáveis, durante este passo para evitar o contato da pele com NaOH concentrado
- Trabalhando numa cultura de tecidos hote estéril, adicionar 7 ul de cistina com 6643 uL de água estéril para a síntese balão estéril em primeiro lugar, e deixar incubar durante 30 minutos na incubadora a 37 ° C, com a tampa do frasco ventilado (solta) para fornecer eficaz de mistura. Ressuspender o CNP solução de 2 mg / ml em vortex durante 30 segundos, uma vez que terá CNPs liquidados após o passo de sonicação.
- Adicionar solução CNP no balão de síntese (utilizando uma técnica estéril) para manter as proporções dos componentes seguintes: combinar uma partes cistina, 50 partes CNPS, e 949 partes de água estéril num frasco de cultura de célula de 25 2 cm, para iniciar a síntese. Por exemplo, para um volume de 7 ml de síntese, combinar 7 uL da solução de cistina, 350 ul de CNPs, e 6,643 mL de água estéril. Substituir a tampa no frasco de apertar e de modo que é secure.
- Depois de combinar todos os componentes para a síntese, misture delicadamente no frasco agitando 4-5 vezes. Colocar o balão na incubadora de CO 2 e ventilar o frasco, desapertando o tampão de modo que não haverá permuta de gás dentro e para fora do frasco durante a síntese.
- Permitir síntese para executar na incubadora por aproximadamente 24 horas. Durante a síntese, pode-se observar, com microscopia e por olho, formação de compósitos altamente lineares.
Nota: O processo de formação das estruturas pode acontecer de repente no sentido em que as estruturas são inicialmente difícil de detectar, em seguida, aparência procede rapidamente a uma densidade crescente. A formação pode, portanto, ocorrer antes de 24 horas. O processo também pode ser observada a olho nu uma vez que as estruturas se tornam maiores e os seus aumentos de densidade. Embora a geração de estruturas pode ser observado ao longo do tempo sob o microscópio e pelo olho em pontos de tempo posteriores, interrompendo continuamente as condições de síntese e temperatura irá levar a um mauresultados de síntese. - Terminar a síntese de biocompósitos por firmemente o balão de síntese de nivelamento e de armazenar o recipiente no frigorífico (4 ° C). Estruturas, uma vez gerados, permanecer estável nesta forma durante pelo menos um ano. Rotular o frasco com condições de síntese, incluindo componentes utilizados, a data de síntese, e o tempo de incubação da síntese antes da terminação.
3. Síntese Usando sulfato de cobre
- Realizar a síntese de auto-montagem, substituindo CNPs com sal sulfato de cobre. Utilizando uma técnica estéril, dissolver, pelo menos, 2 mg de sulfato de cobre em um volume suficiente de água desionizada estéril para fazer uma solução / ml 2 mg. Os cristais de sulfato de cobre ir facilmente em solução a esta concentração, mas vortex do frasco, se necessário, e inspeccionar por olho para assegurar que todos os cristais são dissolvidos.
- Após a preparação do sulfato de cobre, realizar a síntese como descrito anteriormente, mas substituindo CNPs com o sulfato de cobre.
Nota: nanocompósitos auto-montadas usando sulfato de cobre como um material de partida, verificou-se ser muito mais consistente na forma final do que para estruturas sintetizadas a partir CNPs. - Terminar a síntese de biocompósitos sulfato de cobre como para os compósitos CNP (passo 2.6) e armazená-las a longo prazo, a 4 ° C.
4. Caracterização e Manuseio de Biocompósitos Pós-síntese
- Caracterizar biocompósitos derivados de CNPs e de sulfato de cobre por microscopia de luz branca 9 e por microscopia eletrônica de 9.
- Para a caracterização e inspecção de biocompósitos pós-síntese por microscopia de luz branca, usar um microscópio invertido, como compósitos vai assentar a superfície inferior do balão dentro de poucos minutos após a postura do balão plana, e, em seguida, pode ser trazida para o foco. Utilize a definição de campo claro no microscópio para maximizar o contraste entre biocompósitos e o meio líquido. Composites derivados de CNPs e policialpor sulfato serão ambos parece claro a opaco na cor, mas agregados CNP não reagiram aparece muito escuro na cor.
- Use uma câmera digital conectada ao microscópio para capturar imagens dos compósitos. Uma gama de comprimentos para as estruturas individuais serão observadas.
- Para a caracterização e inspecção de biocompósitos pós-síntese e depois da armazenagem a 4 ° C, para permitir frascos vir até à temperatura ambiente durante pelo menos 15 minutos como tubos vai formar condensação inicialmente após a remoção do frigorífico, o que irá obscurecer eficaz de focagem durante a realização de microscopia de imagem. Depois de permitir o equilíbrio à temperatura ambiente, limpar as superfícies de topo e de fundo do balão com uma toalha de papel limpa para maximizar a qualidade de imagem de microscopia.
- Ao trabalhar com ou de imagem compósitos que foram armazenados a longo prazo, vortex o frasco durante 30 segundos para dissociar aglomerados de compósitos que formam enquanto na geladeira. Depois de vórtex, inspecionar as estruturas com um microfone invertidoroscope para assegurar que os agregados foram dissociadas, e repetir vórtice, conforme necessário.
- Use microscopia de luz branca invertida para avaliar a eficácia da síntese para uma dada experiência utilizando CNPs. Por exemplo, documentar a presença ou ausência de que não reagiu CNPs em frascos de síntese utilizados para biocompósitos CNP-derivadas a partir de frascos com diferentes parâmetros tais como o tempo de síntese.
Nota: Pessoa CNPs são demasiado pequenos para observar com um microscópio de luz, mas que não reagiu CNP agregados aparece como-forma redonda e objectos escuras, em contraste com os CNP-compósitos sintetizados com sucesso, que terá uma relação de aspecto elevada, forma linear, e terá uma gama de diferentes comprimentos. Evitar a realização de síntese para demasiado longo de um período de tempo antes da rescisão, como isso irá resultar em muito ramificados estruturas do tipo "urchin", que são difíceis de dispersar em estruturas individuais, uma vez formados. - Use microscopia de luz branca invertida para avaliar a eficáciada síntese para um dado experimento usando sulfato de cobre. Desde sulfato de cobre vai plenamente em solução usando este protocolo, a solução aparece menos escura do que a solução de síntese usando CNPs. Documentar o tamanho ea extensão de compósitos de sulfato de cobre, comparando frascos com diferentes condições de síntese, tais como o tempo de síntese antes da rescisão.
Nota: compostos sintetizados com sucesso vai mostrar uma gama de diferentes comprimentos. Evitar a realização de síntese para demasiado longo de um período de tempo antes da rescisão, como isso irá resultar em agregados altamente ramificados de compósitos, alguns dos quais serão "ouriço-like" na estrutura, e que são difíceis de dispersar em estruturas individuais, uma vez formados .
- Para a caracterização e inspecção de biocompósitos pós-síntese por microscopia de luz branca, usar um microscópio invertido, como compósitos vai assentar a superfície inferior do balão dentro de poucos minutos após a postura do balão plana, e, em seguida, pode ser trazida para o foco. Utilize a definição de campo claro no microscópio para maximizar o contraste entre biocompósitos e o meio líquido. Composites derivados de CNPs e policialpor sulfato serão ambos parece claro a opaco na cor, mas agregados CNP não reagiram aparece muito escuro na cor.
- Para concentrar biocompósitos pós-síntese, as soluções de compostos de centrifugação num tubo de centrífuga. Adicionar 6 mL quer de estruturas derivadas do CNP ou estruturas derivadas de sulfato de cobre para um tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar durante 10 mina 500 xg à temperatura ambiente para formar um pelete. Para volumes menores, adicione 500 mL de estruturas em solução a 0,6 ml tubos porte. Centrifugar a 2000 xg à temperatura ambiente durante pelo menos 10 minutos para formar uma pelete.
- Após centrifugação durante tempo suficiente (pelo menos 10 min para microfuges), guardar o sedimento observável na parte inferior do tubo, onde as estruturas são concentrados por remoção cuidadosa do líquido sobrenadante acima da pelete. Estruturas biocomposite derivados de sulfato de cobre aparecem na cor azul e estruturas derivadas CNPs são mais escuras (cinza ao preto).
- Adicionar mais compósitos para este tubo e repetir o processo no mesmo tubo para concentrar estruturas se desejado. Para dispersar os peletes concentradas, adicionar o volume desejado de solução para o tubo, e vortex durante 10-30 seg.
- Sonicar estruturas, uma vez formada, para mover o tamanho da população média (comprimento) das estruturas para valores mais baixos. Estruturas coloque em água deionizada estéril e sonicate por pelo least 10 min. Usando este processo, ao longo do tempo, as estruturas tornam-se fragmentado e menor no comprimento médio (ver figura 6 do texto). Alterações do documento em tamanhos compósitos com diferentes tempos de sonicação utilizando um microscópio invertido luz branca e câmera digital.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 1 mostra um fluxograma esquemático dos passos de síntese, para formar os biocompósitos lineares descritas neste trabalho. CNPs ou sulfato de cobre como materiais de partida são combinados com água esterilizada para formar uma solução / ml 2 mg, esta solução é misturada e sonicada para fornecer uma mistura uniforme, e esta solução de cobre é, em seguida, misturados na seguinte proporção para a síntese de: 949 partes estéril água: 50 partes de mistura de cobre: 1 parte de solução de estoque cistina. Os volumes reais podem ser aumentadas ou diminuídas de acordo com estes rácios para aumentar ou reduzir para baixo o rendimento síntese final. Após incubação durante pelo menos 2 horas, tal como indicado, estruturas biocomposite lineares são formados ao longo do tempo que pode ser observada por microscopia de luz branca normal ou por olho como as alterações na aparência solução líquida.
A Figura 2 mostra um resultado representativo da descoberta inicial destas estruturas lineares em meios de cultura celular completo oVer um período de 82 horas. Nosso laboratório estava realizando avaliação da toxicidade potencial de diferentes nanomateriais, incluindo CNPs em células e células cancerosas normal, e as células mostrado na Figura 2 são uma linha de rápido crescimento de células tumorais do cérebro a partir de ATCC (CRL-2020). Um suplemento de chave para o meio completo utilizado para estas células é cistina, que acabou por ser o componente essencial para a descoberta do motivo pelo qual estas estruturas lineares foram formando nas culturas (ver a seguir e na secção de discussão). A partir de uma dispersão uniforme inicial de CNPs que rapidamente agregado em microestruturas (Figuras 2A e 2B), ao longo do tempo que as partículas mais pequenas são apagadas e agregados maiores são formados (Figuras 2C e 2D). Finalmente, os agregados maiores, com estruturas finas, lineares aparecem nas mesmas cavidades (Figuras 2E-H), formando os "ouriço-do-estruturas do tipo" previamente relatados na literatura usando não-biolmétodos ogical 6. A comparação dos dois pontos finais de tempo, a 69 e 82 horas (figuras 2G e 2H, respectivamente), mostra que o desenvolvimento das grandes estruturas do tipo de ouriço-do-permanece bastante estável, como indicado pela imagem da mesma área exacta.
Para explicar por que foram observadas essas estruturas do diabrete-like sob estas condições em culturas de células, começamos a eliminar componentes de mídia para determinar se os elementos essenciais poderia ser isolado. Descobrimos que um componente essencial e um suplemento para o meio de cultura celular foi cistina, que pelo processo de eliminação foi finalmente identificada como um componente essencial para o processo de auto-montagem. Ao simplificar os componentes de síntese (ver Figura 1), que em última análise, poderia formar-razão de aspecto elevada (linear) estruturas no estado líquido, que pode ser mostrado ao longo do tempo para transformar de uma forma de nanopartículas de forma linear, sem a necessidade de células, ou qualquer de a outra célulacomponentes de cultura (Figuras 3A-C).
A Figura 4 mostra a caracterização das estruturas novas descobertas utilizando microscopia electrónica, incluindo uma imagem de microscopia electrónica de transmissão (TEM) de nanopartículas capturar material de partida ea formação de nanoestruturas lineares (Figura 4A). Representante micrografia electrónica por varrimento (SEM) As imagens são mostradas para material de partida CNPs, estruturas lineares formados a partir das nanopartículas, e estruturas lineares formados a partir de sulfato de cobre a partir de material (Figuras 4B-F, respectivamente).
Para verificar que os biocompósitos continha cistina ou material derivado de cistina como componente essencial biológica dos compostos, as estruturas formadas foram analisados usando EDX com microscopia SEM. Tiros écran representativo de materiais analisados são mostrados na Figura 5. É importante notar, quando comparando CNPs e biocompósitos do CNPs, um proeminenteaparece pico de enxofre (Figura 5B), que não está presente no material de partida CNP (Figura 5A). Para os biocompósitos usando sulfato de cobre como material (Figura 5C), picos de carbono e de azoto aparecer (Figura 5D), o que é consistente com a presença de cistina para este biocomposite de partida.
Neste momento, um método para controlar o comprimento e o tamanho dos compostos durante a síntese, não foi identificado. No entanto, para investigar se o tamanho médio das estruturas poderia ser controlados após a síntese, biocompósitos lineares foram sonicadas durante diferentes períodos de tempo, como mostrado na Figura 6. Com o aumento do tempo de sonicação, foi demonstrado que o tamanho médio dos biocompósitos lineares diminuído, conforme demonstrado por microscopia de campo brilhante (Figuras 6A-D). Como um método para concentrar e segregar compósitos formados, a centrifugação pode ser utilizado, e como mostrado nas Figuras 6E-G, Um sedimento visível pode ser desenvolvido, dependendo dos volumes e forças de centrifugação usadas.
Figura 1. fluxograma Representante do projeto síntese Cu PN = nanopartículas de cobre.; Cys = cistina. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. formação de estruturas representativas biocomposite cobre em culturas de células cerebrais de tumor com meios de cultura de célula completa. Uma experiência representativa rastreado ao longo de um total de 82 horas é mostrada na cultura de células contendo células de tumor cerebral e CNPs (50 ug / mL). Os painéis A e B mostramos poços de cultura no tempo 0, depois CNPs tenham assentado no fundo do poço. Painéis CH mostrar pontos subseqüentes em 17, 24, 36, 49, 69 e 82 horas, respectivamente. Painéis G e H representam o mesmo campo em 69 e 82 h. Todas as imagens foram obtidas utilizando microscopia de campo claro para melhorar o contraste de material de cobre. Barras de escala = 100 mícrons para A + B, 50 mícrons para CE e 25 mícrons para F + G. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Transformação de CNPs para biocompósitos lineares. CNPs foram combinadas com cistina e água como indicado na Figura 1 e na secção de protocolo com um volume total de 7 ml. O painel A mostra o vaso de síntese no momento 0, o painel B mostra 3 h, e o painel C shOWS 6 horas. As imagens foram obtidas por microscopia de campo claro com barra de escala indicada (50 microns). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Electron caracterização microscopia de biocompósitos sintetizados painel (A):. TEM de CNP material de partida (redondo) com os compostos lineares formando. Os painéis (B) e (C) mostram a caracterização de CNPs partida utilizando SEM. Painel (C) é uma imagem ampliada de (B). Painel (D) mostra SEM de compósitos formados a partir de CNPs e cistina. Painéis (E) e (F) mostram SEMs dos biocompósitos de sulfato de cobre. O painel (F) é um Zoomed imagem de (E). As barras de escala são indicados em todas as imagens e = 200 nm, em (A), de 1 mícron em (B), 500 nm, em (C), 5 mícrons de (D), 2 mícrons de (E), e 1 micron de (F ). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura EDX (MEV) 5. De materiais de partida e compostos lineares sintetizados. Instantâneos de tela de SEM amostras examinadas através da análise de EDX para o conteúdo elementar. Painel (A) = começando CNPs; Painel (B) = biocompósitos de CNPs e cistina; Painel (C) = material de sulfato de cobre de partida, e do painel (D) = compósitos from sulfato de cobre e cistina. Para pico rotulagem, C = carbono, O = oxigénio, Cu = cobre, S = enxofre, e N = azoto. Etiquetas maiores para identidade elementar foram colocados acima dos picos principais para facilitar a visualização. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. A modificação do tamanho composto linear e síntese de pós concentração. Estruturas lineares sintetizados a partir de sulfato de cobre foram sonicadas durante 0, 15, 30, ou 60 minutos, respectivamente, como se mostra nos painéis (AD). As imagens foram obtidas utilizando microscopia de campo claro com barra de escala de 200 microns indicados em todas as imagens. Painéis (por exemplo), a concentração de biocompósitos usando centrifugação: 6 ml de estruturas lineares derivados de CNPs (<forte> E, esquerda) e sulfato de cobre (E, à direita) são mostradas sedimentação por gravidade depois de 10 min. Com 10 minutos de centrifugação a 500 xg, um pelete é formado compactado (painel F). Um volume mais pequeno (500 ul) de o mesmo material foi concentrado, como mostrado em (painel G) (CNP-estruturas derivadas são mostrados nas estruturas derivadas de sulfato de tubos de cobre e de esquerda do tubo para a direita). Por favor clique aqui para ver um maior versão desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ao avaliar os potenciais efeitos tóxicos de nanomateriais incluindo CNPs, observou-se que, a longo prazo, CNPs foram transformados a partir de uma distribuição de partículas mais inicialmente dispersa para uma forma maior, agregados (Figura 2). Em alguns casos, essas formações altamente agregados que foram produzidos na placa de cultura de células, sob condições biológicas, formado projeções altamente linear a partir do centro de agregado, que relembram a cobre anteriormente descrito contendo "ouriços" 6. Deve salientar-se que, sob as condições aqui descritas, a concentração de CNPs adicionado às células foi sub-máxima, assim, não matar todas as células em cultura (ver Figura 2). A partir destas observações iniciais, os experimentos foram então continuou eliminando sucessivamente mais componentes das condições de cultura de células (incluindo, finalmente, as próprias células) para encontrar os principais componentes restantes necessários para a síntese de of biocompósitos cobre lineares.
Descobrimos que a cistina, um componente suplementado das culturas de células originais, quando combinado com CNPs sob as condições biológicas correctas, pode resultar na transformação da forma de nanopartículas num biocomposite altamente linear que continha ambos os componentes de metal e bioquímicos, tal como indicado por análise EDX microscopia eletrônica de varredura das amostras preparadas (Figura 5). Assim, de enxofre, que não está presente no material de partida CNP, mostra um pico proeminente nas biocompósitos sintetizados, o que indica que ambos os componentes de cobre e o material de cistina bioquímica são essenciais para as estruturas lineares formados.
Foi ainda demonstrado que, utilizando as condições de síntese semelhantes, mas substituindo CNPs com sulfato de cobre, biocompósitos altamente lineares pode também ser formada. De facto, a síntese usando sulfato de cobre e cistina tendiam a resultar em "mais limpo" end produtos, em que nenhum CNPs que não reagiu foram sempre presente, uma vez que o sulfato de cobre é totalmente solúvel em água, o qual foi utilizado como um solvente, em todas as sínteses aqui apresentados. Além disso, biocompósitos cobre-sulfato distingue-se dos compósitos CNP-derivados na retenção de uma cor azul que foi aparente após a centrifugação do material.
Outros grupos já estudados complexos de cobre-cistina e definidas algumas propriedades químicas fundamentais. Por exemplo, Kahler et ai. Demonstrou a formação de complexos de cobre-cistina, sob a forma de fibras finas, que eram evidentes após a secagem, mas instável na solução 13. Em outros exemplos, os estudos de complexação com L-cistina e diferentes catiões metálicos confirma a formação de complexo de cobre e cistina em um meio aquoso 14 e complexos formados podem ser mononucleares ou polinucleares, com o enxofre da cisteína contribui para a formação do complexo 15. Uma série de estudos tem relatórioed interacções entre cistina e cobre em sistemas biológicos. Por exemplo, a pH fisiológico, de cobre (II), iões coordenada com histidina e cisteína no plasma simulado para formar complexos de 16, e de enxofre contendo aminoácidos demonstraram ser de protecção contra a toxicidade do cobre em pintos de 17. Estes achados apoiam o papel essencial deste modo de cistina na complexação com cobre material de partida nos métodos de síntese para a formação de biocompósitos lineares.
Neste momento, uma estratégia de síntese que ainda não foi identificado que pode controlar directamente o comprimento de biocompósitos lineares individuais aqui mostrados. No entanto, os passos críticos identificados na síntese descritos incluem: 1) uma boa dispersão por ultra-sons de materiais de partida, no caso da síntese incorporando CNPs; 2) uso de recém-preparado CNPs, sulfato de cobre, e cistina para a síntese eficaz de compósitos; 3) que permite a síntese no balão para permanecer intacta no incubatou durante pelo menos 6 horas; e 4) evitando condições "reação exagerada", em que ramificada do tipo "ouriço", forma compósitos agregados.
Após a síntese está concluída, mostrou-se que as estruturas de sonicação pode ser utilizada de forma eficaz para diminuir o tamanho médio (comprimento) das estruturas. Sonicando para fazer estruturas menores pode ajudar em aplicações tais como a absorção celular ou outras interações biocomposite-celular. Como tem sido relatado anteriormente, cobrar estabilização da CNPs durante esta síntese, combinando com a cistina alterou o potencial zeta medida de positivo para uma forma menos cobrado (negativo) 9. Esta alteração na carga pode ajudar a explicar por que os compósitos formados mostram muito pouca agregação sob a forma seca ou meios líquidos, o que torna a manipulação das estruturas muito mais conveniente.
Uma vez que a síntese relatados destas estruturas derivadas de sulfato de cobre CNP-derivados e é realizado out em meio líquido, prevê-se que o processo pode ser altamente flexível, o que significa que com a razão correcta de componentes e as condições de síntese, a receita síntese mililitro usado aqui pode ser escalada para cima ou para baixo para incluir muitas centenas de mililitros ou mais, e seria, portanto, espera-se obter mais produto final, bem como. Devido ao componente de metal (cobre) destes biocompósitos, é bastante simples para concentrar o produto sintetizado por centrifugação (Figura 6). Biocompósitos formadas a partir de material de partida CNP reter uma cor mais escura, uma vez concentrada a um sedimento, possivelmente devido a nanopartículas de óxido de cobre que não reagiram (Figura 6). Em comparação, sulfato de cobre biocompósitos quando concentrados numa pelete tem uma cor azul, consistente com as propriedades de sulfato de cobre com vários níveis de hidratação 18.
A nova síntese relatados aqui também é escalonável no sentido de que a lin auto-montadosestruturas da orelha escala da escala nano à micro-escala como mostrado por microscopia eletrônica (Figura 4) e microscopia de luz branca tradicional (Figuras 3 e 6). É interessante notar que as microfibras de proteínas em espiral enrolada recentemente, foram manipulados relatado que poderiam incorporar o que permitiu a curcumina para as fibras formadas para ser observada sob iluminação fluorescente 19. Estratégias similares podem ser possível incorporar espaçadores ou agentes de marcação para os compostos lineares aqui relatados para proporcionar a produção de estruturas e / ou melhorias maiores para imagiologia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini Vortexer | VWR (https://us.vwr.com) | 58816-121 | |
| CO2 Incubator Model # 2425-2 | VWR (https://us.vwr.com) | Contact vendor | Current model calalog # 98000-360 |
| Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge) | Labnet (http://labnetinternational.com/) | C2500-R | Model Prism R |
| Cell Culture Centrifuge Model Z323K | Labnet (http://labnetinternational.com/) | Contact vendor | Current model Z206A catalog # C0206-A |
| Sonicator (Ultrasonic Cleaner) | Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/) | 1510R-MTH | |
| Balance | Sartorius (http://dataweigh.com) | Model CP225D similar model CPA225D | |
| Olympus IX51 Inverted Light Microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Olympus DP71 microscope digital camera | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| external power supply unit - white light for Olympus microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | TH4-100 | |
| 10X, 20X, and 40X microscope objectives | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html) | model S-4800 | |
| Transmission Electron Microscope | Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html) | model Libra 120 | |
| Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco (http://envirco-hvac.com) | model PNG62675 | Used for sterile cell culture technique |
References
- Klinman, J. P. The copper-enzyme family of dopamine beta-monooxygenase and peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase: resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation. The Journal of biological chemistry. 281, 3013-3016 (2006).
- Uauy, R., Olivares, M., Gonzalez, M. Essentiality of copper in humans. The American journal of clinical nutrition. 67, 952S-959S (1998).
- Karlsson, H. L., Cronholm, P., Gustafsson, J., Copper Moller, L. oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes. Chemical research in toxicology. 21, 1726-1732 (2008).
- Parekh, G., et al. Layer-by-layer nanoencapsulation of camptothecin with improved activity. International journal of pharmaceutics. 465, 218-227 (2014).
- Harrington, M. J., Masic, A., Holten-Andersen, N., Waite, J. H., Fratzl, P. Iron-clad fibers: a metal-based biological strategy for hard flexible coatings. Science. 328, 216-220 (2010).
- Keyson, D., et al. CuO urchin-nanostructures synthesized from a domestic hydrothermal microwave method. Materials Research Bulletin. 43, 771-775 (2008).
- Liu, B., Zeng, H. C. Mesoscale organization of CuO nanoribbons: formation of 'dandelions'. J Am Chem Soc. 126, 8124-8125 (2004).
- Peng, M., et al. Controllable synthesis of self-assembled Cu2S nanostructures through a template-free polyol process for the degradation of organic pollutant under visible light. Materials Research Bulletin. 44, 1834-1841 (2009).
- Deodhar, S., Huckaby, J., Delahoussaye, M., DeCoster, M. A. High-Aspect Ratio Bio-Metallic Nanocomposites for Cellular Interactions. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 64, 012014 (2014).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12, 47-53 (2010).
- Wiogo, H. T., Lim, M., Bulmus, V., Yun, J., Amal, R. Stabilization of magnetic iron oxide nanoparticles in biological media by fetal bovine serum (FBS). Langmuir. 27, 843-850 (2011).
- Yunker, P. J., Still, T., Lohr, M. A., Yodh, A. G. Suppression of the coffee-ring effect by shape-dependent capillary interactions. Nature. 476, 308-311 (2011).
- Kahler, H., Lloyd Jr, B., Eden, M. Electron Microscopic and Other Studies on a Copper–Cystine Complex. The Journal of Physical Chemistry. 56, 768-770 (1952).
- Furia, E., Sindona, G. Complexation of L-cystine with metal cations. Journal of Chemical & Engineering Data. 55, 2985-2989 (2010).
- Hawkins, C., Perrin, D. Polynuclear Complex Formation. II. Copper (II) with Cystine and Related Ligands. Inorganic Chemistry. 2, 843-849 (1963).
- Hallman, P., Perrin, D., Watt, A. E. The computed distribution of copper (II) and zinc (II) ions among seventeen amino acids present in human blood plasma. Biochem. J. 121, 549-555 (1971).
- Jensen, L. S., Maurice, D. V. Influence of sulfur amino acids on copper toxicity in chicks. The Journal of nutrition. 109, 91-97 (1979).
- Lee, Y., Choi, J. R., Lee, K. J., Stott, N. E., Kim, D. Large-scale synthesis of copper nanoparticles by chemically controlled reduction for applications of inkjet-printed electronics. Nanotechnology. 19, 415604 (2008).
- Hume, J., et al. Engineered coiled-coil protein microfibers. Biomacromolecules. 15, 3503-3510 (2014).
