Summary
Burada biyolojik şartlar altında ve sıvı ortam içinde, yeni, yüksek en-boy oranı biocomposites sentezlemek için bir protokol mevcut. biocomposites sırasıyla çapı ve uzunluğu mikrometre nanometre kadar ölçeklendirilebilir. Sistin ile birlikte bakır nanopartiküller (KNP'ler) ve bakır sülfat sentezi için önemli bileşenleridir.
Abstract
Bu protokolün amacı yüksek en-boy oranı yapıları ile iki yeni biocomposites sentezini tarif etmektir. biocomposites bakır nanopartiküller (KNP'ler) ya da metalik bileşen katkı bakır sülfat ile ya, bakır ve sistin oluşmaktadır. Sentez biyolojik koşullar (37 ° C) ve 24 saat sonra kendi kendini monte kompozit malzemelerin oluşturulması altında sıvı içinde gerçekleştirilir. Oluşturulduktan sonra, bu kompozitler hem sıvı ortam içinde ve kuru halde son derece stabildir. Kompozit uzunluğu aralığı Mikro-nano ölçekleme ve birkaç mikron çapı 25 nm. Enerji dispersif X-ışını spektroskopi (EDX) ile alan emisyonu tarama elektron mikroskobu böylece nihai nanokompozitlerin kükürt kaynağı olarak sistin teyit başlangıç CNP malzemeden yokken kükürt, NP-türevi doğrusal yapılar içinde mevcut olduğunu gösterdi . Bu lineer nano ve mikro-kompozitlerin sentezi str uzunlukları ve çeşitli aralığındauctures sentez teknesine oluşturulmaktadır. Sentezden sonra, sıvı karışımın sonikasyonu sonication artan zamanla ortalama uzunluğu azaltarak yapıların ortalama boyuta kontrol edilmesine yardımcı olduğu gösterilmiştir. Oluşan yapılar yüksek toplanma olmayan, kararlı, sıvı faz içinde oluşturulmaktadır olduğu için, santrifüj, aynı zamanda konsantre edilmesi ve oluşturulan bileşikler ayrılmasında yardımcı olmak için kullanılabilir.
Protocol
Deney 1. Planlama
- Sentezi için gerekli olan bakır nanokompozitlerin hacmini belirleyin. Bu temelde, küçük hacimli şişeler (25 cm2), ya da malzemelerin hazırlanmasında, aşağıda gösterildiği gibi daha büyük bir şişe bir dizi seçim.
- Bu sentez için,% 5 CO2 ve en az% 40 nem ile 37 ° C inkübatör kullanın. Böyle bir inkübatör mevcuttur ve tekrar tekrar sentez döneminde (yaklaşık 24 saat) boyunca rahatsız olmayacak emin olun.
DİKKAT: Tekrarlanan açma ve inkübatör kapanış kesinlikle nanokompozit yapılarının değişmiş sentezinde neden olabilir sıcaklık dalgalanmalarını neden olacaktır.
Malzemelerin 2. Hazırlık
- Sentezi başlatmak için hemen önce çözücü maddeler, katı maddeleri ekleyerek, bir deney başlamadan önce taze tüm malzemeleri hazırlayın. Uzun zamanlar b sıvı içinde sistin ve bakır başlangıç maddelerinin stok çözümleri tutulmasıefore Deney tavsiye edilmez ve değişken sonuçlara yol açabilir. Bir kez Parafilm ile kabın üst sararak kuru başlangıç malzemeleri, satıcıdan devam açıldı.
Not: Aşağıdaki protokol sistin 7 ul steril su 6643 ul ve KNP'lerle 350 ul kullanılarak 25 cm 2 hücre kültürü şişesi içinde tepkimesi için bir örnek olarak kullanılmıştır. - KNP'lerle en az 2 mg tartılması bakır nanopartiküller bir 2 mg / ml çözeltisi hazırlayın. Cilt ile KNP'lerle olası temasını önlemek için bu adımı sırasında tek kullanımlık eldiven giyin. Boş bir steril 16 ml cam şişede nanopartiküller yerleştirin.
- KNP'lerin içeren şişeye, 2 mg / ml'lik bir çözelti oluşturmak ve sentez başlamadan önce nanopartiküllerin dağılmasını temin etmek için 20 saniye için çözüm vorteks uygun hacimde steril deiyonize su ekleyin (en az 1 mL toplam hacim tavsiye edilir). Bu vorteks karıştırma inhibe edecek şekilde su ile şişe yarısından fazlası yol doldurmayın. KNP'ler will hızla şişenin dibine yerleşmek ve (siyah gri) rengi koyu görünecektir.
- Sentezi başlamadan önce KNP'lerle maksimum dağılım temin etmek üzere, oda sıcaklığında 17 dakika boyunca CNP çözeltisi sonikasyon. Periyodik KNP'ler Sonication nedeniyle karıştırma emin olmak için kontrol edin. Başarılı Sonikasyon sonrasında, KNP'ler en az 30 dakika süre ile çözelti içinde askıda kalır ve çözelti, koyu renkli olur.
- Sentezi için bir 72.9 mg / ml çözelti yapmak için sistin yeterli kütleye tartılır. Sistin su içinde doğrudan çözünür olmadığı için, antistatik tartım kabında tartılır sistin yerleştirin.
- Sistin tamamen eriyene kadar tartım kabı içeren sistin için, steril, 1 M NaOH yeterli hacmi ekleyin. Örneğin, bir 72.9 mg / ml çözelti elde edilerek, 1 M NaOH içinde 100 ul tam sistin 7.29 mg çözülür.
- Steril akış doku kültürü kaputu bu adımı yürütmek, steril koşullar korumak için.
UYARI: NaOH1 M konsantrasyon yakıcı ile, yani deri ile konsantre NaOH temasını önlemek için bu adım sırasında atılabilir giyim eldivenleri
- Steril doku kültürü kaputu çalışan birinci steril sentezi şişeye steril su 6643 ul sistin 7 ul, ve şişe kapağı ile 37 ° C'de kuluçka makinesi içinde, 30 dakika boyunca inkübe edin etkili sağlamak için (gevşek) havalandırılmış Karıştırma. KNP'ler sonikasyon aşamasından sonra yerleşmiş çünkü, 30 saniye boyunca girdaplanarak 2 mg / ml CNP solüsyonu yeniden süspanse edin.
- Sentezini başlatmak için 25 cm 2 hücre kültürü şişesi steril su, 50 parça KNP'ler ve 949 parça 1 parça sistin birleştirmek: Aşağıdaki bileşen oranları korumak için (steril tekniği kullanarak) sentez şişeye yeterli CNP çözüm ekleyin. Örneğin, bir 7 mi sentezi hacmi için, sistin stok çözeltisi 7 ul, KNP'lerle 350 ul steril su 6643 ul birleştirir. Balona kapağını takın ve böylece secur olduğunu sıkıne.
- Sentez için tüm bileşenleri birleştirdikten sonra, yavaşça 4-5 kez dönen tarafından şişede karıştırın. CO2 inkübatör şişeyi koyun ve ve sentez sırasında balonun dışına gaz değişimi olacak şekilde kapağı gevşeterek şişeyi havalandırma.
- Sentez yaklaşık 24 saat inkübatör çalışmasına izin ver. Sentez sırasında, bir, mikroskopi ve gözle yüksek doğrusal kompozit oluşumunu gözlemleyebilirsiniz.
Not: yapı oluşumu süreci yapıları tespit etmek için ilk olarak sabit olduğu anlamında anda meydana gelebilir, o zaman görünümü artan bir yoğunluğa hızlı bir şekilde ilerler. Formasyon bu nedenle 24 saat önce oluşabilir. yapılar büyük ve yoğunluğu artar haline kez süreç aynı zamanda gözle görülebilir. Yapıların üretimi daha sonraki zaman noktalarında mikroskop altında ve göz zaman içinde görülmekte iken, sürekli biçimde sentez koşullarının kesintiye ve sıcaklık zayıf yol açacaktırSentez sonucu. - Sıkı sentezi şişesi kapak kapama ve bir buzdolabına (4 ° C), teknenin depolayarak biocomposites sentezini iptal eder. Bir kez üretilen yapıları, en az bir yıl boyunca bu şekilde sabit kalır. Kullanılan bileşenlerin sentez tarihi ve sona ermeden sentez inkübasyon süresi de dahil olmak üzere sentez koşulları ile balon etiketleyin.
Bakır Sülfat Kullanılması 3. Sentezi
- Bakır sülfat tuzu ile KNP'lerin değiştirerek kendini montaj sentezini yürütmek. Steril teknik kullanılarak, 2 mg / ml'lik bir solüsyon yapmak için, steril deiyonize su, yeterli hacimde bakır sülfat, en az 2 mg çözülür. bakır sülfat kristalleri kolayca bu konsantrasyonda çözelti içine gitmek, ama gerekirse flakon vorteks ve tüm kristalleri çözülür sağlamak için göz tarafından kontrol edin.
- Daha önce tarif edilen, ancak bakır sülfat ile KNP'lerin değiştirilmesi gibi bakır sülfat hazırlanmasından sonra, sentez yapmak.
Not: Bir başlangıç malzemesi olarak, bakır sülfat kullanarak kendi kendine bir araya nanokompozitler KNP'lerle sentezlenen yapılar için daha kesin bir şekil çok daha tutarlı olduğu bulunmuştur. - CNP kompozitler gibi bakır sülfat biocomposites sentezini sonlandırma (2,6 aşama) ve 4 ° C de, uzun dönemli saklayın.
4. Karakterizasyonu ve Biocomposites Post-sentez taşınması
- KNP'lerle gelen ve beyaz ışık mikroskobu 9 bakır sülfat gelen ve elektron mikroskobu 9 türetilen biocomposites karakterize.
- Kompozit bir şişeye, düz döşeme birkaç dakika içinde şişenin alt yüzeyine yerleşmek gibi karakterizasyonu ve biocomposites beyaz bir ışık mikroskobu ile sentez sonrası incelenmesi için, bir ters mikroskop kullanarak ve daha sonra odak noktası haline getirilebilir. Biocomposites ve sıvı ortamın arasındaki kontrastı en üst düzeye çıkarmak için mikroskop parlak alan ayarını kullanın. KNP'lerle ve polis türetilen kompozitlersülfat başına hem renkli opak açıkça görünür, ancak girmemiş CNP agrega rengi çok koyu görünecektir.
- Kompozit görüntü yakalamak için mikroskop bağlı bir dijital kamera kullanın. Ayrı ayrı yapılar için uzunluklarının bir aralığı gözlenecektir.
- Karakterizasyonu ve biocomposites sentez sonrası denetimi ve 4 ° C'de depolamadan sonra, şişeler mikroskopi görüntüleme yaparken odaklama etkili belirsiz olacaktır buzdolabından çıkarıldıktan üzerine ilk yoğunlaşmayı oluşturmak gibi şişeler, en az 15 dakika boyunca oda sıcaklığına gelmesine izin. Oda sıcaklığına dengede bırakıldıktan sonra, mikroskopi görüntü kalitesi üst düzeye çıkarmak için temiz bir kağıt havlu ile balonun üst ve alt yüzeylerini silin.
- Buzdolabında ise oluşturan kompozit kümeleri ayırmak için 30 saniye boyunca uzun süreli saklanan ya da görüntüleme kompozitler, girdap şişesi çalışırken. Vorteks sonra ters mikrofon ile yapıları incelemekroscope agrega ayrışmış emin olun ve gerekirse vorteksleme tekrarlamak için.
- KNP'lerin kullanarak belirli bir deney için sentez etkinliğini değerlendirmek için ters beyaz ışık mikroskobu kullanarak. Örneğin, bu tür sentez süresi olarak farklı parametrelerle şişelerinden CNP türetilmiş biocomposites için kullanılan sentez şişelerinde reaksiyona girmemiş KNP'lerle varlığını ya da yokluğunu belge.
Bağımsız KNP'ler bir ışık mikroskobu ile gözlenmek için çok küçük, ancak reaksiyona girmemiş CNP yüksek en boy oranı, doğrusal bir biçime sahip olacaktır başarıyla sentezlenmiştir CNP-kompozitler aksine, yuvarlak şekil ve koyu renkli bir nesne olarak görülür agregatlar ve Not: Farklı uzunluklarda bir dizi olacaktır. Bu bir kez meydana getiren bireysel yapılar halinde dağılması zor olan yüksek ölçüde dallanmış "kestanesi" tipi yapılarda neden olacağı için, sona önce bir süre çok uzun için sentez gerçekleştirilmesi kaçının. - Etkinliğini değerlendirmek için ters beyaz ışık mikroskopisi kullanınBakır sülfat kullanılarak, belirli bir deney için sentez. Bakır sülfat, bu protokolü kullanarak çözelti içine tamamen gider yana, çözüm KNP'lerin kullanarak sentezden çözümün daha az karanlık görünür. Böyle bir fesih öncesi sentez zaman gibi farklı sentez koşulları şişeler karşılaştırarak bakır sülfat kompozit boyutunu ve kapsamını belgeleyin.
Not: Başarıyla sentezlenen kompozit farklı uzunluklarda bir dizi gösterecektir. Bu "kestanesi gibi" bir yapıda olacaktır bazıları kompozitler, yüksek ölçüde dallanmış agrega neden olacağı için, sona önce bir süre çok uzun için sentez gerçekleştirilmesi önlemek ve hangi bir kez meydana getiren bireysel yapılar halinde dağılması zor olan .
- Kompozit bir şişeye, düz döşeme birkaç dakika içinde şişenin alt yüzeyine yerleşmek gibi karakterizasyonu ve biocomposites beyaz bir ışık mikroskobu ile sentez sonrası incelenmesi için, bir ters mikroskop kullanarak ve daha sonra odak noktası haline getirilebilir. Biocomposites ve sıvı ortamın arasındaki kontrastı en üst düzeye çıkarmak için mikroskop parlak alan ayarını kullanın. KNP'lerle ve polis türetilen kompozitlersülfat başına hem renkli opak açıkça görünür, ancak girmemiş CNP agrega rengi çok koyu görünecektir.
- Biocomposites sonrası sentezi, bir santrifüj tüpü içinde kompozitlerin santrifüj çözümler yoğunlaştırmak. 15 ml santrifüj tüpüne CNP-türevi yapılar ya da bakır sülfat türevi yapılar, ya 6 ml ilave edilir. 10 dakika boyunca santrifüjoda sıcaklığında, 500 x g'de topak elde etmek için. Daha küçük miktarlar için, 0.6 ml boyutlu tüpler çözüm yapıların 500 ul ekleyin. En az 10 dakika süreyle oda sıcaklığında 2000 x g'de santrifüjleyin bir topak oluşturmak için.
- Yeterli bir süre boyunca (mikrofüjler için en az 10 dakika) santrifüje tabi tutulmasının ardından yapıları dikkatli bir şekilde pelet üzerinde yüzer sıvının çıkarılması ile konsantre edilir tüpün altındaki gözlemlenebilir pelet kaydedin. Bakır sülfat elde edilen Biyokompozit yapıları renk ve KNP'lerle türetilen yapılarda mavi koyu (siyah gri) vardır görünür.
- Bu tüp daha kompozitler ekleyin ve istenirse yapıları konsantre aynı tüpte işlemi tekrarlayın. Konsantre granül dağıtmak için, 10-30 saniye süre ile, istenen tüp çözeltisinin hacmi ve vorteks ekleyin.
- Sonikasyon yapılar bir zamanlar değerlerini düşürmek için yapıların ortalama nüfus büyüklüğü (uzunlukları) taşımak için, kurdu. En le steril deiyonize su ve sonikasyon yerleştirin yapılarıast 10 dk. Zamanla, bu yöntemi kullanarak, yapılar parçalanmış, ortalama uzunluk (metin bakınız Şekil 6) daha küçük hale gelir. Ters beyaz ışık mikroskobu ve dijital kamera kullanarak farklı sonication kez kompozit boyutlarda Belge değişir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, bu çalışmada tarif lineer biocomposites oluşturmak için sentez adımlarına ait bir akım şeması şemasını göstermektedir. Başlangıç materyalleri olarak KNP'ler ya da bakır sülfat, 2 mg / ml'lik bir çözelti oluşturmak üzere, steril su ile birlikte, bu çözüm, karıştırılır ve eşit bir karışım sağlamak için sonike ve bu çözelti daha sonra, bakır sentezi için, aşağıdaki oranda karıştırılır edilir: 949 parça, steril su: 50 parça bakır karışımı: 1 kısım sistin stok solüsyonu. Gerçek miktarlar büyütmek veya nihai sentez verimi küçültün bu oranlara göre artırılabilir veya azaltılabilir. Zamanla bir görünümünde sıvı solüsyon değişim gibi normal beyaz ışık mikroskobu altında ya da gözü tarafından gözlemlenebilir belirtilmedikçe, doğrusal biokompozit yapılar oluşturulur gibi en az 2 saat boyunca kuluçkadan sonra.
Şekil 2 tam hücre kültür ortamı o bu çizgisel yapıların ilk keşfinden temsili bir sonuç göstermektedir82 saatlik bir süre ver. Laboratuvarımız hücreleri ve kanser hücrelerinin normal üzerinde KNP'lerle dahil olmak üzere farklı nanomalzemeler, potansiyel toksisite değerlendirmesini taşıyordu ve Şekil 2'de gösterilen hücreler ATCC (CRL-2020) bir hızla büyüyen beyin tümör hücre çizgisi vardır. Bu hücreleri için kullanılan tam ortam için bir anahtar ek, bu doğrusal yapılar (aşağıya bakınız ve tartışma bölümü) kültürlerde oluşturan neden keşfine temel bileşeni olduğu ortaya çıktı sistin vardır. Olan hızlı agrega mikro (Şekil 2A ve 2B) olarak, daha küçük parçacıkların temizlenir ve daha büyük agregalar (Şekiller 2C ve 2D) oluşan zamanla KNP'lerle bir başlangıç da dispersiyondan. Son olarak, ince, çizgisel yapılarla büyük agrega olmayan biol kullanarak daha önce literatürde "kestanesi" türü yapılar oluşturan, aynı kuyular (Şekil 2E-H) görünürogical yöntemleri 6. 69 ve 82 saatte son iki zaman noktalarında, Karşılaştırılması, (2G ve 2H, sırasıyla Şekiller) aynı kesin alanını görüntüleme belirtildiği gibi büyük kestanesi türü yapıların geliştirilmesi, oldukça istikrarlı kaldığını göstermektedir.
Hücre kültürlerinde, bu koşullar altında, bu kestanesi benzeri yapılar gözlenmiştir açıklamak için, temel unsurları izole edilebilir olup olmadığını belirlemek için ortam bileşenleri ortadan kaldırmak başladı. Biz hücre kültürü ortamına önemli bir bileşenidir ve ek eleme işlemi ile sonuçta kendini montaj işlemi için önemli bir bileşeni olarak tespit edilmiştir sistin, olduğunu keşfetti. Sentezi bileşenlerini basitleştirerek hücrelerin gerek kalmadan, sonuçta, lineer forma nanopartikül formundan dönüştürmek için zaman içinde gösterilebilir yüksek en-boy oranını (lineer) sıvı yapılar oluşturabilir (Şekil 1 e bakınız), ya da bir diğer hücreKültür bileşenler (Şekil 3A-C).
Şekil 4, nano partiküler başlangıç malzemesi ve lineer nanoyapılar (Şekil 4A) oluşturan yakalama bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüsünü içeren elektron mikroskobu kullanılarak keşfedilmiş yeni yapıların tanımlanmasını gösterir. Örnek Tarama Elektron Mikrografisi (SEM) görüntülerinin çıkış malzemesi KNP'lerle için gösterilmiştir, bakır sülfat oluşan NP, ve doğrusal yapılardan oluşan lineer Yapılar (sırasıyla Şekiller 4B-F), başlangıç materyalinin.
Biocomposites kompozit temel bir biyolojik bileşen olarak sistin ya da sistin-türevi materyal ihtiva doğrulamak için, oluşan yapılar SEM mikroskobu ile EDX kullanılarak analiz edildi. Analiz malzemelerden Örnek ekran görüntüleri, Şekil 5'te gösterilmektedir. Önemli olarak, KNP'lerle gelen KNP'lerin ve biocomposites karşılaştırırken, tanınmışMalzeme (Şekil 5A) Başlangıç CNP mevcut olmayan kükürt pik görüntülenir (Şekil 5B). Bu biyokompozit için sistin varlığı ile tutarlıdır malzeme (Şekil 5C), karbon ve azot tepe (Şekil 5D) görüntülenir, başlangıç maddesi olarak, bakır sülfat kullanılarak biocomposites için.
Bu zamanda, sentez sırasında uzunluğu ve kompozitlerin boyutunu kontrol etmek için bir yöntem, tespit edilmemiştir. Şekil 6'da gösterildiği gibi, ancak yapıların ortalama boyutu sentezden sonra kontrol edilebilir, doğrusal biocomposites farklı zaman dönemleri için sonike edilmiştir araştırmak. Sonikasyon artan süre ile, lineer biocomposites ortalama büyüklüğü olarak azaldığı gösterilmiştir parlak alan mikroskopisi (Şekiller 6A-D) ile gösterilmiştir. Konsantre edilir ve oluşturulan bileşikler olarak ayrılması için bir yöntem olarak, santrifüj kullanılabilir ve Şekiller 6E gösterilen-G, Görünür bir pelet kullanılan hacimleri ve santrifüj kuvvetleri bağlı olarak geliştirilebilir.
Sentez tasarımı Şekil 1. Temsilcisi akış şeması Cu NPS = bakır nanopartiküller.; Cys = sistin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tüm hücre kültürü ortamı ile beyin tümörü hücre kültürlerinde, bakır biokompozit yapıları Şekil 2. Örnek oluşumu. 82 saatlik bir toplam üzerinden paletli bir temsili deney beyin tümörü hücreleri ve KNP'ler (50 ug / ml) ihtiva eden hücre kültürü içinde gösterilir. Paneller A ve B gösterisi0 zamanda kültür kuyuları KNP'lerle de sonra tabanına yerleşmiştir. Paneller, sırasıyla, 17, 24, 36, 49, 69 ve 82 saatte sonraki zaman noktalarını göstermek Ch. Paneller G ve H 69 ve 82 saatte aynı alanda temsil etmektedir. Tüm görüntüler bakır malzeme kontrastı arttırmak için aydınlık mikroskopi kullanılarak elde edilmiştir. Ölçek çubukları = A + B 100 mikron, CE 50 mikron ve F + G için 25 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
7 ml toplam hacmi ile, Şekil 1 'de ve protokol bölümünde belirtildiği gibi, doğrusal biocomposites için KNP'lerle Şekil 3.. Dönüştürülmesi. KNP'ler sistin ve su ile bir araya getirilmiştir. Panel A, 0 zamanda sentez teknesine gösterir, panel B 3 saat gösterir ve panel C sh6 saat akımları. Görüntüler belirtilen ölçek çubuğunun (50 mikron) ile aydınlık mikroskopi kullanılarak elde edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. sentezlenmiş biocomposites elektron mikroskopisi karakterizasyonu Paneli (A):. CNP TEM oluşturan doğrusal kompozit malzeme (yuvarlak) başlangıç. Paneller (B) ve (C) SEM ile başlayan KNP'lerle karakterizasyonu göstermektedir. Paneli (C) (B) bir yakınlaştırılmış görüntü olduğunu. Panel (D) KNP'lerle ve sisteinden oluşan kompozit SEM'sini gösterir. Paneller (E) ve bakır sülfat biocomposites (F) show SEM'ler. Panel (F) zoome olduğunu(E) d görüntüsü. Ölçek çubukları tüm görüntüler gösterilir ve (a) 'de = 200 nm, (B)' de 1 mikron, (C) 'de, 500 nm, (D), (E) 2 mikrondan, ve 1 mikron 5 mikron (F ). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Başlangıç malzemeleri ve sentezlenmiş lineer kompozitlerin Şekil 5. EDX (SEM) analizi. Elementer içerik EDX analizi kullanılarak SEM taranan numunelerin Ekran anlık. Paneli (A) = KNP'lerin başlayan; Paneli (B) KNP'lerle ve sistin gelen biocomposites =; Panel (C) = bakır sülfat başlangıç malzemesi ve panel (D) ileri geri kompozit =m bakır sülfat ve sistin. Pik etiketleme, C = karbon, O = oksijen, Cu = bakır, S = kükürt ve N = azot için. Elemental kimlik Büyük etiketler izleme kolaylığı için önemli zirveleri üzerinde yerleştirilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Paneller (AD) 'de gösterildiği gibi doğrusal bir kompozit boyutu ve konsantrasyon sonrası sentezi Şekil 6. Modifikasyonu. Bakır sülfat sentezlenen doğrusal yapılar, sırasıyla 0, 15, 30 ya da 60 dakika için sonike edilmiştir. Çıkan tüm görüntülerin belirtildiği 200 mikron çaplı çubuğuna sahip olan aydınlık mikroskobu kullanılarak elde edildi. Paneller (EG), biocomposites konsantrasyonu kullanılarak santrifüj: KNP'lerle (türetilen lineer yapıların 6 mi <strong> E), sol ve bakır sülfat (E, sağ) 10 dakika sonra yerçekimi altında yerleşme gösterilmiştir. 500 xg'de santrifüj 10 dakika ile bir sıkıştırılmış pelet (Panel F) oluşur. (Panel G) (CNP türevli yapılar doğru tüp içinde sol boru ve bakır sülfat türevi yapılar gösterilmiştir). 'De gösterildiği gibi, aynı malzemenin daha küçük bir hacmi (500 ul), konsantre edildi , bir büyük görmek için lütfen Bu rakamın sürümü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
KNP'lerle dahil Nanomalzemelerin potansiyel toksik etkileri değerlendirirken, uzun vadede, KNP'ler büyük, birleştirilmiş forma başlangıçta daha dağınık partikül dağılımı (Şekil 2) dönüştürülmüş olduğu gözlendi. Bazı durumlarda, biyolojik şartlar altında, hücre kültürü çanağı üretildi, bu son derece birleştirilmiş formasyonlar "kestanesi" içeren daha önce tarif edilen bakır andıran merkez agrega oldukça lineer çıkıntılar oluşturulmuştur 6. Burada gösterilen koşullar altında, KNP'lerle konsantrasyonu ve böylece kültür içinde hücreleri öldürme olup, alt maksimumdu hücrelere ilave işaret edilmesi gerekir (bakınız Şekil 2). Bu ilk gözlemlerden, deneyler sonra sentez o için gerekli kalan temel bileşenleri bulmak için (kendilerini sonuçta hücreleri de dahil olmak üzere) hücre kültürü koşulları arda fazla bileşen ortadan kaldırarak devam edildif doğrusal bakır biocomposites.
O sistin, orijinal hücre kültürleri, bir takviye bileşeni doğru biyolojik şartlar altında KNP'lerle ile birleştirildiğinde, EDX analizi ile gösterildiği gibi, metal ve biyokimyasal bileşenlerin her ikisi de içeren bir yüksek ölçüde doğrusal biyokompozit içine nanopartikülat formunda transformasyonu neden olabilir keşfettik Hazırlanan numunelerin elektron mikroskobu (Şekil 5) tarayarak. Bu durumda, başlangıç malzemesinin CNP mevcut olmayan kükürt, bakır ve biyokimyasal malzeme sistin bileşenleri hem de oluşan çizgisel yapılar için gerekli olduğunu gösteren, sentezlenmiş biocomposites belirgin bir tepe noktası gösterir.
Bundan başka, içindeki sentez koşulları kullanılarak, ancak bakır sülfat ile KNP'lerin değiştirerek, yüksek lineer biocomposites da oluşturulabilir gösterilmiştir. Aslında, bakır sülfat ve sistin kullanılarak sentez "temizleyici" sonuçlanma eğilimindeydi enbakır sülfat Burada bildirilen sentezlerin tümünde, bir çözücü olarak kullanılan, su içinde tam olarak çözünür olduğu Ge ürünleri, bu herhangi bir reaksiyona girmemiş KNP'ler, şimdiye kadar mevcut idi. Bundan başka, bakır sülfat biocomposites malzeme santrifüjleme ile daha açık bir yeşil renk istinat CNP-türevi kompozit kendilerini ayırt.
Diğer gruplar önceden bakır sistin kompleksleri okudu ve bazı temel kimyasal özelliklerini tanımladık. Örneğin, Kahler ve ark., Kurutma üzerine belirgin ama çözeltisi 13 içinde kararsız olan ince lifler şeklinde, bakır-sistin komplekslerinin oluşumunu gösterdi. Diğer örneklerde, L-sistin ve farklı metal katyonları ile kompleks oluşturma çalışmaları, sulu bir ortamda 14 bakır ve sistin kompleks oluşumunu teyit etmektedir ve oluşan kompleksler kompleks oluşumu 15 katkıda sistin kükürtün sahip, tek-çekirdekli ya da çok çekirdekli olabilir. Bir dizi çalışmada raporu varBiyolojik sistemlerde sistin ve bakır arasında ed etkileşimler. Örneğin, fizyolojik pH'de, bakır (II) amino asitler ihtiva eden kompleksler 16 ve kükürt oluşturulması için simüle plazmada histidin ve sisteinden ile koordine iyonlar civciv 17 bakır toksisitesine karşı koruyucu olduğu gösterilmiştir. Bu bulgular bu nedenle, bakır, doğrusal biocomposites oluşturulması için sentez yöntemlerinde başlangıç malzemesi ile kompleks olarak sistin temel rolünü destekler.
Şu anda bir sentez stratejisi henüz doğrudan burada gösterilen bireysel doğrusal biocomposites uzunluğunu kontrol edebilirsiniz tespit edilmemiştir. Bununla birlikte, tarif edilen sentezinde tanımlanan kritik adımları içerir: KNP'lerin içeren sentezi durumunda başlangıç malzemelerinin sonikasyon ile 1) iyi bir dispersiyon; 2) taze hazırlanmış KNP'lerle, bakır sülfat ve kompozitlerin etkili bir sentezi için sistin kullanımı; 3) şişeye sentez incubat bozulmamış kalmasını sağlayanveya en az 6 saat boyunca; ve 4) kaçınarak "aşırı tepki" koşulların hangi "kestanesi" tipi, toplulaştırılmış kompozit formu dallı.
Sentez tamamlandıktan sonra, bu yapıların sonikasyon yapıların, ortalama boyutu (uzunluk) azaltmak için etkili bir şekilde kullanılabileceği gösterilmiştir. Küçük yapılar, hücre alımı veya diğer biokompozit hücresel etkileşimleri gibi uygulamalarda yardımcı olabilir yapmaya sonicating. Daha önce rapor edildiği gibi, daha az yüklü (negatif) formunda 9 pozitif ölçülen zeta potansiyelini değiştirilmiş sistin ile birleştirerek bu sentez sırasında KNP'lerle stabilizasyonunu şarj. Sorumlu Bu değişiklik oluşan kompozit çok daha rahat yapıların taşıma yapan kurutulmuş formda veya sıvı ortam, çok az agregasyonunu göstermek açıklamaya yardımcı olabilir.
Bu CNP-türevi ve bakır sülfat türevi yapılar bildirilen senteze yana O gerçekleştirilirut, sıvı ortam içinde, bu işlem tamamlayıcı parçaları ve sentez koşullarının doğru oranlarda, burada kullanılan mililitre sentezi tarif kadar ölçekli olabilir veya aşağı mililitre veya daha fazla yüzlerce dahil etmek ve bunun anlamı, yüksek ölçeklenebilir umulmasına Bu şekilde, hem de daha fazla nihai ürünü elde etmek için beklenir. Nedeniyle, bu biocomposites metal (bakır) bileşeni için, santrifüj (Şekil 6) tarafından sentezlenen ürünü konsantre etmek oldukça basittir. Başlangıç malzemesi CNP oluşan Biocomposites kez muhtemelen reaksiyona girmemiş bakır oksit nanopartiküllerinin (Şekil 6) için, topak haline getirilmiş daha koyu bir renk muhafaza eder. Buna karşılık, bir topak halinde konsantre edildi bakır sülfat biocomposites hidrasyon 18 çeşitli seviyelerde bakır sülfat özellikleri ile tutarlı bir mavi renk vardır.
Burada bildirilen yeni sentezi de anlamda ölçeklenebilir bu kendi kendini monte linkulak yapıları elektron mikroskobu (Şekil 4) ve geleneksel beyaz ışık mikroskobu kullanılarak gösterildiği gibi mikro ölçekli nano ölçekli ölçek (Şekil 3 ve 6). Son zamanlarda, mühendislik sarmal-coil protein mikroelyaflardır oluşan lifler floresan aydınlatma 19 altında uyulması için izin kurkumin dahil olabilir bildirildi dikkat çekicidir. Benzer stratejiler görüntüleme için büyük yapılar ve / veya geliştirmeleri üretimini sağlamak için burada bildirilen doğrusal kompozit içine aralayıcıları veya etiketleme ajanları dahil etmek mümkün olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini Vortexer | VWR (https://us.vwr.com) | 58816-121 | |
| CO2 Incubator Model # 2425-2 | VWR (https://us.vwr.com) | Contact vendor | Current model calalog # 98000-360 |
| Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge) | Labnet (http://labnetinternational.com/) | C2500-R | Model Prism R |
| Cell Culture Centrifuge Model Z323K | Labnet (http://labnetinternational.com/) | Contact vendor | Current model Z206A catalog # C0206-A |
| Sonicator (Ultrasonic Cleaner) | Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/) | 1510R-MTH | |
| Balance | Sartorius (http://dataweigh.com) | Model CP225D similar model CPA225D | |
| Olympus IX51 Inverted Light Microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Olympus DP71 microscope digital camera | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| external power supply unit - white light for Olympus microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | TH4-100 | |
| 10X, 20X, and 40X microscope objectives | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html) | model S-4800 | |
| Transmission Electron Microscope | Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html) | model Libra 120 | |
| Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco (http://envirco-hvac.com) | model PNG62675 | Used for sterile cell culture technique |
References
- Klinman, J. P. The copper-enzyme family of dopamine beta-monooxygenase and peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase: resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation. The Journal of biological chemistry. 281, 3013-3016 (2006).
- Uauy, R., Olivares, M., Gonzalez, M. Essentiality of copper in humans. The American journal of clinical nutrition. 67, 952S-959S (1998).
- Karlsson, H. L., Cronholm, P., Gustafsson, J., Copper Moller, L. oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes. Chemical research in toxicology. 21, 1726-1732 (2008).
- Parekh, G., et al. Layer-by-layer nanoencapsulation of camptothecin with improved activity. International journal of pharmaceutics. 465, 218-227 (2014).
- Harrington, M. J., Masic, A., Holten-Andersen, N., Waite, J. H., Fratzl, P. Iron-clad fibers: a metal-based biological strategy for hard flexible coatings. Science. 328, 216-220 (2010).
- Keyson, D., et al. CuO urchin-nanostructures synthesized from a domestic hydrothermal microwave method. Materials Research Bulletin. 43, 771-775 (2008).
- Liu, B., Zeng, H. C. Mesoscale organization of CuO nanoribbons: formation of 'dandelions'. J Am Chem Soc. 126, 8124-8125 (2004).
- Peng, M., et al. Controllable synthesis of self-assembled Cu2S nanostructures through a template-free polyol process for the degradation of organic pollutant under visible light. Materials Research Bulletin. 44, 1834-1841 (2009).
- Deodhar, S., Huckaby, J., Delahoussaye, M., DeCoster, M. A. High-Aspect Ratio Bio-Metallic Nanocomposites for Cellular Interactions. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 64, 012014 (2014).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12, 47-53 (2010).
- Wiogo, H. T., Lim, M., Bulmus, V., Yun, J., Amal, R. Stabilization of magnetic iron oxide nanoparticles in biological media by fetal bovine serum (FBS). Langmuir. 27, 843-850 (2011).
- Yunker, P. J., Still, T., Lohr, M. A., Yodh, A. G. Suppression of the coffee-ring effect by shape-dependent capillary interactions. Nature. 476, 308-311 (2011).
- Kahler, H., Lloyd Jr, B., Eden, M. Electron Microscopic and Other Studies on a Copper–Cystine Complex. The Journal of Physical Chemistry. 56, 768-770 (1952).
- Furia, E., Sindona, G. Complexation of L-cystine with metal cations. Journal of Chemical & Engineering Data. 55, 2985-2989 (2010).
- Hawkins, C., Perrin, D. Polynuclear Complex Formation. II. Copper (II) with Cystine and Related Ligands. Inorganic Chemistry. 2, 843-849 (1963).
- Hallman, P., Perrin, D., Watt, A. E. The computed distribution of copper (II) and zinc (II) ions among seventeen amino acids present in human blood plasma. Biochem. J. 121, 549-555 (1971).
- Jensen, L. S., Maurice, D. V. Influence of sulfur amino acids on copper toxicity in chicks. The Journal of nutrition. 109, 91-97 (1979).
- Lee, Y., Choi, J. R., Lee, K. J., Stott, N. E., Kim, D. Large-scale synthesis of copper nanoparticles by chemically controlled reduction for applications of inkjet-printed electronics. Nanotechnology. 19, 415604 (2008).
- Hume, J., et al. Engineered coiled-coil protein microfibers. Biomacromolecules. 15, 3503-3510 (2014).
