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Bioengineering

Generazione di scalabili, Metallic Tacchi-Aspect nanocompositi Rapporto in un Biologica Liquid Media

doi: 10.3791/52901 Published: July 8, 2015

Summary

Qui vi presentiamo un protocollo per sintetizzare nuovi, ad alto rapporto di aspetto biocompositi in condizioni biologiche e in mezzi liquidi. I biocompositi scala da nanometri a micrometri di diametro e lunghezza, rispettivamente. Nanoparticelle di rame (CNPS) e solfato di rame in combinazione con cistina sono le componenti chiave per la sintesi.

Abstract

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere la sintesi di due nuovi biocompositi con strutture ad alto rapporto-aspetto. I biocompositi consistono di rame e cistina, sia con nanoparticelle di rame (CNPS) o solfato di rame contribuendo componente metallico. Sintesi è condotta in un liquido in condizioni biologiche (37 ° C) e la forma compositi autoassemblati dopo 24 ore. Una volta formati, questi composti sono altamente stabili in entrambi i liquidi e in una forma secca. I compositi ridimensionare dal nano alle micro gamma di lunghezza, e da pochi micron a 25 nm di diametro. Emissione di campo microscopia elettronica a scansione con spettroscopia a dispersione di energia dei raggi X (EDX) ha dimostrato che lo zolfo è presente nelle strutture lineari NP-derivati, mentre era assente dal materiale di partenza CNP, confermando cistina come fonte di zolfo nei nanocompositi finali . Durante la sintesi di questi nano e micro-compositi lineari, una vasta gamma di lunghezze di structures è formata nel serbatoio di sintesi. Sonicazione della miscela liquida dopo la sintesi è stata dimostrata per aiutare a controllare dimensione media delle strutture diminuendo la lunghezza media con un tempo di sonicazione. Poiché le strutture formate sono altamente stabili, non agglomerato, e si formano in fase liquida, centrifugazione può essere utilizzato anche per aiutare a concentrare e segreganti compositi formati.

Protocol

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1. Progettazione di esperimenti

  1. Determinare il volume di nanocompositi rame necessari per la sintesi. Su tale base, scegliere un numero di flaconi di piccolo volume (25 centimetri 2), o flaconi grandi come indicato di seguito nella preparazione dei materiali.
  2. Per questa sintesi, utilizzare un incubatore a 37 ° con il 5% di CO 2 e almeno il 40% di umidità. Assicurarsi che tale incubatrice è disponibile e che non verrà ripetutamente disturbato durante il periodo di sintesi (circa 24 ore).
    ATTENZIONE: l'apertura e la chiusura ripetuta dell'incubatrice sarà certamente causare sbalzi di temperatura che possono provocare la sintesi alterata delle strutture nanocompositi.

2. Preparazione dei Materiali

  1. Preparare tutti materiali freschi prima dell'inizio di un esperimento, aggiungendo materiali solidi a solventi destra prima sintesi deve iniziare. Mantenere soluzioni stock di cistina e di partenza di rame materiale a liquido per tempi lunghi brima l'esperimento non è raccomandato e può portare a risultati variabili. Una volta aperto dal fornitore, tenere materiali secchi avvolgendo la parte superiore del contenitore con parafilm partenza.
    Nota: il seguente protocollo viene utilizzato come esempio per la reazione in 25 cm 2 cella pallone di coltura con 7 ml di cistina, 6643 ml di acqua sterile, e 350 ml di CNPS.
  2. Preparare una soluzione di 2 mg / ml di nanoparticelle rame pesando almeno 2 mg di CNPS. Indossare guanti monouso durante questa fase per evitare possibili contatti di CNPS con la pelle. Mettere le nanoparticelle in un vuoto sterile 16 ml di vetro fiala.
    1. Per la fiala contenente CNPS, aggiungere acqua deionizzata sterile il volume appropriato per ottenere una soluzione 2 mg / ml e agitare la soluzione per 20 sec per fornire dispersione delle nanoparticelle prima dell'inizio di sintesi (almeno 1 ml di volume totale è raccomandato). Non riempire il più di metà strada fiala con l'acqua come questo inibisce la miscelazione con il vortex. CNPS will risolvere rapidamente al fondo del flacone e apparirà di colore scuro (grigio e il nero).
    2. Sonicare la soluzione CNP per 17 minuti a temperatura ambiente per fornire la dispersione massima di CNPS prima dell'inizio della sintesi. Controllare periodicamente per assicurarsi che CNPS stia mescolando causa di ultrasuoni. Dopo una sonicazione successo, CNPS rimangono sospese in soluzione per almeno 30 minuti e la soluzione sarà di colore scuro.
  3. Pesare massa sufficiente di cistina per ottenere una soluzione / ml 72,9 mg per la sintesi. Poiché cistina non è direttamente solubile in acqua, posizionare la cistina pesati in un recipiente di pesata antistatico.
    1. Per la pesatura recipiente contenente cistina, aggiungere sufficiente volume di sterili, 1 M NaOH, in modo che la cistina scioglie completamente. Ad esempio, sciogliere 7,29 mg di cistina completamente in 100 ml di 1 M NaOH, per fare un / ml soluzione 72,9 mg.
    2. Per mantenere condizioni di sterilità, eseguire questo passaggio in una cappa coltura tissutale flusso sterile.
      ATTENZIONE: NaOHa 1 M concentrazione caustica, così indossare guanti monouso durante questa fase per evitare il contatto di NaOH concentrato con la pelle
  4. Lavorando in una cappa coltura tissutale sterili, aggiungere 7 ml di cistina con 6643 ml di acqua sterile alla beuta di sintesi sterili prima, e lasciate incubare per 30 min in incubatore a 37 ° C con il tappo pallone ventilato (sciolto) per fornire efficace miscelazione. Risospendere il / soluzione CNP ml 2 mg vortexando per 30 secondi, in quanto CNPS sarà risolto dopo la fase di ultrasuoni.
    1. Aggiungere la soluzione CNP sufficiente al pallone di sintesi (con tecnica sterile) per mantenere i seguenti rapporti tra i componenti: combinare 1 parti cistina, 50 parti CNPS, e 949 parti di acqua sterile in 25 cm 2 pallone di coltura cellulare per iniziare la sintesi. Ad esempio, per un volume di sintesi 7 ml, unire 7 ml di soluzione madre cistina, 350 ml di CNPS, e 6643 ml di acqua sterile. Rimettere il tappo sul pallone e stringere in modo che sia secure.
    2. Dopo che unisce tutti i componenti per la sintesi, mescolare delicatamente nel pallone agitando 4-5 volte. Posizionare beuta nel CO 2 incubatore e sfiatare la beuta allentando il tappo in modo che ci sia lo scambio di gas dentro e fuori del pallone durante la sintesi.
  5. Lasciare che la sintesi di eseguire in incubatrice per circa 24 ore. Durante la sintesi, si può osservare, con microscopia e occhio, formazione di compositi altamente lineari.
    Nota: Il processo di formazione delle strutture può accadere improvvisamente nel senso che le strutture sono inizialmente difficili da individuare, quindi aspetto procede rapidamente a una densità crescente. La formazione può quindi avvenire prima 24 ore. Il processo può anche essere osservato ad occhio volta strutture diventano più grandi e loro densità aumenta. Mentre la generazione delle strutture può essere osservato nel tempo al microscopio e occhio a successivi punti di tempo, interrompendo continuamente le condizioni di sintesi e temperatura porterà a scarsarisultati di sintesi.
  6. Terminare sintesi di biocompositi dal strettamente tappatura matraccio sintesi e memorizzare il vaso in frigorifero (4 ° C). Strutture, una volta generati, rimangono stabili in questa forma per almeno un anno. Etichettare il pallone con condizioni di sintesi, compresi i componenti utilizzati, la data della sintesi, e il tempo di incubazione della sintesi prima della terminazione.

3. Sintesi Utilizzando solfato di rame

  1. Eseguire la sintesi di auto-assemblaggio, sostituendo CNPS con sale solfato di rame. Usando una tecnica sterile, sciogliere almeno 2 mg di solfato di rame in quantità sufficiente di acqua deionizzata sterile per ottenere uno / ml soluzione 2 mg. I cristalli di solfato di rame facilmente andare in soluzione a questa concentrazione, ma vortice il flaconcino se necessario, e ispezionare ad occhio per garantire che tutti i cristalli sono dissolti.
  2. Dopo la preparazione del solfato di rame, effettuare sintesi come descritto in precedenza, ma sostituendo CNPS con solfato di rame.
    Nota: nanocompositi auto-assemblati con solfato di rame come materiale di partenza sono stati trovati ad essere molto più consistente in forma finale che per le strutture sintetizzate da CNPS.
  3. Terminare la sintesi di biocompositi solfato di rame come per i compositi CNP (punto 2.6) e archiviarli a lungo termine a 4 ° C.

4. Caratterizzazione e manipolazione dei biocompositi Post-sintesi

  1. Caratterizzare biocompositi derivati ​​da CNPS e da solfato di rame dal bianco al microscopio ottico 9 e microscopia elettronica 9.
    1. Per la caratterizzazione e l'ispezione di biocompositi post-sintesi mediante microscopia a luce bianca, utilizzare un microscopio invertito come compositi si depositerà alla superficie inferiore del pallone entro pochi minuti dalla posa del matraccio piatta, e può quindi essere messo a fuoco. Utilizzare l'impostazione in campo chiaro sul microscopio per massimizzare il contrasto tra biocompositi e il mezzo liquido. Compositi derivati ​​da CNPS e poliziottoper solfato saranno entrambi apparire chiaro opaco colore, ma che non hanno reagito aggregati CNP appare molto scuro.
      1. Utilizzare una fotocamera digitale collegata al microscopio per catturare le immagini dei compositi. Viene osservata una gamma di lunghezze per le singole strutture.
    2. Per la caratterizzazione e l'ispezione di biocompositi post-sintesi e dopo conservazione a 4 ° C, permettono fiaschi di venire a temperatura ambiente per almeno 15 minuti come fiaschi formeranno condensazione inizialmente dopo la rimozione dal frigorifero, che oscurare efficace focalizzazione nello svolgimento immagini di microscopia. Dopo aver lasciato il raggiungimento dell'equilibrio di RT, pulire le superfici superiore e inferiore del pallone con un tovagliolo di carta pulito per ottimizzare la qualità delle immagini di microscopia.
    3. Quando si lavora con o immagini compositi che sono stati conservati a lungo termine, il vortice fiasco per 30 sec a dissociarsi ciuffi di composti che si formano mentre in frigorifero. Dopo vortex, ispezionare le strutture con un microfono invertitoROSCOPE per garantire che gli aggregati sono dissociate, e ripetere vortex se necessario.
    4. Utilizzare invertita microscopia luce bianca per valutare l'efficacia della sintesi per un dato esperimento utilizzando CNPS. Ad esempio, documentare la presenza o l'assenza di non reagito CNPS in fiaschi di sintesi utilizzati per biocompositi CNP-derivati ​​da palloni con diversi parametri come il tempo di sintesi.
      Nota: individuale CNPS sono troppo piccoli per osservare con un microscopio ottico, ma non reagito CNP aggregati appariranno come tondeggiante e oggetti scuri, in contrasto con il CNP-compositi sintetizzati con successo che avrà un rapporto di alta aspetto, forma lineare, e avrà una gamma di differenti lunghezze. Evitare di realizzare sintesi per troppo tempo di un periodo di tempo prima della terminazione, come questo si tradurrà in strutture di tipo altamente ramificate "riccio", che sono difficili da disperdere in singole strutture volta formate.
    5. Utilizzare invertita microscopia ottica bianca per valutare l'efficaciadella sintesi per un dato esperimento utilizzando solfato di rame. Poiché solfato di rame va completamente in soluzione con questo protocollo, la soluzione apparirà meno scuro rispetto alla soluzione dalla sintesi utilizzando CNPS. Documentare la dimensione e la portata dei compositi solfato di rame confrontando palloni con differenti condizioni di sintesi, quali il tempo di sintesi prima della terminazione.
      Nota: composti sintetizzati con successo mostreranno una gamma di diverse lunghezze. Evitare di realizzare sintesi per troppo tempo di un periodo di tempo prima della terminazione, come questo si tradurrà in aggregati altamente ramificati di compositi, alcuni dei quali saranno "urchin-like" nella struttura, e che sono difficili da disperdere in singole strutture volta formate .
  2. Per concentrare biocompositi post-sintesi, soluzioni di centrifugazione di compositi in una provetta da centrifuga. Aggiungere 6 ml di una delle strutture CNP-derivati ​​o strutture solfato derivato rame in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare per 10 minutia 500 xg a RT per formare un pellet. Per i volumi più piccoli, aggiungere 500 ml di strutture in soluzione di 0,6 ml tubi di dimensioni. Centrifugare a 2.000 xg a temperatura ambiente per almeno 10 minuti per formare un pellet.
    1. Dopo centrifugazione per un tempo sufficiente (almeno 10 min per microfuges), salvare il pellet osservabile nella parte inferiore del tubo dove le strutture sono concentrati rimuovendo accuratamente il liquido supernatante sopra il pellet. Strutture Biocomposite derivate da solfato di rame appaiono di colore blu e strutture derivate da CNPS sono più scuro (grigio al nero).
    2. Aggiungere più compositi di questo tubo e ripetere il processo nello stesso tubo di concentrare strutture se desiderato. Per disperdere i pellets concentrati, aggiungere il volume desiderato di soluzione al tubo, e vortex per 10-30 sec.
  3. Strutture Sonicare volta formate, per spostare la dimensione media della popolazione (lunghezza) delle strutture a valori più bassi. Strutture Luogo in acqua deionizzata sterile e sonicare a Least 10 min. Utilizzando questo processo, nel corso del tempo, strutture vengono frammentati e più piccola della lunghezza media (vedi figura 6 del testo). Le modifiche ai documenti di dimensioni compositi con diversi tempi di sonicazione usando un microscopio a luce bianca invertito e fotocamera digitale.

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Representative Results

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La figura 1 mostra una schematica diagramma di flusso delle fasi di sintesi per formare i biocompositi lineari descritti in questo lavoro. CNPS o rame solfato come materiali di partenza sono combinati con acqua sterile per formare un / ml soluzione 2 mg, questa soluzione viene miscelata e sonicato per fornire un impasto omogeneo, e questa soluzione di rame viene quindi miscelata nel seguente rapporto per sintesi: 949 parti sterile acqua: 50 parti miscela di rame: cistina soluzione stock 1 parte. I volumi effettivi possono essere aumentate o diminuite secondo questi rapporti per scalare verso l'alto o ridimensionare il rendimento sintesi finale. Dopo incubazione per almeno 2 ore come indicato, strutture Biocomposite lineari sono formate che nel tempo possono essere osservati al microscopio normale luce bianca o dall'occhio come i cambiamenti soluzione liquida di aspetto.

La figura 2 mostra un risultato rappresentativo dalla scoperta iniziale di tali strutture lineari in completa colture cellulari over un periodo di 82 ore. Il nostro laboratorio stava effettuando valutazione del potenziale tossicità dei diversi nanomateriali, compresi CNPS sulle cellule normali e cellule tumorali e le cellule mostrati in figura 2 sono una linea di cellule tumore al cervello in rapida crescita da ATCC (CRL-2020). Un supplemento chiave per il supporto completo utilizzato per queste cellule è cistina, che si è rivelato essere il componente essenziale per la scoperta del perché queste strutture lineari si formavano nelle culture (vedi sotto e sezione di discussione). Da una dispersione ancora iniziale CNPS che rapidamente si aggregano in microstrutture (Figure 2A e 2B), nel tempo le particelle più piccole vengono cancellate e aggregati più grandi sono formati (Figure 2C e 2D). Infine, gli aggregati più grandi con belle, strutture lineari appaiono negli stessi pozzetti (Figure 2E-H), che formano il "riccio" strutture di tipo precedentemente riportati in letteratura utilizzando non biolMetodi ogical 6. Confronto tra gli ultimi due punti di tempo, a 69 e 82 ore (Figure 2G e 2H, rispettivamente), mostra che lo sviluppo delle grandi strutture di tipo riccio di rimane abbastanza stabile, come indica l'imaging stesso campo esatto.

Per spiegare il motivo per cui sono state osservate queste strutture di riccio-come in queste condizioni nelle colture di cellule, abbiamo iniziato eliminando componenti multimediali per determinare se gli elementi essenziali potrebbero essere isolati. Abbiamo scoperto che un componente chiave e supplemento al mezzo di coltura cellulare è stata cistina, che per il processo di eliminazione è stata infine individuata come componente essenziale per il processo di auto-assemblaggio. Semplificando i componenti di sintesi (vedi Figura 1), si potrebbe infine formare elevato rapporto di aspetto (lineare) strutture a liquido, che può essere visualizzata nel tempo per trasformare dalla forma di nanoparticelle di forma lineare, senza la necessità di celle o qualsiasi l'altra cellacomponenti coltura (Figure 3A-C).

Figura 4 mostra caratterizzazione delle scoperte nuove strutture utilizzando la microscopia elettronica, tra cui immagine al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) cattura nanoparticelle materiale di partenza e formare nanostrutture lineari (Figura 4A). Rappresentante elettronico a scansione (SEM) immagini sono mostrate per materiale di partenza CNPS, strutture lineari formati da i PN e strutture lineari formate da solfato di rame materiale di partenza (Figure 4B-F, rispettivamente).

Per verificare che le contenevano biocompositi cistina o materiale cistina-derivato come componente biologica essenziale dei compositi, le strutture formate sono stati analizzati utilizzando EDX con la microscopia SEM. Schermate rappresentativi di materiali analizzati sono mostrati in figura 5. È importante sottolineare che, quando si confrontano CNPS e biocompositi dalla CNPS, un importanteappare picco zolfo (Figura 5B), che non è presente nel materiale di partenza CNP (Figura 5A). Ai biocompositi utilizzando solfato di rame come materiale di partenza (Figura 5C), picchi di carbonio e di azoto (Figura 5D), che è coerente con la presenza di cistina per questa Biocomposite.

Al momento, non è stato individuato un metodo per controllare la lunghezza e le dimensioni dei compositi durante la sintesi. Tuttavia, per indagare se la dimensione media delle strutture potrebbe essere controllata dopo la sintesi, biocompositi lineari stati sonicato per diversi periodi di tempo, come mostrato in figura 6. Con maggiore tempo di sonicazione, è stato dimostrato che la dimensione media delle biocompositi lineari diminuita, come dimostrato mediante microscopia in campo chiaro (figure 6A-D). Come metodo per concentrare e segregare compositi formati, centrifugazione può essere utilizzato, e come illustrato nelle figure 6E-G, Un pellet visibile può essere sviluppato a seconda dei volumi e le forze di centrifugazione utilizzati.

Figura 1
Figura 1. diagramma di flusso rappresentante del design sintesi Cu NP nanoparticelle di rame =.; Cys = cistina. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. formazione Rappresentante di strutture Biocomposite rame in colture di cellule tumorali cerebrali con completa terreni di coltura delle cellule. Un esperimento rappresentante rintracciato su un totale di 82 ore è mostrato in coltura cellulare contenente cellule tumorali cerebrali e CNPS (50 mg / ml). Pannelli A e B spettacoloi pozzetti di coltura in tempo 0, dopo CNPS hanno depositata sul fondo del pozzo. Pannelli CH Mostra successivi momenti a 17, 24, 36, 49, 69, e 82 ore, rispettivamente. Pannelli G e H rappresentano lo stesso campo a 69 e 82 ore. Tutte le immagini sono state ottenute usando la microscopia campo chiaro per aumentare il contrasto di materiale di rame. Scala bar = 100 micron per A + B, 50 micron per CE, e 25 micron per F + G. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Trasformazione di CNPS per biocompositi lineari. CNPS stati combinati con cistina e acqua come indicato in Figura 1 e in sezione del protocollo con un volume totale di 7 ml. Un pannello mostra il vaso di sintesi al tempo 0, pannello B mostra 3 ore, e il pannello C shOWS 6 ore. Le immagini sono state ottenute utilizzando la microscopia in campo chiaro con barra di scala indicato (50 micron). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. La microscopia elettronica caratterizzazione di biocompositi sintetizzati Panel (A):. TEM di CNP materiale di partenza (e ritorno) con le formando composti lineari. Pannelli (B) e (C) mostrano caratterizzazione del CNPS iniziare con SEM. Panel (C) è una foto ingrandita di (B). Pannello (D) mostra SEM di compositi formati da CNPS e cistina. Pannelli (E) e (F) mostrano SEM delle biocompositi solfato di rame. Panel (F) è un zoomed immagine di (E). Barre di scala sono indicati in tutte le immagini e = 200 nm in (A), 1 micron (B), 500 nm in (C), 5 micron (D), 2 micron (E), e 1 micron (F ). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. EDX (SEM) analisi delle materie prime e compositi lineari sintetizzati. Istantanee dello schermo del SEM campioni sottoposti a scansione utilizzando l'analisi EDX per i contenuti elementare. Panel (A) = a partire CNPS; Panel (B) = biocompositi da CNPS e cistina; Panel (C) = materiale di solfato di rame di partenza, e Panel (D) = compositi from solfato di rame e cistina. Per l'etichettatura di picco, C = carbonio, O = ossigeno, Cu = rame, S = zolfo e N = azoto. Etichette più grandi per l'identità elementare sono stati collocati sopra i picchi fondamentali per qualità di visione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Modifica size composito lineare e sintesi concentrazione postale. Strutture lineari sintetizzati da solfato di rame sono stati sonicato per 0, 15, 30, o 60 minuti, rispettivamente, come mostrato in pannelli (AD). Le immagini sono state ottenute utilizzando la microscopia in campo chiaro con barra di scala di 200 micron indicati in tutte le immagini. Pannelli (EG), la concentrazione di biocompositi mediante centrifugazione: 6 ml di strutture lineari derivate da CNPS (<strong> E, a sinistra) e solfato di rame (E, a destra) sono mostrati decantazione per gravità dopo 10 min. Con 10 min di centrifugazione a 500 xg, a pellet compattato viene formato (pannello F). Un volume più piccolo (500 microlitri) dello stesso materiale è concentrata come mostrato in (pannello G) (strutture CNP-derivati ​​vengono mostrati nel tubo e rame solfato strutture derivate sinistra nel tubo di destra). prego qui per visualizzare un grande versione di questa figura.

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Discussion

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Nel valutare potenziali effetti tossici di nanomateriali compreso CNPS, è stato osservato che nel lungo termine, CNPS furono trasformati da una distribuzione di particelle inizialmente più dispersa ad una forma aggregata maggiore (Figura 2). In alcuni casi, queste formazioni altamente aggregati che sono stati prodotti nel piatto di coltura cellulare, in condizioni biologiche, formate proiezioni altamente lineari da dell'aggregato centrale, che ricordano rame precedentemente descritto contengono "ricci" 6. Va rilevato che nelle condizioni indicate in figura, la concentrazione di CNPS aggiunto alle cellule era sub-massimale, quindi non uccidere tutte le cellule in coltura (vedere Figura 2). Da queste prime osservazioni, gli esperimenti sono stati poi continuato eliminando successivamente più componenti delle condizioni di coltura cellulare (tra cui in ultima analisi, le cellule stesse) per trovare i componenti chiave rimanenti necessari per la sintesi of biocompositi rame lineari.

Abbiamo scoperto che cistina, un componente integrato delle colture cellulari originali, quando combinato con CNPS alle condizioni biologiche corrette, potrebbe provocare la trasformazione della forma nanoparticelle in un biocomposite altamente lineare che conteneva sia il metallo e componenti biochimici come indicato da analisi EDX microscopio elettronico a scansione dei campioni preparati (Figura 5). Così, zolfo, che non è presente nel materiale di partenza CNP, mostra un picco significativo nei biocompositi sintetizzati, indicando che sia in rame e componenti del materiale cistina biochimica sono essenziali per le strutture lineari formate.

È stato inoltre dimostrato che utilizzando condizioni di sintesi simili, ma sostituendo CNPS con solfato di rame, biocompositi altamente lineari possono anche essere formate. Infatti, la sintesi utilizzando solfato di rame e cistina tendeva a provocare "pulito" end prodotti, in quanto non reagito CNPS erano sempre presenti, poiché il solfato di rame è completamente solubile in acqua, che è stato utilizzato come solvente in tutte le sintesi qui riportati. Inoltre, biocompositi rame solfato si sono distinti dai compositi CNP-derivati ​​a mantenere un colore blu che era evidenti dalla centrifugazione del materiale.

Altri gruppi hanno già studiato complessi di rame-cistina e definito alcune proprietà chimiche fondamentali. Ad esempio, Kahler et al. Hanno dimostrato la formazione di complessi di rame-cistina in forma di fibre sottili, che erano evidenti dopo essiccamento ma instabile in soluzione 13. In altri esempi, studi di complessazione con L-cistina e differenti cationi metallici conferma la formazione del complesso di rame e cistina in un mezzo acquoso 14 e complessi formati possono essere mononucleare o polinucleari, con lo zolfo cistina contribuendo alla formazione del complesso 15. Una serie di studi hanno rapportoEd interazioni fra cistina e rame nei sistemi biologici. Ad esempio, a pH fisiologico, di rame (II) ioni coordinarsi con istidina e cistina nel plasma simulato per formare complessi 16 e zolfo contenenti amminoacidi hanno dimostrato di essere protettivo contro la tossicità del rame in pulcini 17. Questi risultati supportano quindi il ruolo essenziale di cistina in complessare con materiale di partenza di rame nei nostri metodi di sintesi per formare biocompositi lineari.

A questo punto una strategia di sintesi non è stato ancora identificato che può controllare direttamente la lunghezza dei singoli biocompositi lineari mostrati qui. Tuttavia, le fasi critiche individuate nella sintesi descritta includono: 1) buona dispersione mediante sonicazione dei materiali di partenza nel caso della sintesi incorporare CNPS; 2) usare di appena preparato CNPS, solfato di rame, e cistina per un'efficace sintesi di materiali compositi; 3) che permette la sintesi nel pallone di rimanere indisturbati nel incubato per almeno 6 ore; e 4) evitando condizioni di "over-reazione", in cui si diramavano tipo "riccio", forma compositi aggregati.

Dopo sintesi viene completata, è stato dimostrato che sonicazione delle strutture può essere utilizzata efficacemente per diminuire la dimensione media (lunghezza) delle strutture. Sonicating per rendere le strutture più piccole può essere di aiuto in applicazioni quali l'assorbimento delle cellule o altre interazioni Biocomposite-cellulare. Come è stato riportato in precedenza, caricare stabilizzazione del CNPS durante questa sintesi, combinando con cistina alterato il potenziale zeta misurata da positivo a un modulo 9 meno carica (negativo). Questo cambiamento responsabile può aiutare a spiegare il motivo per cui i composti formati mostrano molto poco aggregazione nella forma disidratata o liquidi, il che rende la gestione delle strutture molto più conveniente.

Poiché la sintesi riportata di queste strutture solfato derivato rame CNP-derivati ​​e viene effettuata out in mezzi liquidi, si prevede che il processo può essere altamente scalabile, il che significa che con il corretto rapporto dei componenti e condizioni di sintesi, la sintesi ricetta millilitro usato qui potrebbe essere scalata su o giù per includere molte centinaia di millilitri o più, e sarebbe dunque verosimilmente produrre prodotto più finale, pure. A causa del componente metallico (rame) di questi biocompositi, è abbastanza semplice concentrare prodotto sintetizzato mediante centrifugazione (Figura 6). Biocompositi formati da CNP materiale di partenza conservano un colore più scuro volta concentrata in un pellet, forse a causa di non reagiti nanoparticelle di ossido di rame (Figura 6). In confronto, biocompositi solfato di rame quando viene concentrato in un pellet hanno un colore blu, coerente con le proprietà di solfato di rame con vari livelli di idratazione 18.

La sintesi novel qui riportata è scalabile nel senso che l'auto-assemblato linstrutture dell'orecchio ridimensionare dal nanoscala al micro-scala come mostrato utilizzando microscopia elettronica (Figura 4) e tradizionale microscopio luce bianca (figure 3 e 6). È interessante notare che recentemente, ingegnerizzati microfibre proteine ​​coiled-coil stati riportati che potrebbe incorporare curcumina che consentiva le fibre formate da osservare sotto illuminazione a fluorescenza 19. Strategie simili è comunque possibile inserire distanziali o agenti di tagging nei compositi lineari riportati qui per fornire la produzione di strutture più grandi e / o miglioramenti per l'imaging.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mini Vortexer VWR (https://us.vwr.com) 58816-121
CO2 Incubator Model # 2425-2 VWR (https://us.vwr.com) Contact vendor Current model calalog # 98000-360
Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge) Labnet (http://labnetinternational.com/) C2500-R Model Prism R
Cell Culture Centrifuge Model Z323K Labnet (http://labnetinternational.com/) Contact vendor Current model Z206A catalog # C0206-A
Sonicator (Ultrasonic Cleaner) Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/) 1510R-MTH
Balance Sartorius (http://dataweigh.com) Model CP225D similar model CPA225D
Olympus IX51 Inverted Light Microscope Olympus (http://olympusamerica.com Contact vendor
Olympus DP71 microscope digital camera Olympus (http://olympusamerica.com Contact vendor
external power supply unit - white light for Olympus microscope Olympus (http://olympusamerica.com TH4-100
10X, 20X, and 40X microscope objectives Olympus (http://olympusamerica.com Contact vendor
Scanning Electron Microscope Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html) model S-4800
Transmission Electron Microscope Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html) model Libra 120
Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench Envirco (http://envirco-hvac.com) model PNG62675 Used for sterile cell culture technique

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References

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Generazione di scalabili, Metallic Tacchi-Aspect nanocompositi Rapporto in un Biologica Liquid Media
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Cotton Kelly, K., Wasserman, J. R., Deodhar, S., Huckaby, J., DeCoster, M. A. Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium. J. Vis. Exp. (101), e52901, doi:10.3791/52901 (2015).More

Cotton Kelly, K., Wasserman, J. R., Deodhar, S., Huckaby, J., DeCoster, M. A. Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium. J. Vis. Exp. (101), e52901, doi:10.3791/52901 (2015).

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