Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לסנתז רומן, biocomposites יחס גבוה היבט בתנאים ביולוגיים ובתקשורת נוזלית. Biocomposites קנה מידה מננומטרים למיקרומטר בקוטר ואורך, בהתאמה. חלקיקי נחושת (CNPs) ונחושת גופרתית בשילוב עם ציסטין הם המרכיבים העיקריים לסינתזה.
Abstract
המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את הסינתזה של שני biocomposites רומן עם מבני יחס גבוה היבט. Biocomposites מורכב מנחושת וציסטין, גם עם חלקיקי נחושת (CNPs) או נחושת גופרתית תורם הרכיב המתכתי. הסינתזה מתבצעת בנוזל בתנאים ביולוגיים (37 מעלות צלזיוס) וצורת מרוכבים עצמיים התאספו לאחר 24 שעות. ברגע שנוצר, חומרים מרוכבים אלה הם מאוד יציבים בשתי תקשורת הנוזלית ובצורה יבשה. חומרים מרוכבים בקנה מידה מננו למייקרו טווח אורך, ומכמה מיקרונים עד 25 ננומטר בקוטר. מיקרוסקופ אלקטרונים סורקים פליטת שדה עם ספקטרוסקופיה רנטגן נפיצה אנרגיה (EDX) הוכיח כי הגופרית הייתה נוכחת במבנים ליניארי נגזר-NP, בזמן שהוא נעדר מחומר CNP מתחיל, ובכך אישר ציסטין כמקור של גופרית בnanocomposites הסופי . במהלך סינתזה של ננו ומיקרו-חומרים מרוכבים ליניארי אלה, במגוון הרחב של אורכים של structures נוצר בכלי הסינתזה. Sonication של התערובת הנוזלית לאחר הסינתזה הודגם לסייע בשליטה בגודל ממוצע של המבנים על ידי צמצום האורך הממוצע עם זמן מוגבר של sonication. מאז המבנים נוצרו הם מאוד יציבים, לא מצבר, ונוצרים בשלב נוזלי, צנטריפוגה עשויה לשמש גם כדי לסייע בריכוז והפרדת חומרים מרוכבים נוצרו.
Protocol
1. תכנון של ניסויים
- לקבוע את עוצמת הקול של nanocomposites הנחושת נחוץ לסינתזה. על בסיס זה, לבחור מספר צלוחיות הקטנות נפח (25 סנטימטר 2), או צלוחיות גדולות יותר כמפורט להלן בהכנת חומרים.
- לסינתזה זו, השתמש 37 ° C חממה עם 5% CO 2 ולפחות 40% לחות. ודא שחממה כזה יהיה זמינה ושזה לא יפריע שוב ושוב על פני תקופה של סינתזה (כ 24 שעות).
זהירות: פתיחה חוזרת וסגירה של החממה תהיה בהחלט לגרום לתנודות טמפרטורה שעלולה לגרום לסינתזת שינה של מבני nanocomposite.
2. הכנת חומרים
- הכן את כל החומרים טריים לפני תחילת ניסוי, על ידי הוספת חומרים מוצקים לממסים ממש לפני הסינתזה היא להתחיל. שמירה על פתרונות מניות של חומרי ציסטין והתחלת נחושת בנוזל לפעמים ב ארוכהefore הניסוי אינו מומלץ ועלולים להוביל לתוצאות משתנים. פתח פעם אחת מהספק, ממשיך מתחיל חומרים יבשים על ידי עטיפה העליונה של המכל עם Parafilm.
הערה: הפרוטוקול הבא משמש כדוגמא לתגובה בבקבוק תרבות 2 תא 25 סנטימטר באמצעות 7 μl של ציסטין, 6,643 μl של מים סטריליים, ו -350 μl של CNPs. - הכן פתרון 2 מ"ג / מיליליטר של חלקיקי נחושת על ידי שקילה החוצה לפחות 2 מ"ג של CNPs. ללבוש כפפות חד פעמיות בשלב זה כדי למנוע מגע אפשרי של CNPs עם עור. מניחים את חלקיקים בבקבוקון זכוכית ריק מיליליטר 16 סטרילי.
- לבקבוקון המכיל CNPs, להוסיף מים ללא יונים סטרילי בנפח המתאים לעשות 2 מ"ג / מיליליטר פתרון ומערבולת הפתרון במשך 20 שניות כדי לספק פיזור של חלקיקים לפני תחילת סינתזה (נפח כולל לפחות 1 מיליליטר מומלץ). אין למלא יותר ממחצית דרך הבקבוקון עם מים כמו זה לעכב ערבוב על ידי vortexing. Wil CNPsl להתיישב במהירות לתחתית של הבקבוקון ויופיע בצבע כהה (אפור לשחור).
- Sonicate פתרון CNP במשך 17 דקות ב RT לספק פיזור מקסימאלי של CNPs לפני תחילת הסינתזה. מעת לעת לבדוק כדי לוודא שCNPs ערבוב בשל sonication. לאחר sonication מוצלח, CNPs להישאר תלוי בפתרון לפחות 30 דק 'והפתרון יהיה כהה בצבע.
- לשקול את מסה מספקת של ציסטין לעשות פתרון / מיליליטר 72.9 מ"ג לסינתזה. מאז ציסטין הוא לא ישירות מסיס במים, הנח את ציסטין שקל בכלי במשקל אנטי-סטטית.
- לציסטין כלי במשקל המכיל, להוסיף נפח מספיק של סטרילי, 1 M NaOH, כך שציסטין מתמוסס לחלוטין. לדוגמא, לפזר 7.29 מ"ג של ציסטין לחלוטין בשל 1 M NaOH 100 μl, כדי להפוך את פתרון 72.9 מ"ג / מיליליטר.
- כדי לשמור על תנאים סטריליים, לבצע צעד זה במנדף תרבות זרימת רקמות סטריליים.
זהירות: NaOHבריכוז 1 M הוא קאוסטית, כך ללבוש כפפות חד פעמיות בשלב זה כדי למנוע מגע של NaOH המרוכז עם עור
- העבודה בברדס רקמת סטרילית תרבות, להוסיף 7 μl של ציסטין עם 6,643 μl של מים סטריליים לבקבוק סטרילי הסינתזה הראשונה, ולתת דגירה במשך 30 דקות בחממה על 37 מעלות צלזיוס עם כובע הבקבוק פרק (רופף) כדי לספק יעיל ערבוב. Resuspend 2 מ"ג / מיליליטר פתרון CNP ידי vortexing למשך 30 שניות, מאז CNPs יהיה התיישב אחרי צעד sonication.
- להוסיף פתרון CNP מספיק כדי בקבוק הסינתזה (באמצעות טכניקה סטרילית) כדי לשמור על יחסי הרכיב הבאים: לשלב ציסטין 1 חלקים, 50 חלקים CNPs, וחלקי 949 מים סטריליים בבקבוק תרבות 2 תא 25 סנטימטר להתחיל הסינתזה. לדוגמא, עבור 7 מיליליטר סינתזת נפח, לשלב 7 μl של פתרון מניות ציסטין, 350 μl של CNPs, ו6,643 μl של מים סטריליים. החלף את הכובע על הבקבוק ולהדק כך שזה securדואר.
- לאחר שילוב כל הרכיבים לסינתזה, לערבב בעדינות בבקבוק על ידי מתערבל 4-5 פעמים. הנח בקבוק בחממת CO 2 ולפרוק את הבקבוק על ידי שחרור הכובע כדי שיהיה חילוף גזים ובמתוך הבקבוק במהלך סינתזה.
- לאפשר סינתזה לרוץ בחממה במשך כ 24 שעות. במהלך סינתזה, ניתן לראות, עם מיקרוסקופ ועל ידי עין, היווצרות של חומרים מרוכבים ליניארי מאוד.
הערה: תהליך ההיווצרות של המבנים עלול לקרות פתאום במובן זה שהם מבנים בתחילה קשה לזהות, אז ההופעה ממשיכה במהירות להגדלת צפיפות. היווצרות לכן עשויה להתרחש לפני 24 שעות. התהליך יכול גם להיות שנצפה על ידי העין פעם המבנים הפכו גדולים יותר והעלייה בצפיפות שלהם. בעוד דור של המבנים ניתן לראות לאורך זמן מתחת למיקרוסקופ ולפי העין בנקודות זמן מאוחר יותר, ברציפות להפריע תנאי הסינתזה וטמפרטורה תוביל לענייםתוצאות סינתזה. - לסיים סינתזה של biocomposites ידי חוזקה מכסת בקבוק הסינתזה ואחסון הכלי במקרר (4 מעלות צלזיוס). המבנים, שנוצרו פעם אחת, יישארו יציבים בצורה זו לשנה לפחות. תווית הבקבוק עם תנאי סינתזה, כוללים רכיבים מנוצלים, תאריך של הסינתזה, וזמן דגירה של הסינתזה לפני הסיום.
3. סינתזה באמצעות נחושת גופרתית
- לבצע סינתזת הרכבה עצמית על ידי החלפת CNPs עם מלח נחושת גופרתי. באמצעות טכניקה סטרילית, לפזר לפחות 2 מ"ג של נחושת גופרתית בנפח מספק של מים ללא יונים סטרילי כדי להפוך את פתרון 2 מ"ג / מיליליטר. גבישי נחושת גופרתי בקלות ללכת לפתרון בריכוז זה, אבל מערבולת הבקבוקון במידת צורך, ולבדוק על ידי העין על מנת להבטיח את כל הגבישים מתמוססים.
- לאחר ההכנה של הנחושת גופרתית, לבצע סינתזה כפי שתואר לעיל, אך החלפת CNPs עם הנחושת גופרתית.
הערה: nanocomposites התאסף עצמי באמצעות נחושת גופרתית כחומר מוצא נמצאו להיות הרבה יותר עקבי בצורה סופית מאשר למבנים מסונתזים מCNPs. - לסיים את הסינתזה של biocomposites נחושת גופרתי כלרוכבי CNP (שלב 2.6) ולאחסן אותם לטווח ארוך על 4 מעלות צלזיוס.
4. אפיון וטיפול בbiocomposites פוסט-סינתזה
- לאפיין biocomposites נגזר מCNPs ומנחושת גופרתית על ידי מיקרוסקופ אור הלבנה 9 ועל ידי מיקרוסקופי אלקטרונים 9.
- לאפיון ובדיקה של biocomposites פוסט-סינתזה ידי מיקרוסקופ אור הלבנה, להשתמש מיקרוסקופ הפוכה כחומרים מרוכבים יישבו למשטח התחתון של הבקבוק תוך כמה של הנחת הבקבוק שטוח דקות, ולאחר מכן ניתן הביא אל מוקד. השתמש בהגדרת השדה בהירה במיקרוסקופ כדי למקסם את הניגוד בין biocomposites והמדיום הנוזלי. חומרים מרוכבים הנגזרים מCNPs ושוטרלסולפט שניהם מופיעים ברורים לאטום בצבע, אבל אגרגטים CNP unreacted יופיעו כהים מאוד בצבע.
- השתמש במצלמה דיגיטלית המחוברת למיקרוסקופ כדי ללכוד תמונות של חומרים מרוכבים. מגוון של אורכים למבנים הבודדים יקויימו.
- לאפיון ובדיקה של biocomposites הודעה סינתזה ולאחר האחסון ב 4 ° C, לאפשר צלוחיות להגיע לRT לפחות 15 דק 'כצלוחיות יהוו עיבוי תחילה על ההסרה ממקרר, שלטשטש יעיל תוך התמקדות בעת ביצוע הדמיה מיקרוסקופית. לאחר מאפשר איזון לRT, לנגב את המשטחים העליונים ותחתונים של הבקבוק עם מגבת נייר נקייה על מנת למקסם את איכות הדמיה מיקרוסקופית.
- כאשר עובדים עם או הדמיה מרוכבים שאוחסנו לטווח ארוך, מערבולת הבקבוק למשך 30 שניות כדי לנתק גושים של חומרים מרוכבים היוצרים בזמן במקרר. לאחר vortexing, לבדוק את המבנים עם מיקרופון הפוךroscope כדי להבטיח שאגרגטים שניתקו, וחזור vortexing צורך.
- השתמש במיקרוסקופ אור הלבנה הפוכה כדי להעריך את היעילות של הסינתזה לניסוי נתון באמצעות CNPs. לדוגמא, לתעד את הנוכחות או עדר של CNPs unreacted בצלוחיות סינתזה המשמשות לbiocomposites נגזר CNP מצלוחיות עם פרמטרים שונים כגון זמן של סינתזה.
הערה: פרט CNPs הם קטנים מדי כדי לצפות במיקרוסקופ אור, אבל CNP unreacted צובר יופיע כעגולה צורה וחפצים כהים, בניגוד לCNP-מרוכבים מסונתזים בהצלחה שיש יחס גבוה היבט, טופס ליניארי, ו יהיה מגוון של אורכים שונים. להתחמק מביצוע סינתזה במשך זמן רב מדי של זמן לפני הסיום, כמו זה יגרום מסועף מאוד מבנים מסוג "קיפודים", שהם קשים לפיזור למבנים בודדים יצרו פעם. - השתמש במיקרוסקופ אור הלבן הפוכה להעריך את היעילותשל הסינתזה לניסוי נתון באמצעות נחושת גופרתית. מאז נחושת גופרתית הולך באופן מלא לפתרון באמצעות פרוטוקול זה, הפתרון יופיע פחות כהה מאשר הפתרון מסינתזה באמצעות CNPs. לתעד את הגודל ומידה של חומרים מרוכבים נחושת גופרתית על ידי השוואת צלוחיות עם תנאי סינתזה שונים כגון זמן של סינתזה לפני הסיום.
הערה: חומרים מרוכבים מסונתזים בהצלחה יציגו מגוון של אורכים שונים. להתחמק מביצוע סינתזה במשך זמן רב מדי של זמן לפני הסיום, כמו זה יגרום באגרגטים מסועפים מאוד של חומרים מרוכבים, שחלקם יהיו "כמו קיפודים-" במבנה, ואשר קשים לפיזור למבנים בודדים שנוצרו ברגע ש .
- לאפיון ובדיקה של biocomposites פוסט-סינתזה ידי מיקרוסקופ אור הלבנה, להשתמש מיקרוסקופ הפוכה כחומרים מרוכבים יישבו למשטח התחתון של הבקבוק תוך כמה של הנחת הבקבוק שטוח דקות, ולאחר מכן ניתן הביא אל מוקד. השתמש בהגדרת השדה בהירה במיקרוסקופ כדי למקסם את הניגוד בין biocomposites והמדיום הנוזלי. חומרים מרוכבים הנגזרים מCNPs ושוטרלסולפט שניהם מופיעים ברורים לאטום בצבע, אבל אגרגטים CNP unreacted יופיעו כהים מאוד בצבע.
- להתרכז biocomposites הודעה סינתזה-, פתרונות צנטריפוגות של חומרים מרוכבים בצינור צנטריפוגות. הוסף 6 מיליליטר של או מבנים נגזר CNP או מבנים הנגזרים נחושת גופרתית לצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. צנטריפוגה למשך 10 דקותב XG 500 ב RT לצורה כדורית. עבור אמצעי אחסון קטן יותר, להוסיף 500 μl של מבנים בפתרון 0.6 מיליליטר צינורות בגודל. צנטריפוגה XG ב 2000 ב RT לפחות 10 דקות כדי ליצור גלולה.
- לאחר צנטריפוגה למספיק זמן (לפחות 10 דקות לmicrofuges), להציל את הכדור לצפייה בחלק התחתון של הצינור שבו המבנים מרוכזים על ידי הסרת נוזל supernatant מעל גלולה בזהירות. מבני biocomposite נגזרים מנחושת גופרתית מופיעים בצבע כחול ומבנים הנגזרים מCNPs כהים (אפורים לשחור).
- הוסף עוד חומרים מרוכבים לצינור זה ולחזור על התהליך באותו הצינור להתרכז מבנים אם תרצה בכך. כדי לפזר את כדורים מרוכזים, להוסיף נפח הרצוי של פתרון לצינור, ומערבולת למשך 10-30 שניות.
- מבני Sonicate יצרו פעם אחת, כדי להעביר את הגודל הממוצע אוכלוסייה (אורכים) של המבנים להורדת ערכים. מבני מקום במים סטריליים deionized וsonicate בleAST 10 דקות. באמצעות תהליך זה, לאורך זמן, המבנים הופכים למפוצלים וקטנים יותר באורך ממוצע (ראה איור 6 של הטקסט). שינויים במסמך בגדלים מורכבים עם פעמים sonication שונות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה אור לבנה ומצלמה דיגיטלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג תרשים זרימה סכמטי של הצעדים כדי ליצור סינתזת biocomposites יניארי המתואר בעבודה זו. CNPs או נחושת גופרתית כמתחיל חומרים בשילוב עם מים סטריליים כדי ליצור פתרון 2 מ"ג / מיליליטר, פתרון זה הוא מעורב וsonicated לספק אפילו תערובת, ופתרון נחושת זה הוא מעורב אז ביחס הבא לסינתזה: 949 חלקים סטרילי מים: 50 חלקים תערובת נחושת: פתרון מניות ציסטין חלק 1. הכרכים בפועל עשויים להיות מוגברים או מופחתים בהתאם ליחסים אלו בהיקף של עד או להקטין את תשואת הסינתזה הסופית. לאחר דגירה של לפחות 2 שעות כפי שצוינו, מבני biocomposite יניארי נוצרים אשר לאורך זמן יכול להיות שנצפו תחת מיקרוסקופ אור הרגילה הלבנה או לפי העין כשינויי תמיסה הנוזלית במראה.
איור 2 מראה תוצאת נציג מהגילוי הראשוני של מבנים ליניארי אלה בo תקשורת תרבית תאים המלאהVer תקופה של 82 שעות. המעבדה שלנו הייתה ביצוע הערכה של הרעילות האפשרית של ננו שונה, כולל CNPs על תאים נורמלים ותאים סרטניים, והתאים שמוצגים באיור 2 הם קו תא גידול במוח בצמיחה מהירה מATCC (CRL-2020). תוסף מפתח לתקשורת המלאה המשמשת לתאים אלה הוא ציסטין, שהתברר כמרכיב החיוני לגילוי הסיבה ליניארי מבנים אלה יוצרים בתרבויות (ראה להלן וסעיף דיון). מפיזור אפילו ראשוני של CNPs שמהירות כוללת לmicrostructures (2A דמויות ו2B), לאורך זמן החלקיקים הקטנים יותר נמחקים ואגרגטים גדולים נוצרים (2C דמויות ו2D). לבסוף, אגרגטים גדולים עם מבנים יפים, יניארי יופיעו באותו הבארות (איורים 2E-H), ויצרו סוג המבנים "קיפודים" שדווחו בעבר בספרות באמצעות הלא Biolשיטות ogical 6. השוואה של שתי נקודות הזמן האחרונות, וב69 82 שעות (איורים 2G ו2H, בהתאמה), מראה כי פיתוח של מבנים הגדולים מסוג הקיפודים נותר יציב למדי, כפי שצוין על ידי ההדמיה אותו השדה מדויק.
כדי להסביר מדוע מבנים אלה כמו קיפודים-בתנאים אלה בתרביות התאים נצפו, התחלנו ביטול רכיבי תקשורת כדי לקבוע אם ניתן יהיה לבודד המרכיבים החיוניים. גילה שמרכיב מרכזי ותוספת לתרבות התקשורת הסלולרי היה ציסטין, שעל ידי התהליך של אלימינציה זוהה סופו של דבר כמרכיב חיוני לתהליך ההרכבה העצמית. על ידי פישוט רכיבי הסינתזה (ראה איור 1), שסופו של דבר יכול להוות יחס גבוה היבט (ליניארי) מבנים בנוזל, שניתן לראות לאורך הזמן להפוך מצורת ננו-חלקיקים לטופס ליניארי, ללא הצורך של תאים, או כל אחד מ התא האחררכיבי תרבות (איורים 3 א-ג).
איור 4 מראה אפיון של מבני הרומן גילו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, כולל תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) לכידת ננו-חלקיקי חומר מוצאים ויוצרים ננו ליניארי (איור 4 א). תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורקים נציג (SEM) מוצגות לחומר מוצא CNPs, מבנים ליניארי נוצרו מהצירופים, והמבנים ליניארי שנוצרו מנחושת גופרתית חומר מוצא (איורים 4 ב-F, בהתאמה).
כדי לוודא שbiocomposites הכיל ציסטין או חומר המופק מציסטין כמרכיב ביולוגי חיוני של חומרים מרוכבים, המבנים הוקמו נותחו באמצעות EDX עם מיקרוסקופ SEM. צילומי מסך נציג מחומרים ניתחו מוצגים באיור 5. חשוב לציין, בעת השוואת CNPs וbiocomposites מCNPs, בולטמופיע שיא גופרית (איור 5), שאינו קיים בCNP החומר מוצא (איור 5 א). לbiocomposites באמצעות נחושת גופרתית כחומר מוצא (איור 5 ג), פסגות פחמן וחנקן מופיעות (איור 5D), אשר עולה בקנה אחד עם הנוכחות של ציסטין לbiocomposite זה.
בשלב זה, שיטה לשליטה באורך וגודל של חומרים מרוכבים בסינתזה לא זוהתה. עם זאת, כדי לחקור אם גודל ממוצע של מבנים יכול להיות נשלט לאחר סינתזה, biocomposites יניארי היו sonicated לתקופות שונות של זמן, כפי שמוצג באיור 6. עם זמן מוגבר של sonication, זה היה מראה כי הגודל הממוצע של biocomposites יניארי ירד, כ מוצג על ידי מיקרוסקופ שדה הבהיר (איורים 6 א-ד). כשיטת לריכוז והפרדת חומרים מרוכבים נוצרו, ניתן להשתמש בצנטריפוגה, וכפי שמוצג ב6E דמויות-G, גלולה גלויה ניתן לפתח תלות בכרכים וכוחות צנטריפוגה בשימוש.
1. תרשים איור נציג זרימת עיצוב סינתזת חלקיקים = נחושת Cu צירופים ו.; Cys = ציסטין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. היווצרות נציג של מבני biocomposite הנחושת בתרביות תאי גידול במוח עם תקשורת ותרבות תא שלמה. ניסוי נציג מעקב על סך של 82 שעות מוצגת בתרבית תאים המכילה תאי גידול במוח וCNPs (50 מיקרוגרם / מיליליטר). לוחות A ו- B מופעבארות התרבות בזמן 0, לאחר CNPs התיישבו לתחתית הבאר. לוחות CH להראות נקודות זמן שלאחר מכן בגיל 17, 24, 36, 49, 69, ו -82 שעות, בהתאמה. לוחות G ו- H מייצגים את אותו שדה וב69 82 שעות. כל התמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ brightfield כדי לשפר את הניגודיות של חומר נחושת. ברים סולם = ל+ B 100 מיקרון, 50 מיקרון לספירה, ו- 25 מיקרון לF + G. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. טרנספורמציה של CNPs לbiocomposites ליניארי. CNPs אוחדו עם ציסטין ומים כפי שמצוינת באיור 1 ובסעיף פרוטוקול בהיקף כולל של 7 מיליליטר. הלוח מציג את כלי הסינתזה בזמן 0, לוח ב 'מציג 3 שעות, וsh C הפנלOWS 6 שעות. תמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ brightfield עם סרגל קנה מידה שצוין (50 מיקרון). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. אפיון מיקרוסקופי אלקטרונים של biocomposites מסונתז לוח ():. TEM של CNP חומר מוצא (עגול) עם חומרים מרוכבים ליניארי יוצרים. פנלים (ב) ו- (ג) להראות אפיון של CNPs החל באמצעות SEM. לוח (C) הוא תמונה מוגדלת של (B). לוח (D) מראה SEM של חומרים מרוכבים שנוצרו מCNPs וציסטין. פנלים (E) ומשווקי מנועי חיפוש תכנית (F) של biocomposites נחושת גופרתי. לוח (F) הוא zoomeתמונה של ד (E). ברים סולם מצוינים בכל התמונות ו= 200 ננומטר ב (א), 1 מיקרון ב( ב), 500 ננומטר (C), 5 מיקרון (ד), 2 מיקרון ב( E), ומיקרון 1 ב( F ). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור EDX ניתוח 5. (SEM) של חומרים החל וחומרים מרוכבים ליניארי מסונתזים. תמונות מסך של דגימות שנסרקו SEM באמצעות הניתוח edx לתוכן בסיסי. לוח () = מתחיל CNPs; לוח (B) = biocomposites מCNPs וציסטין; לוח (C) = חומר נחושת גופרתית מתחיל, ולוח (D) = מרוכבים הלוך ושובסולפט מ 'הנחושת וציסטין. לתיוג שיא, C = פחמן, מ = חמצן, Cu = נחושת, S = גופרית, וN = חנקן. תוויות גדולות יותר לזהות יסודות הונחו מעל פסגות מפתח, כדי להקל על צפייה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. שינוי של גודל מרוכבים ליניארי ופוסט ריכוז סינתזה. מבנים לינארי מסונתזים מנחושת גופרתית היה sonicated עבור 0, 15, 30, או 60 דקות, בהתאמה, כפי שמוצג בלוחות (AD). תמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ brightfield עם בר סולם של 200 מיקרון מצויינים בכל התמונות. פנלים, צנטריפוגה ריכוז של biocomposites באמצעות (EG): 6 מיליליטר של מבנים ליניארי נגזרים מCNPs (<strong> E, משמאל) ונחושת גופרתית (E, מימין) מוצגת יישוב תחת כובד לאחר 10 דקות. עם 10 דקות של צנטריפוגה XG ב 500, גלולה דחוסה נוצר (F פנל). נפח קטן יותר (500 μl) של אותו החומר היה מרוכז, כפי שמוצג ב( פנל G) (מבנים נגזר CNP מוצגים במבנים הנגזר סולפט שמאל צינור ונחושת בצינור מהימין). אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר גרסה של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תוך הערכת השפעות רעילות פוטנציאליות של ננו כולל CNPs, זה היה ציין כי בטווח הארוך, CNPs הפכו מהפצת חלקיקים בתחילה יותר מפוזרת לצורה גדולה יותר, מצטברת (איור 2). במקרים מסוימים, תצורות מצטברות מאוד אלה שיוצרו בצלחת תרבית תאים, בתנאים ביולוגיים, יצרו תחזיות ליניארי ביותר מהצבירה המרכזית, מזכירות נחושת שתוארה קודם לכן מכילות "הקיפודים" 6. יש לציין כי בתנאים שמוצגים כאן, הריכוז של CNPs הוסיף לתאים היה תת-מרבית, ובכך שלא הרג את כל התאים בתרבות (ראה איור 2). מתצפיות הראשוניות אלה, ניסויים המשיכו לאחר מכן על ידי ביטול ברציפות יותר רכיבים של תנאי תרבית תאים (כוללים סופו של דבר את התאים עצמם) כדי למצוא את המרכיבים המרכזיים שנותרו נחוצים לסינתזה obiocomposites הנחושת ליניארי ו.
גילינו שציסטין, רכיב תוספת של תרביות תאים המקוריות, בשילוב עם CNPs בתנאים הביולוגיים הנכונים, עלול לגרום לשינוי של צורת nanoparticulate לbiocomposite יניארי מאוד שהכיל שתי מתכת ורכיבים ביוכימיים כפי שצוין על ידי הניתוח edx על ידי סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים של הדגימות מוכנות (איור 5). לפיכך, גופרית, שאינה קיים בחומר CNP מתחיל, תערוכות שיא בולט בbiocomposites מסונתז, צוינה כי שתי הנחושת ורכיבים של ציסטין החומר ביוכימי חיוניים למבנים ליניארי נוצרו.
זה היה הראה עוד, כי על ידי שימוש בתנאי סינתזה דומים, אבל החלפת CNPs עם נחושת גופרתית, יכול גם להיווצר biocomposites יניארי מאוד. למעשה, סינתזה באמצעות נחושת גופרתית וציסטין נטתה לגרום ל" נקי "enמוצרי ד, שבשום CNPs unreacted היו אי פעם בהווה, שכן נחושת גופרתית הוא מסיס באופן מלא במים, ששימש כממס בכל הסינתזות דיווחו כאן. יתר על כן, biocomposites נחושת גופרתי-הצטיין מחומרים מרוכבים נגזר CNP בשמירת צבע כחול שהיה לכאורה על צנטריפוגה של החומר.
קבוצות אחרות לא למדו בעבר מתחמי הנחושת-ציסטין ומוגדרים כמה תכונות כימיות מפתח. לדוגמא, Kahler et al. הוכיח ההיווצרות של קומפלקסי הנחושת-ציסטין בצורה של סיבים דקים, שניכרה על ייבוש אבל לא יציבים בתמיסה 13. בדוגמאות אחרות, מחקרי complexation עם L-ציסטין וקטיונים מתכת שונים מאשרים היווצרות מורכבת נחושת וציסטין במדיום המימי 14 ומתחמים נוצרו עשויים להיות mononuclear או polynuclear, עם הגופרית מציסטין תורמת להיווצרות המורכבת 15. מספר המחקרים דו"חאינטראקציות בין אד ציסטין ונחושת במערכות ביולוגיות. לדוגמא, ב- pH הפיזיולוגי, נחושת (II) היונים לתאם עם היסטידין וציסטין בפלזמה מדומה ליצירת קומפלקסים 16, וגופרית המכילים חומצות אמינו הוצגה להיות מגן מפני רעילות נחושת באפרוחים 17. ממצאים אלה תומכים בכך את התפקיד החיוני של ציסטין בcomplexing עם הנחושת מתחילה מהותית בשיטות הסינתזה שלנו ליצירת biocomposites ליניארי.
בשלב זה אסטרטגית סינתזה טרם זוהתה שיכול ישירות לשלוט על אורך biocomposites יניארי הבודד שמוצג כאן. עם זאת, השלבים הקריטיים שזוהו בסינתזה המתוארת כוללים: 1) פיזור טוב על ידי sonication של חומרי המוצא במקרה של סינתזת שילוב CNPs; 2) שימוש בCNPs מוכן טרי, נחושת גופרתית, וציסטין לסינתזה יעילה של חומרים מרוכבים; 3) המאפשר סינתזה בבקבוק להישאר ללא הפרעה בincubatאו לפחות 6 שעות; תנאים "תגובת יתר" ו- 4) הימנעות שבו מסועפים מסוג "קיפודים", צורת מרוכבים מצטברים.
לאחר הסינתזה הושלמה, זה היה מראה כי sonication של המבנים יכול להיות מנוצל ביעילות כדי להקטין את הגודל הממוצע (אורך) של המבנים. Sonicating להכנת מבנים קטנים יותר עשויים לסייע ביישומים כגון ספיגה סלולארי או אינטראקציות biocomposite-סלולארי אחרות. כפי שכבר דווח בעבר, לחייב את התייצבות CNPs במהלך סינתזה זו על ידי שילוב עם ציסטין שינה את פוטנציאל זטה נמדד מחיובי לצורה פחות טעון (שלילית) 9. שינוי בחיוב זה עשוי לעזור להסביר מדוע הרוכבים יצרו להראות צבירה מעט מאוד בצורה יבשה או התקשורת נוזלית, מה שהופך את הטיפול במבנים הרבה יותר נוח.
מאז הסינתזה המדווחת של מבנים הנגזר סולפט אלה CNP-נגזרים והנחושת מתבצעת out בתקשורת נוזלית, שצפוי כי התהליך עשוי להיות ניתן להרחבה, כלומר עם היחס הנכון של מרכיבים ותנאי סינתזה, מתכון סינתזת המ"ל משמש כאן יכול להיות מדורגים למעלה או למטה כדי לכלול מאות רבות של מיליליטר או יותר, ו היה וכך יהיה צפוי להניב מוצר סופי יותר, גם כן. בשל מרכיב מתכת (נחושת) של biocomposites אלה, זה די פשוט להתרכז מוצר מסונתז על ידי צנטריפוגה (איור 6). Biocomposites נוצר מCNP חומר מוצא לשמור צבע כהה יותר מרוכז פעם אחת לגלולה, אולי בשל חלקיקי unreacted תחמוצת נחושת (איור 6). לשם השוואה, יש לי biocomposites נחושת גופרתי כאשר מרוכז בגלולת צבע כחול, עולה בקנה אחד עם מאפיינים של נחושת גופרתית עם רמות שונות של לחות 18.
סינתזת הרומן דיווחה כאן היא גם להרחבה במובן זה שלין העצמי התאספומבנים בקנה מידה מאוזן בקנה מידה ננו למייקרו-בקנה מידה כפי שמוצגים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (איור 4) ומסורתי מיקרוסקופ אור הלבנה (איורים 3 ו -6). זה מעניין לציין כי microfibers חלבון סליל מפותל לאחרונה, מהונדס דווחו שיכול לשלב כורכומין שאיפשר לסיבים הוקמו כדי להיות שנצפו תחת תאורת הקרינה 19. אסטרטגיות דומות ייתכן שניתן תהיה לשלב מפרידי או סוכני תיוג לרוכבים ליניארי דיווחו כאן כדי לספק ייצור של מבנים גדולים יותר ו / או שיפורים להדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini Vortexer | VWR (https://us.vwr.com) | 58816-121 | |
| CO2 Incubator Model # 2425-2 | VWR (https://us.vwr.com) | Contact vendor | Current model calalog # 98000-360 |
| Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge) | Labnet (http://labnetinternational.com/) | C2500-R | Model Prism R |
| Cell Culture Centrifuge Model Z323K | Labnet (http://labnetinternational.com/) | Contact vendor | Current model Z206A catalog # C0206-A |
| Sonicator (Ultrasonic Cleaner) | Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/) | 1510R-MTH | |
| Balance | Sartorius (http://dataweigh.com) | Model CP225D similar model CPA225D | |
| Olympus IX51 Inverted Light Microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Olympus DP71 microscope digital camera | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| external power supply unit - white light for Olympus microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | TH4-100 | |
| 10X, 20X, and 40X microscope objectives | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html) | model S-4800 | |
| Transmission Electron Microscope | Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html) | model Libra 120 | |
| Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco (http://envirco-hvac.com) | model PNG62675 | Used for sterile cell culture technique |
References
- Klinman, J. P. The copper-enzyme family of dopamine beta-monooxygenase and peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase: resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation. The Journal of biological chemistry. 281, 3013-3016 (2006).
- Uauy, R., Olivares, M., Gonzalez, M. Essentiality of copper in humans. The American journal of clinical nutrition. 67, 952S-959S (1998).
- Karlsson, H. L., Cronholm, P., Gustafsson, J., Copper Moller, L. oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes. Chemical research in toxicology. 21, 1726-1732 (2008).
- Parekh, G., et al. Layer-by-layer nanoencapsulation of camptothecin with improved activity. International journal of pharmaceutics. 465, 218-227 (2014).
- Harrington, M. J., Masic, A., Holten-Andersen, N., Waite, J. H., Fratzl, P. Iron-clad fibers: a metal-based biological strategy for hard flexible coatings. Science. 328, 216-220 (2010).
- Keyson, D., et al. CuO urchin-nanostructures synthesized from a domestic hydrothermal microwave method. Materials Research Bulletin. 43, 771-775 (2008).
- Liu, B., Zeng, H. C. Mesoscale organization of CuO nanoribbons: formation of 'dandelions'. J Am Chem Soc. 126, 8124-8125 (2004).
- Peng, M., et al. Controllable synthesis of self-assembled Cu2S nanostructures through a template-free polyol process for the degradation of organic pollutant under visible light. Materials Research Bulletin. 44, 1834-1841 (2009).
- Deodhar, S., Huckaby, J., Delahoussaye, M., DeCoster, M. A. High-Aspect Ratio Bio-Metallic Nanocomposites for Cellular Interactions. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 64, 012014 (2014).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12, 47-53 (2010).
- Wiogo, H. T., Lim, M., Bulmus, V., Yun, J., Amal, R. Stabilization of magnetic iron oxide nanoparticles in biological media by fetal bovine serum (FBS). Langmuir. 27, 843-850 (2011).
- Yunker, P. J., Still, T., Lohr, M. A., Yodh, A. G. Suppression of the coffee-ring effect by shape-dependent capillary interactions. Nature. 476, 308-311 (2011).
- Kahler, H., Lloyd Jr, B., Eden, M. Electron Microscopic and Other Studies on a Copper–Cystine Complex. The Journal of Physical Chemistry. 56, 768-770 (1952).
- Furia, E., Sindona, G. Complexation of L-cystine with metal cations. Journal of Chemical & Engineering Data. 55, 2985-2989 (2010).
- Hawkins, C., Perrin, D. Polynuclear Complex Formation. II. Copper (II) with Cystine and Related Ligands. Inorganic Chemistry. 2, 843-849 (1963).
- Hallman, P., Perrin, D., Watt, A. E. The computed distribution of copper (II) and zinc (II) ions among seventeen amino acids present in human blood plasma. Biochem. J. 121, 549-555 (1971).
- Jensen, L. S., Maurice, D. V. Influence of sulfur amino acids on copper toxicity in chicks. The Journal of nutrition. 109, 91-97 (1979).
- Lee, Y., Choi, J. R., Lee, K. J., Stott, N. E., Kim, D. Large-scale synthesis of copper nanoparticles by chemically controlled reduction for applications of inkjet-printed electronics. Nanotechnology. 19, 415604 (2008).
- Hume, J., et al. Engineered coiled-coil protein microfibers. Biomacromolecules. 15, 3503-3510 (2014).
