Summary
Hier presenteren we een protocol om nieuwe, high-aspect ratio biocomposieten synthetiseren onder biologische omstandigheden en in vloeibare media. De biocomposieten schaal van nanometers tot micrometers in diameter en lengte respectievelijk. Koperen nanodeeltjes (CNPs) en kopersulfaat in combinatie met cystine zijn de belangrijkste componenten voor de synthese.
Abstract
Het doel van dit protocol is de synthese van twee nieuwe biocomposieten met hoge aspectverhouding structuren beschrijven. De biocomposieten bestaan uit koper en cystine, met ofwel koper nanodeeltjes (CNPs) of kopersulfaat dragen de metallische component. Synthese wordt uitgevoerd in vloeistof onder biologische omstandigheden (37 ° C) en de zelf-geassembleerde samengestelde vorm na 24 uur uitgevoerd. Eenmaal gevormd, deze composieten zijn zeer stabiel in zowel vloeibare media in een gedroogde vorm. De composieten schaal van nano- tot range micro- lengte en van enkele microns tot 25 nm in diameter. Veldemissie scanning elektronen microscopie met energie dispersieve röntgenspectroscopie (EDX) toonden aan dat zwavel aanwezig was in de NP-afgeleide lineaire structuur, hoewel het afwezig het uitgangsmateriaal CNP materiaal, waardoor cystine als bron van zwavel in de definitieve bevestiging nanocomposieten . Tijdens de synthese van deze lineaire nano- en micro-composieten, een breed scala aan lengtes van structures wordt gevormd in de synthese vat. Sonicatie van het vloeistofmengsel na synthese werd aangetoond te helpen bij het beheersen gemiddelde grootte van de structuur van de vermindering van de gemiddelde lengte met verhoogde moment van sonicatie. Aangezien de gevormde structuren zijn zeer stabiel, niet agglomereren, en worden gevormd in de vloeibare fase, kunnen centrifugeren worden gebruikt om te helpen bij het concentreren en scheiden gevormde composieten.
Protocol
1. Planning van Experimenten
- Bepaal de hoeveelheid koper nanocomposieten nodig voor synthese. Op basis daarvan kiezen voor een aantal kleine hoeveelheid flesjes (25 cm 2), of grotere flessen, zoals hieronder in de voorbereiding van de materialen aangegeven.
- Voor deze synthese, gebruikt een 37 ° C incubator met 5% CO 2 en ten minste 40% vochtigheid. Controleer of dergelijke incubator beschikbaar is en zal niet herhaald worden verstoord tijdens de looptijd van synthese (ongeveer 24 uur).
VOORZICHTIG: herhaald openen en sluiten van de incubator wordt stellig temperatuurswisselingen die kunnen leiden tot gewijzigde synthese van de nanocomposiet structuren.
2. Voorbereiding van Materialen
- Bereid alle materialen vers voorafgaand aan een experiment door toevoegen van vast materiaal oplosmiddelen vlak voor synthese moet beginnen. Het houden van voorraad oplossingen van cystine en koper grondstoffen in vloeibare voor lange tijden before het experiment wordt niet aanbevolen en kan leiden tot wisselende resultaten. Na opening van de leverancier, blijven uitgangsmaterialen drogen wikkelen de bovenkant van de container met Parafilm.
Opmerking: Het volgende protocol wordt gebruikt als voorbeeld voor reactie in een 25 cm 2 celkweek kolf behulp 7 pl cystine, 6643 uit steriel water en 350 gl van CNPs. - Bereid een 2 mg / ml oplossing van koper nanodeeltjes door het wegen van ten minste 2 mg CNPs. Draag wegwerphandschoenen tijdens deze stap om mogelijk contact van CNPs met de huid te voorkomen. Plaats de nanodeeltjes in een lege steriele 16 ml glazen flacon.
- Om de flacon met CNPs, voeg steriel gedeïoniseerd water in het geschikte volume van een 2 mg / ml oplossing te maken en vortex de oplossing gedurende 20 seconden om dispersie van de nanodeeltjes voor synthese begint verschaffen (ten minste 1 ml totaal volume wordt aanbevolen). Laat de flacon meer dan de helft niet vullen met water omdat dit zal remmen mengen door vortexen. CNPs will snel naar de bodem van het flesje en zal donker van kleur (grijs tot zwart) verschijnen.
- Ultrasone trillingen de CNP oplossing voor 17 min bij RT om maximale spreiding van CNPs bieden voor aanvang van de synthese. Controleer regelmatig om ervoor te zorgen dat CNPs worden mengen als gevolg van sonicatie. Na een succesvolle sonicatie, CNPs gesuspendeerd blijven in oplossing ten minste 30 minuten en de oplossing wordt donker van kleur.
- Weeg voldoende massa van cystine een 72,9 mg / ml oplossing voor de synthese te maken. Aangezien cystine is niet direct oplosbaar in water, plaats de gewogen cystine in een antistatische weegflesje.
- Het wegen vat dat cystine, voeg voldoende hoeveelheid steriele, 1 M NaOH, zodat het cystine volledig oplost. Zo lossen 7,29 mg cystine volledig in 100 gl 1 M NaOH, een 72,9 mg / ml oplossing te maken.
- Om steriele omstandigheden te behouden, het uitvoeren van deze stap in een steriele stroming weefselkweek kap.
LET OP: NaOH1 M concentratie bijtend, dus draag wegwerphandschoenen tijdens deze stap om het contact van geconcentreerde NaOH met de huid te voorkomen
- Werken in een steriele weefselkweek kap, voeg 7 pl cystine met 6643 pi steriel water om de synthese steriele kolf eerste en laat incubeer gedurende 30 min in de incubator bij 37 ° C met de kolf dop geventileerd (los) om effectieve mengen. Resuspendeer de 2 mg / ml oplossing CNP door vortexen gedurende 30 sec, omdat CNPs zal geregeld na sonicatie stap.
- Voeg voldoende CNP oplossing voor de synthese kolf (met behulp van steriele techniek) aan de volgende component ratio's: combineer 1 delen cystine, 50 delen CNPs en 949 delen steriel water in een 25 cm 2 celkweek kolf om de synthese te starten. Bijvoorbeeld, een 7 ml volume synthese combineren 7 pl cystine voorraadoplossing, 350 ui CNPs en 6643 uit steriel water. Plaats de dop op de fles en draai zodat het secure.
- Na het combineren van alle componenten voor de synthese, meng in de kolf door zwenken 4-5 keer. Plaats de kolf in de CO 2 incubator en ontlucht de kolf door het losdraaien van de dop zodat er gasuitwisseling in en uit de kolf tijdens de synthese zal zijn.
- Laat synthese te draaien in de incubator gedurende ongeveer 24 uur. Tijdens synthese kan men waarnemen, met microscopie en op het oog, vorming van zeer lineaire composieten.
Opmerking: Het proces van de vorming van de structuur kan plotseling gebeuren in die zin dat structuren aanvankelijk moeilijk te detecteren, vervolgens overgaat verschijning snel toenemende dichtheid. Vorming kan dus gebeuren vóór 24 uur. De werkwijze kan ook worden waargenomen door het oog eenmaal structuren groter en hun dichtheid toeneemt. Hoewel productie van de structuur in de tijd kan worden waargenomen onder de microscoop en op het oog op latere tijdstippen voortdurend onderbreken van de synthesecondities en temperatuur leiden tot slechtesynthese resultaten. - Beëindigen synthese van biocomposieten door stevig aftopping de synthese kolf en opslaan van het vaartuig in de koelkast (4 ° C). Structuren, eenmaal gegenereerd, blijven stabiel in deze vorm voor minstens een jaar. Label de kolf synthesecondities, inclusief componenten benut na de synthese en incubatietijd van de synthese voor de beëindiging.
3. Synthese behulp Kopersulfaat
- Het uitvoeren van zelf-assemblage synthese door het vervangen van CNPs met kopersulfaat zout. Met steriele techniek, los ten minste 2 mg kopersulfaat in voldoende hoeveelheid steriel gedeïoniseerd water om een 2 mg / ml oplossing te maken. De kopersulfaat kristallen gemakkelijk in oplossing gaan in deze concentratie, maar vortex de flacon indien nodig, en controleer op het oog zodat alle kristallen worden opgelost.
- Na de bereiding van de kopersulfaat, voeren synthese zoals eerder beschreven, maar onder vervanging CNPs met kopersulfaat.
Opmerking: Zelf-assemblerende nanocomposieten koper- sulfaat als uitgangsmateriaal bleken veel consistenter in uiteindelijke vorm dan bij constructies gesynthetiseerd van CNPs zijn. - Sluit de synthese van kopersulfaat biocomposieten als voor CNP composieten (stap 2.6) en bewaar ze op lange termijn bij 4 ° C.
4. karakterisering en behandeling van biocomposieten Post-synthese
- Karakteriseren biocomposieten afgeleid van CNPs en van kopersulfaat door wit licht microscopie 9 en door elektronenmicroscopie 9.
- Voor de karakterisering en inspectie van biocomposieten post-synthese door wit licht microscopie, gebruiken een omgekeerde microscoop als composieten zal vestigen op de onderkant van de kolf op een paar minuten van het leggen van de kolf vlak, en kan dan in beeld worden gebracht. Gebruik de heldere veld instelling op de microscoop om het contrast tussen biocomposieten en het vloeibare medium te maximaliseren. Composites afgeleid van CNPs en copper sulfaat zullen beide lijken duidelijk te ondoorzichtig in kleur, maar gereageerde CNP aggregaten zal zeer donker van kleur verschijnen.
- Een digitale camera op de microscoop om beelden van de composieten te vangen. Een reeks van lengtes van de individuele structuren worden waargenomen.
- Voor de karakterisering en inspectie van biocomposieten post-synthese en na opslag bij 4 ° C, laat flesjes om RT te komen gedurende ten minste 15 min als flesjes condensatie aanvankelijk zal vormen na verwijdering uit de koelkast, die effectief zal verduisteren richten tijdens het uitvoeren van microscopie beeldvorming. Na waardoor evenwicht tot RT, veegt de boven- en onderkant van de kolf met een schone papieren handdoek om microscopie beeldkwaliteit te maximaliseren.
- Bij het werken met of imaging composieten die zijn opgeslagen op lange termijn, vortex de kolf gedurende 30 sec klompen composieten die vorm, terwijl in de koelkast dissociëren. Na het vortexen, inspecteren de structuren met een omgekeerde microscope zodat aggregaten gedissocieerd en herhaal vortexen indien nodig.
- Gebruik omgekeerd wit licht microscopie om de werkzaamheid van de synthese te evalueren voor een gegeven experiment met CNPs. Bijvoorbeeld, document de aanwezigheid of afwezigheid van ongereageerde CNPs in synthese kolven voor CNP-afgeleide biocomposieten van flessen met verschillende parameters zoals de tijd van synthese.
Opmerking: Individuele CNPs zijn te klein om te observeren met een lichtmicroscoop, maar ongereageerde CNP aggregaten verschijnen als round-shape and donkere objecten, in tegenstelling tot het succes gesynthetiseerde CNP-composieten met een hoge aspectverhouding, lineaire vorm zal hebben, en zal een reeks verschillende lengten. Vermijd het uitvoeren van synthese te lang van een tijd voor de beëindiging, omdat dit resulteert in sterk vertakt "urchin" type structuren, die moeilijk te dispergeren in afzonderlijke structuren eenmaal gevormd zijn. - Gebruik omgekeerd wit licht microscopie om de werkzaamheid te beoordelenvan de synthese voor een gegeven experiment met kopersulfaat. Sinds kopersulfaat gaat volledig in oplossing met behulp van dit protocol, zal de oplossing lijken minder donker dan de oplossing van synthese met behulp CNPs. Noteer de grootte en de omvang van kopersulfaat composieten door vergelijking flessen met verschillende synthesecondities zoals tijd van synthese voor de beëindiging.
Opmerking: succes gesynthetiseerd composieten een reeks verschillende lengten vertonen. Vermijd het uitvoeren van synthese te lang van een tijd voor de beëindiging, omdat dit resulteert in sterk vertakte aggregaten van composieten, waarvan sommige "urchin-achtige" van structuur zijn en die moeilijk te dispergeren in afzonderlijke structuren eenmaal gevormd zijn .
- Voor de karakterisering en inspectie van biocomposieten post-synthese door wit licht microscopie, gebruiken een omgekeerde microscoop als composieten zal vestigen op de onderkant van de kolf op een paar minuten van het leggen van de kolf vlak, en kan dan in beeld worden gebracht. Gebruik de heldere veld instelling op de microscoop om het contrast tussen biocomposieten en het vloeibare medium te maximaliseren. Composites afgeleid van CNPs en copper sulfaat zullen beide lijken duidelijk te ondoorzichtig in kleur, maar gereageerde CNP aggregaten zal zeer donker van kleur verschijnen.
- Om biocomposieten concentreren post-synthese, centrifuge oplossingen van composieten in een centrifugebuis. Voeg 6 ml van ofwel CNP-afgeleide structuren of koper- sulfaat afgeleide structuren een 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer gedurende 10 minbij 500 xg bij kamertemperatuur om een pellet te vormen. Voor kleinere volumes, voeg 500 pl structuren in oplossing 0,6 ml sized buizen. Centrifugeer bij 2000 xg bij kamertemperatuur gedurende ten minste 10 min tot een pellet te vormen.
- Na centrifugeren gedurende voldoende tijd (ten minste 10 min voor microfuges), slaat de waarneembare pellet op de bodem van de buis waarin de structuren worden geconcentreerd door zorgvuldig verwijderen van de bovendrijvende vloeistof boven de pellet. Biocomposite structuren afgeleid van kopersulfaat verschijnen blauw van kleur en structuren afgeleid van CNPs zijn donkerder (grijs naar zwart).
- Voeg meer composieten deze buis en het proces herhalen in dezelfde buis structuren concentreren indien gewenst. Om de geconcentreerde pellets dispergeren, voeg de gewenste hoeveelheid oplossing aan de buis en vortex gedurende 10-30 sec.
- Sonificeer structuren eenmaal gevormd, aan de gemiddelde omvang van de populatie (lengte) van de structuren te verplaatsen naar lagere waarden. Plaats structuren in steriel gedemineraliseerd water en ultrasone trillingen gedurende least 10 min. Met deze werkwijze mettertijd constructies gefragmenteerd en kleiner de gemiddelde lengte (zie Figuur 6 van de tekst). Document veranderingen in de samengestelde maten met verschillende sonicatie tijden met behulp van een omgekeerde witte lichtmicroscoop en digitale camera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een schematisch stroomschema van de synthesestappen de lineaire biocomposieten in dit werk beschreven vormen. CNPs of kopersulfaat als uitgangsmaterialen worden gecombineerd met steriel water om een 2 mg / ml te vormen, deze oplossing wordt gemengd en gesoniceerd om een homogene massa te verschaffen, en het koper oplossing wordt vervolgens gemengd in de volgende verhouding synthese: 949 parts steriel water: 50 delen koper mengsel: 1 deel cystine voorraad oplossing. De feitelijke volume worden verhoogd of verminderd in overeenstemming met deze verhoudingen te schalen of schaal brengen van de uiteindelijke synthese opbrengst. Na incubatie gedurende minstens 2 uur, zoals aangegeven, worden lineaire Biocomposite structuren gevormd die mettertijd bij normaal wit licht microscoop of met het oog kan worden waargenomen als de vloeibare oplossing veranderingen in het uiterlijk.
Figuur 2 toont een representatief resultaat van de eerste ontdekking van deze lineaire structuren volledig celkweekmedium oVER een periode van 82 uur. Ons laboratorium was het uitvoeren van de evaluatie van de mogelijke toxiciteit van verschillende nanomaterialen, waaronder CNPs op normale cellen en kankercellen, en de weergegeven in figuur 2 cellen zijn een snel groeiende hersentumor cellijn van ATCC (CRL-2020). Een belangrijke aanvulling op de volledige media voor deze cellen is cystine, die bleek de essentiële component tot de ontdekking van waarom deze lineaire structuren vormden in de kweken (zie hieronder en bespreking onderdeel). Uit een eerste gelijkmatige spreiding van CNPs die snel aggregaat in microstructuren (Figuren 2A en 2B), de tijd de kleinere deeltjes worden gewist en grotere aggregaten gevormd (Figuren 2C en 2D). Tenslotte grotere aggregaten met fijne, lineaire structuren weergegeven in dezelfde putjes (figuur 2E-H), die de "egel" type structuren die eerder in de literatuur met behulp van niet-biological methoden 6. Vergelijking van de laatste twee tijdstippen, op 69 en 82 uur (Figuren 2G en 2H, respectievelijk), blijkt dat de ontwikkeling van het grote letters urchin structuren tamelijk stabiel blijft, zoals aangegeven door beeldvorming exact dezelfde veld.
Om te verklaren waarom deze urchin structuren onder deze omstandigheden in de celkweken werden waargenomen, begonnen we waardoor mediumbestanddelen te bepalen of de essentiële elementen die zouden kunnen worden. We ontdekten dat een belangrijke component en aanvulling van het celkweekmedium was cystine, die aan het proces van eliminatie uiteindelijk werd geïdentificeerd als een essentiële component voor het zelf-assemblageproces. Met deze eenvoudigere synthese onderdelen (zie figuur 1), konden vormen uiteindelijk hoge aspectverhouding (lineair) structuren in vloeibare, dat kan worden aangetoond in de tijd te transformeren van nanodeeltjes vorm lineaire vorm, zonder de noodzaak van cellen, of van de andere celCultuur componenten (figuren 3A-C).
Figuur 4 toont karakterisering van het ontdekte nieuwe structuren met behulp van elektronenmicroscopie, omvattende een transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) beeldinvanginrichting nanodeeltjes uitgangsmateriaal en het vormen van lineaire nanostructuren (Figuur 4A). Representatieve scanning electronen microscoop (SEM) beelden worden getoond uitgangsmateriaal CNPs, lineaire structuren gevormd uit de NPs en lineaire structuren gevormd uit kopersulfaat uitgangsstof (Figuren 4B-F, respectievelijk).
Om te controleren of de biocomposieten bevatte cystine of cystine afgeleide materiaal als een essentiële biologische component van de samenstellingen werden de gevormde structuren geanalyseerd met EDX met SEM microscoop. Representatieve schermafbeeldingen De te analyseren stoffen worden getoond in Figuur 5. Belangrijk bij vergelijking CNPs en biocomposieten de CNPs, een prominentezwavel piek verschijnt (figuur 5B), die niet aanwezig is in de CNP uitgangsmateriaal (figuur 5A). Voor het gebruik biocomposieten kopersulfaat als uitgangsmateriaal (figuur 5C), koolstof en stikstof pieken verschijnen (figuur 5D), hetgeen consistent is met de aanwezigheid van cystine hiervoor Biocomposite.
Op dit moment is een werkwijze voor het regelen van de lengte en grootte van composieten tijdens de synthese niet geïdentificeerd. Echter, te onderzoeken of de gemiddelde grootte van structuren kan worden gecontroleerd na synthese, werden lineair biocomposieten gesonificeerd verschillende tijdsperioden zoals aangegeven in figuur 6. Met verhoogde tijd van sonicatie, werd aangetoond dat de gemiddelde grootte van de lineaire biocomposieten gedaald, hetgeen blijkt uit helderveld microscopie (Figuur 6A-D). Als een werkwijze voor het concentreren en scheiden gevormde composieten kunnen centrifugeren worden gebruikt, en zoals getoond in figuur 6E-G Een zichtbare pellet kan ontwikkelen, afhankelijk van de omvang en centrifugatie krachten gebruikt.
Figuur 1. Vertegenwoordiger stroomschema van synthese ontwerp Cu NP = koper nanodeeltjes.; Cys = cystine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Representatieve vorming van koper Biocomposite structuren hersentumor celkweken complete celkweekmedium. Een representatief experiment gevolgd gedurende een totaal van 82 uur wordt getoond in celkweek met hersentumor cellen en CNPs (50 ug / ml). Panelen A en B tonende kweekputjes op tijdstip 0, na CNPs hebben gevestigd op de bodem van de put. Panelen ch tonen latere tijdstippen op 17, 24, 36, 49, 69, en 82 uur, respectievelijk. Panelen G en H vertegenwoordigen hetzelfde veld op 69 en 82 uur. Alle beelden werden verkregen met helderveld microscopie contrast koper materiaal vergroten. Schaal bars = 100 micron voor A + B, 50 micron voor CE en 25 micron voor de F + G. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Transformatie van CNPs lineair biocomposieten. CNPs gecombineerd met cystine en water zoals aangegeven in figuur 1 en in protocol gedeelte met een totaal volume van 7 ml. Panel A toont de synthese vaartuig op het moment 0, paneel B geeft 3 uur, en paneel C shows 6 uur. Beelden werden verkregen met behulp van helderveld microscopie met schaal bar aangegeven (50 micron). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Elektronenmicroscopie karakterisatie van gesynthetiseerde biocomposieten Panel (A):. TEM van CNP uitgangsmateriaal (rond) de vorming lineaire composieten. Panelen (B) en (C) tonen de karakterisering van het uitgangsmateriaal CNPs via SEM. Paneel (C) is een ingezoomd beeld van (B). Deelfiguur (D) toont SEM composieten gevormd uit CNPs en cystine. Panels (E) en (F) tonen SEM van het kopersulfaat biocomposieten. Panel (F) is een zoomed beeld van (E). Schaalbalken worden in alle afbeeldingen en = 200 nm (A), 1 micron (B), 500 nm (C), 5 micron (D), 2 micron (E) en 1 micron (F ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. EDX (SEM) analyse van de uitgangsmaterialen en gesynthetiseerd lineaire composieten. Scherm snapshots van SEM gescand monsters met behulp van EDX analyse voor de elementaire inhoud. Panel (A) = starten CNPs; Paneel (B) = biocomposieten van CNPs en cystine; Paneel (C) = kopersulfaat uitgangsmateriaal en Paneel (D) = composieten from kopersulfaat en cystine. Voor peak labeling, C = koolstof, O = zuurstof, Cu = koper, S = zwavel en N = stikstof. Grotere etiketten voor elementaire identiteit bovenstaande sleutel pieken voor kijkgemak geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Wijziging lineaire composiet grootte en concentratie na synthese. Lineaire structuren gesynthetiseerd uit kopersulfaat werden gesonificeerd gedurende 0, 15, 30 of 60 min, respectievelijk, zoals getoond in panelen (AD). Beelden werden verkregen met behulp van helderveld microscopie met schaal bar van 200 micron aangegeven in alle beelden. Panels (EG), concentratie biocomposieten middels centrifugatie: 6 ml lineaire structuren afgeleid van CNPs (<strong> E, links) en kopersulfaat (E, rechts) getoond afwikkeling onder zwaartekracht na 10 min. Met 10 min centrifugatie bij 500 xg, wordt een samengeperste pellet gevormd (paneel F). Een kleiner volume (500 pl) van hetzelfde materiaal werd geconcentreerd zoals in (panel G) (CNP-afgeleide structuren worden getoond in de linker buis en koper-sulfaat afgeleide structuren in de rechterbuis). Klik hier om een vergroting versie van deze figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl evalueren van potentiële toxische effecten van nanomaterialen zoals CNPs werd waargenomen dat op lange termijn, CNPs omgevormd vanuit een aanvankelijk meer verspreid deeltjesvormige distributie naar een grotere, geaggregeerde vorm (Figuur 2). In sommige gevallen zijn deze zeer geaggregeerde formaties die zijn geproduceerd in de cel kweekschaal, onder biologische omstandigheden, vormden zeer lineaire projecties van de centrale aggregaat denken aan eerder beschreven koperhoudende "egels" 6. Er zij op gewezen dat in het hier getoonde omstandigheden, de concentratie van CNPs toegevoegd aan de cellen was submaximale, dus niet alle cellen in kweek doden (zie figuur 2). Uit deze eerste waarnemingen werden experimenten vervolgens voortgezet door eliminatie achtereenvolgens meer bestanddelen van de voorwaarden celkweek (met inbegrip uiteindelijk de cellen zelf) aan de resterende essentiële componenten die nodig zijn voor synthese o vindenf lineaire koper biocomposieten.
We ontdekten dat cystine, een aangevuld component van de oorspronkelijke cel cultures, in combinatie met CNPs onder de juiste biologische omstandigheden, kunnen leiden tot verandering van de nanodeeltjes vorm tot een zeer lineaire Biocomposite dat zowel het metaal als biochemische componenten bevatte zoals aangegeven door EDX analyse door scanning elektronenmicroscopie van de bereide monsters (Figuur 5). Aldus zwavel, die niet aanwezig is in het uitgangsmateriaal CNP materiaal toont een prominente piek in de gesynthetiseerde biocomposieten, wat aangeeft dat zowel koper en componenten van de biochemische materiaal cystine zijn essentieel voor de gevormde lineaire structuren.
Verder werd aangetoond dat door toepassing van soortgelijke omstandigheden synthese, maar vervanging CNPs met kopersulfaat, sterk lineair biocomposieten kan worden gevormd. In feite, synthese koper- sulfaat en cystine neiging te resulteren in "schonere" end producten, aangezien niet gereageerde CNPs waren altijd aanwezig, aangezien kopersulfaat volledig oplosbaar in water, die werd gebruikt als oplosmiddel in alle syntheses hier gerapporteerd. Verder koper-sulfaat biocomposieten onderscheiden zich van CNP-afgeleide composieten in het behoud van een blauwe kleur die duidelijk worden bij het centrifugeren van het materiaal was.
Andere groepen hebben eerder gestudeerd koper-cystine-complexen en gedefinieerd aantal belangrijke chemische eigenschappen. Bijvoorbeeld Kahler et al. Toonden de vorming van koper-cystine-complexen in de vorm van fijne vezels, die evidente na drogen maar instabiel in oplossing 13 zijn. In andere voorbeelden, complexvorming onderzoeken met L-cystine en verschillende metaalkationen bevestigd koper en cystine complexvorming in een waterig medium en 14 gevormde complexen kunnen mononucleaire of polynucleaire zijn, waarbij de zwavel uit cystine bijdragen tot de complexvorming 15. Een aantal studies hebben verslaged interacties tussen cystine en koper in biologische systemen. Bijvoorbeeld, bij fysiologische pH, koper (II) ionen coördineren met histidine en cystine in gesimuleerde plasma complexen 16 en zwavelhoudende aminozuren vormen werden beschermend tegen kopervergiftiging bij kuikens 17 zijn. Deze bevindingen aldus de essentiële rol van cystine in complexeren met koper uitgangsmateriaal in onze synthese methoden voor het vormen van lineaire biocomposieten.
Op dit moment een synthesestrategie is nog niet geïdentificeerd die direct kunnen is de lengte van afzonderlijke lineaire biocomposieten zijn. De kritische stappen die in de beschreven synthese omvatten: 1) goede dispersie door sonicatie van uitgangsmaterialen bij de synthese opnemen CNPs; 2) het gebruik van vers bereide CNPs, kopersulfaat en cystine doeltreffende synthese van composieten; 3) waardoor de synthese in de kolf om ongestoord in de incubat blijvenof gedurende ten minste 6 uur; en 4) het vermijden van "over-reactie" omstandigheden waarin vertakt "egel" -type, geaggregeerde composieten vorm.
Nadat de synthese voltooid is, werd aangetoond dat sonicatie van de structuur effectief kan worden gebruikt om de gemiddelde afmeting (lengte) van de structuur te verlagen. Soniceren om kleinere structuren kunnen helpen in toepassingen zoals mobiele opname of andere Biocomposite-cellulaire interacties. Zoals eerder gemeld, ladingsstabilisering de CNPs tijdens deze synthese door vermenging met cystine veranderde de gemeten zeta potentiaal van positief naar een minder geladen (negatief) -vorm 9. Deze ladingsverandering kan helpen verklaren waarom de gevormde composieten vertonen weinig aggregatie in de gedroogde vorm of vloeibare voedingsbodem die verwerking van de aanwezige structuren veel handiger.
Omdat de gerapporteerde synthese van deze CNP-afgeleid en koper-sulfaat afgeleide structuren wordt uitgevoerd out in vloeibaar medium, wordt verwacht dat de werkwijze zeer schaalbaar kan zijn, hetgeen betekent dat de juiste verhouding tussen bestanddelen en synthesecondities, de milliliter syntheserecept hier gebruikt kunnen worden opgeschaald of omlaag om honderden milliliters of meer bevatten, en zouden derhalve naar verwachting meer eindproduct verkregen, eveneens. Door het metaal (koper) post daarvan biocomposieten, is het vrij eenvoudig om gesynthetiseerde product geconcentreerd door centrifugeren (figuur 6). Biocomposieten gevormd uit CNP uitgangsmateriaal behouden een donkerdere kleur eenmaal geconcentreerd tot een pellet, mogelijk als gevolg van ongereageerde koperoxide nanodeeltjes (figuur 6). Ter vergelijking, kopersulfaat biocomposieten bij concentreren tot een pellet een blauwe kleur in overeenstemming met eigenschappen van kopersulfaat met verschillende niveaus van hydratatie 18.
De nieuwe synthese hier vermeld is schaalbaar in die zin dat de zelf-geassembleerde linoor structuren schaal van de nano-schaal om de micro-schaal zoals weergegeven met behulp van elektronenmicroscopie (figuur 4) en de traditionele wit licht microscopie (figuren 3 en 6). Het is interessant dat onlangs ontworpen coiled-coil eiwit microvezels gerapporteerd dat curcumine waardoor de gevormde vezels onder fluorescentieverlichting 19 worden genomen kunnen bevatten. Vergelijkbare strategieën kunnen mogelijk zijn afstandhouders of labelingmiddelen nemen in de lineaire samenstellingen hier gerapporteerd productie van grotere structuren en / of verbeteringen voor beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini Vortexer | VWR (https://us.vwr.com) | 58816-121 | |
| CO2 Incubator Model # 2425-2 | VWR (https://us.vwr.com) | Contact vendor | Current model calalog # 98000-360 |
| Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge) | Labnet (http://labnetinternational.com/) | C2500-R | Model Prism R |
| Cell Culture Centrifuge Model Z323K | Labnet (http://labnetinternational.com/) | Contact vendor | Current model Z206A catalog # C0206-A |
| Sonicator (Ultrasonic Cleaner) | Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/) | 1510R-MTH | |
| Balance | Sartorius (http://dataweigh.com) | Model CP225D similar model CPA225D | |
| Olympus IX51 Inverted Light Microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Olympus DP71 microscope digital camera | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| external power supply unit - white light for Olympus microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | TH4-100 | |
| 10X, 20X, and 40X microscope objectives | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html) | model S-4800 | |
| Transmission Electron Microscope | Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html) | model Libra 120 | |
| Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco (http://envirco-hvac.com) | model PNG62675 | Used for sterile cell culture technique |
References
- Klinman, J. P. The copper-enzyme family of dopamine beta-monooxygenase and peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase: resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation. The Journal of biological chemistry. 281, 3013-3016 (2006).
- Uauy, R., Olivares, M., Gonzalez, M. Essentiality of copper in humans. The American journal of clinical nutrition. 67, 952S-959S (1998).
- Karlsson, H. L., Cronholm, P., Gustafsson, J., Copper Moller, L. oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes. Chemical research in toxicology. 21, 1726-1732 (2008).
- Parekh, G., et al. Layer-by-layer nanoencapsulation of camptothecin with improved activity. International journal of pharmaceutics. 465, 218-227 (2014).
- Harrington, M. J., Masic, A., Holten-Andersen, N., Waite, J. H., Fratzl, P. Iron-clad fibers: a metal-based biological strategy for hard flexible coatings. Science. 328, 216-220 (2010).
- Keyson, D., et al. CuO urchin-nanostructures synthesized from a domestic hydrothermal microwave method. Materials Research Bulletin. 43, 771-775 (2008).
- Liu, B., Zeng, H. C. Mesoscale organization of CuO nanoribbons: formation of 'dandelions'. J Am Chem Soc. 126, 8124-8125 (2004).
- Peng, M., et al. Controllable synthesis of self-assembled Cu2S nanostructures through a template-free polyol process for the degradation of organic pollutant under visible light. Materials Research Bulletin. 44, 1834-1841 (2009).
- Deodhar, S., Huckaby, J., Delahoussaye, M., DeCoster, M. A. High-Aspect Ratio Bio-Metallic Nanocomposites for Cellular Interactions. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 64, 012014 (2014).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12, 47-53 (2010).
- Wiogo, H. T., Lim, M., Bulmus, V., Yun, J., Amal, R. Stabilization of magnetic iron oxide nanoparticles in biological media by fetal bovine serum (FBS). Langmuir. 27, 843-850 (2011).
- Yunker, P. J., Still, T., Lohr, M. A., Yodh, A. G. Suppression of the coffee-ring effect by shape-dependent capillary interactions. Nature. 476, 308-311 (2011).
- Kahler, H., Lloyd Jr, B., Eden, M. Electron Microscopic and Other Studies on a Copper–Cystine Complex. The Journal of Physical Chemistry. 56, 768-770 (1952).
- Furia, E., Sindona, G. Complexation of L-cystine with metal cations. Journal of Chemical & Engineering Data. 55, 2985-2989 (2010).
- Hawkins, C., Perrin, D. Polynuclear Complex Formation. II. Copper (II) with Cystine and Related Ligands. Inorganic Chemistry. 2, 843-849 (1963).
- Hallman, P., Perrin, D., Watt, A. E. The computed distribution of copper (II) and zinc (II) ions among seventeen amino acids present in human blood plasma. Biochem. J. 121, 549-555 (1971).
- Jensen, L. S., Maurice, D. V. Influence of sulfur amino acids on copper toxicity in chicks. The Journal of nutrition. 109, 91-97 (1979).
- Lee, Y., Choi, J. R., Lee, K. J., Stott, N. E., Kim, D. Large-scale synthesis of copper nanoparticles by chemically controlled reduction for applications of inkjet-printed electronics. Nanotechnology. 19, 415604 (2008).
- Hume, J., et al. Engineered coiled-coil protein microfibers. Biomacromolecules. 15, 3503-3510 (2014).
