Introduction
Den hjärttransplantation modell används ofta för att undersöka l / R-skada, transplantatavstötning, efter transplantation vaskulopati och effektiviteten i immunmodulerande medel. Musmodeller kombinerar många fördelar som den kända immunologiska och genetiska bakgrunder, tillgången på många inavlade och transgena stammar och relativt låga experimentella kostnader.
År 1973 genomfördes en teknik för abdominal hjärttransplantation i möss först beskrevs av Corry et al 1. I denna modell transplantat revascularized av end-to-side anastomoser av de uppstigande aorta till mottagarens bukaorta och i huvudlungartären till nedre hålvenen. År 1991 var en sutur teknik för cervical hjärttransplantation i möss beskrivits av Chen et al 2. I denna modell en retrograd kranskärls perfusion etableras genom anastomos av mottagarens karotidartären till de uppstigande aorta hos grakterut. Det venösa blodet rinner via sinus coronarius till det högra förmaket, den högra kammaren och utstötes genom lungartären i recipienten externa jugularvenen (Figur 1). I jämförelse med buken transplantatet implantation hals modellen är mindre invasiv och ytliga placering av implantatet möjliggör en mycket lätt tillgänglighet för ytterligare uppföljningsundersökningar (t.ex. palpation, ekokardiografi, intravital fluorescensmikroskopi) 3,4.
Trots tekniska förbättringar 5,6, har en mer utbredd användning av denna modell varit begränsad på grund av tekniska svårigheter att utföra sys anastomoser av små fartyg med en hög förekomst av anastomos läckage och trombos. År 1991 Matsuura et al. införde manschetten teknik där kärlväggen vrängs över en syntetisk cylinder, vilket avsevärt underlättar modellen av livmoderhalscancer hjärttransplantation 7. Tekniken var further antagits för olika experimentella transplantation modeller inklusive njur 8, bukspottkörtel 9, lem 10, lever 11,12, lunga 13,14 och vaskulär transplantation 15. I jämförelse med suturen tekniken den erforderliga tiden för anastomos och sålunda är den varma ischemi tiden kortare och det finns betydligt mindre vaskulära komplikationer som använder manschetten tekniken 16. Dessutom möjliggör det kirurger med lite träning i mikrokirurgi för att utföra operationen med ett bra resultat. En nackdel med manschetten tekniken är förutsättningen ligering av den gemensamma halsartären, vilka kan ändra cerebral perfusion.
I den här videon papper presenterar vi en förbättrad och förenklad manschetten teknik för cervical hjärttransplantation i möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment har godkänts av den tyska Heart Center München och regering Bayern, Tyskland (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). Djuren inhystes i ett visst patogenfri anläggning och fick mänsklig omsorg i enlighet med "Principles of Laboratory Animal Care" som utarbetats av Nationalföreningen för medicinsk forskning och "Guide för skötsel och användning av försöksdjur" som tillhandahålls av National Academy Vetenskapsakademien och publicerat av National Institutes of Health (NIH publikation nr. 86-23, reviderad 1985).
OBS: En komplett uppsättning av sterila mikro instrument, däribland två böjda pincett och fartygs dilatators, är nödvändigt för förfarandet (figur 2a). Perioperativa antibiotikaprofylax är inte rutinmässigt nödvändigt men kan anges i nedsatt immunförsvar djur. Djuren avlivades med hjälp av terminal isofluran inandning.
Donator Förberedelser och Graft Harvest
<ol>2. Mottagare Framställning
- Förberedmanschetterna för anastomoser genom att skära polyimid slangen med en nr 11 skalpell eller en sax under mikroskop. Manschetten består av en cylindrisk kropp och en förlängning (en / tre av omkretsen) för placering av den vaskulära klämman, var och en av en längd av en mm (figur 2b).
- Söva djuret och bekräfta kirurgisk tolerans som beskrivits ovan. Injicera 0,25 ml varm koksaltlösning subkutant (sc) för vätskeersättning.
- Avlägsna håret på högra cervikala området med användning av en elektrisk rakapparat och placera djuret i ryggläge på en varm dyna. Fäst benen med delar av bandet samtidigt undvika översträckning frambenen, eftersom detta kan äventyra andning. Täck ögonen med oftalmologiska salva för att förhindra torrhet. Desinficera operationsplatsen tre gånger med klorhexidin.
- Gör en tvärgående hudincision från höger mandibular vinkel mot hals hack.
- Rakt på sak mobilisera external halsvenen. Bränna sidogrenar med bipolär pincett och transekt dem.
- Dela upp externa halsvenen mellan ligaturer på samma nivå som sammanflödet med venen från submandibulära körteln.
- Dra den yttre halsvenen genom manschetten och ockludera kärlet proximalt genom att placera en vaskulär klämma på en förlängning av manschetten. Ta bort ligatur och vattna kärl lumen med 1:10 hepariniserad saltlösning.
- Vränga kärlväggen över manschetten och fixa det med en förinställd omkrets 8-0 siden ligatur.
- Ta bort ytliga delen av sternocleidomastoideus.
- Mobilisera högra gemensamma halspulsådern och transekt fartyget mellan ligaturer under halspulsådern bifurkation.
- Dra karotidartären genom manschetten och ockludera kärlet proximalt genom att placera en Yasargil klämma på en förlängning av manschetten. Ta bort ligatur och vattna kärl lumen med 1:10 hepariniserad saltlösning.
- Försiktigt dilate artär lumen med ett kärl dilatator, vränga kärlväggen över manschetten och fixa det med en förinställd omkrets 8-0 siden ligatur.
- För att få tillräckligt med utrymme för graft implantation, ta bort den högra loben av submandibular körteln.
- Håll operationsområdet fuktig tills implantation.
3. Graft Implantation
- Placera transplantatet i mottagaren halsregionen upp och ned med aorta orienterad medialt och lungartären i sidled.
- Dra aortan av transplantatet över manschetten med halspulsådern och säkra anastomos med en periferi 8-0 siden ligatur.
- Incisionsfilm lung stammen på främre delen och dra den över manschetten med den yttre halsvenen. Återigen säkra anastomos med en periferi 8-0 siden ligatur.
- Ta bort klämman på externa halsvenen, följt av lossning av halspulsådern. Hjärtan fylls omedelbart med blod. För att öka reperfusion släppa 37 ° C varmt saltlösning på transplantatet. Normalt hjärtat utvecklar sinusrytm inom en minut. Avlägsna manschetten förlängning vid den venösa stället.
- Säkerställa korrekt transplantat position, måste anastomoser vara smidig och fartyg utan vridning. Inte flamberats fartyg i huden eftersom detta kan försämra sårläkning. Blödning oftast slutar spontant. Stäng huden med en enda 8-0 kontinuerlig sutur.
4. postoperativ vård
- Injicera 0,25 ml varm koksaltlösning sc för vätskeersättning.
- Att antagonisera narkotika injicera naloxon (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) och atipamezol (2,5 mg / kg kroppsvikt) fm Vänster djuret på den varma dynan tills den har återvunnit tillräcklig medvetandet att upprätthålla sternala VILA. Beakta djuret under minst en ytterligare timme för att registrera någon onormalt beteende. Skicka inte tillbaka ett djur som har opererats för sällskap av andra djur tills helt Recoverött.
- Ge förebyggande smärtlindring med buprenorfin (0,05 mg / kg sc tre gånger per dag) eller en alternativ smärtlindring enligt en lokal institutionell protokoll för en period av minst 72 timmar efter ingreppet.
- Kirurgen och en veterinär bör se djur regelbundet. Vid viktminskning> 15%, apati, svullnad och kirurgiska sido infektion djur avlivas med hjälp av terminal isofluran inandning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vårt team framgångsrikt kunde utföra den beskrivna tekniken efter cirka 20 utbildnings operationer. Den mest utmanande delen är att vränga kärlväggen av karotidartären under manschetten, eftersom det lätt vänder tillbaka och flera försök kan leda till sönderrivning av väggen. Efter utbildningsperioden, den genomsnittliga totala operativa tid var 60 ± 8 minuter. Omkring 20 minuter krävs för donator skörd, 25 min för framställning av livmoderhalscancer fartyg och 15 minuter för anastomoser och hud stängning.
För utredning av myocardial I / R-skada förde vi över 200 operationer i syngena C57BL / 6-möss i olika experimentella inställningar med en kirurgisk framgång på 92%. Tidig död orsakades av svårigheter att utföra anastomoser (n = 3), anastomotic läckage (n = 2) och hjärt-fel (n = 10). Ett djur avlivades efter återhämtning på grund av neurologisk försämring. Bland perioperativa överlevande, transplantat överlevnad var> 95% vid7 dagar (fig 4). Ett antal syngena transplantat mottagarna har hållits vid liv i mer än tre månader. Trots att inte använda antibiotikaprofylax, vi inte ser några infektiösa komplikationer.
I en första serie, var 12 syngena C57BL / 6-möss transplanteras för histopatologiska undersökningar (Figur 3). Transplantat exponerades för 4 h av kall ischemi genom lagring på is vid 4 ° C före implantation. Transplantat skördades efter 7 dagar av reperfusion och färgades i hematoxylin och eosin (H & E) och Sirius red. Nontransplanted djur (n = 6) tjänade som kontroller. I / R-ledningen till en stark inflammatorisk reaktion med vävnadsödem, hyperemi, infiltrerande leukocyter, mikrovaskulär ocklusion och interstitiell fibros. I detta tidiga serie dog ett djur efter en upprepad injicering av ketamin / xylazin. Denna komplikation kan undvikas ytterligare genom att använda en helt antagonizable anestesi inklusive midazolam, medetomodine och fentanyl. < / p>
Figur 1: (a) schematisk illustration av blodflödet i Heterotopisk Cervical hjärta Transplantation. Blod från mottagarens halspulsådern flöden retrograd i aortaascendens och in i kransartärerna att BEGJUTA hjärttransplantat. Det venösa blodet rinner ut i höger förmak via sinus coronarius, fyller den högra ventrikeln och utstötes genom lungartären i mottagarens externa jugularvenen. Den vänstra ventrikeln är helt förbigås. (B) intraoperativ Vy över anastomoser. Den uppåtgående aortan (2) dras över manschetten med halspulsådern (1) och den pulmonella stammen (3) över manschetten med den externa jugularvenen (4). På bilden den venösa anastomos inte hade ännu inte slutförts.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: (a) En komplett uppsättning av sterila mikro instrument inklusive två böjda pincett och två fartygs dilatators krävs. (B) För anastomoser manschetter från 19-24 G med en förlängning och mikrovaskulära klämmor används.
Figur 3: Histologisk Prover Demonstration Myocardial I / R-skada i Syngena C57BL / 6 möss H & E färgning (20X förstoring) av hjärtan från kontrolldjur (a) och från djur efter 4 h kall ischemi och 7 dagar reperfusion (b).. Långvarig I / R resulterade i en stark inflammatorisk reaktion med vävnads edEMA, hyperemia, infiltrerande leukocyter och mikrovaskulär ocklusion. I samma experimentella inställning Sirius röd färgning (40X förstoring) visade markerad interstitiell kollagendeponering efter l / R (d) jämfört med kontrollgruppen (C).
Figur 4:. Cardiac allograftöverlevnad Kaplan-Meier-kurva visar transplantatöverlevnad i syngena C57BL / 6-möss. Djur ware avlivas på postoperativ dag 7 för histopatologisk undersökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har genomfört över 200 hjärttransplantationer med framgång över 90% i olika experimentella inställningar. Med den teknik som beskrivs här, kan hela förfarandet utföras inom 60 min med en erfaren kirurg. Genom att framställa livmoder fartyg före tillvaratagande av organ, kan den totala transplantat ischemi tiden begränsas till 20 minuter. Tid för implantation (varm ischemi tid) är betydligt kortare använder manschetten tekniken jämfört med suturen tekniken 16.
Istället för att bara skära hjärtat som tidigare beskrivits 5,17, vi framkallar hjärtstillestånd genom perfusion transplantatet med en kliniskt används kardioplegiska lösning och hypotermi. Den kristalloid Custodiol HTK lösning innehåller 10 mmol / l kalium och låga koncentrationer av natrium, kalcium och magnesium, och effektivt stoppar hjärtat. Tillsatserna histidin, tryptofan och a-ketoglutarat minskar acidos, ger ATP och skydda cellmembranen DUring ischemi. Detta liknar det kliniska tillståndet av en kontrollerad hjärtstillestånd under öppen hjärtkirurgi och gör denna modell idealisk för undersökning av hjärtmuskel I / R-skada. Dessutom tillåter det tillämpning av farmakologiska medel inom kardioplegiska lösningen i början av kall ischemi. Lagring av transplantat vid 0-4 ° C är möjligt för en maximal tidsintervall om 4 h. En förlängd ischemi tid kan leda till hjärtmuskel hypocontractility kompliceras av översträckning av höger hjärtkammare och blödningar.
I vår erfarenhet, kommer några kritiska nyckelpunkter att underlätta en framgångsrik revaskularisering. Genom fullständig mobilisering av karotidartären och användningen av en låg profil Yasargil kläm maximal Vassel längd för anastomos kan bevaras. Vasospasm kan undvikas genom att släppa 1:10 utspätt papaverin på artären. För att undvika neurologisk försämring halspulsådern ligeras under bifurkationen att bevara säkerheter cirkulation till t Han inre halspulsådern. Kärllumen är noggrant dilateras med ett kärl dilatator med en superfin (0,2 mm) spets under undvikande bristning av väggen. I vår erfarenhet placeringen av hålla suturer som tidigare beskrivits 7 är inte obligatoriskt. Valet av manschetten storlek är avgörande för framgångsrik revaskularisering. Inner manschett diametern för arteriell anastomos bör vara något större än ytterdiametern hos den gemensamma halsartären (250-300 | im) för att svara för obalansen med den större aortaascendens av transplantatet. För möss vägande 20-25 g använder manschetter från 22 till 24 G (inre manschetten diameter från 0,510 till 0,643 mm) för halspulsådern och manschetter från 19 till 21 G (inre manschetten diameter från 0,724 till 0,912 mm) för den yttre halsvenen . Vi föredrar polyfilament suturmaterial (silke), eftersom detta underlättar knutar. Den mikrovaskulära klämman placeras på en förlängning av manschetten. Detta immobiliserar kärlet och underlättar eversion av väggen.
ove_content "> Hypotermi måste undvikas noga eftersom det förlänger återhämtningen och är en viktig orsak till perioperativ mortalitet. Antagonizable neuroleptanalgesia användning midazolam, medetomodine och fentanyl tillhandahåller god kirurgisk tolerans och fäster Förbättringen jämfört med ketamin / xylazin 18.Även livmoderhalscancer hjärttransplantation modell är en icke-fysiologisk, icke-laddad hjärta modell tack vare den unika riktningen på intrakardiellt blodflödet, är det ett oumbärligt verktyg i experimentell hjärttransplantation. De tekniska detaljerna som visas i den här videon papper bör tillåta undersökningar att upprätta denna modell relativt lätt i sina laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5, 733-735 (1973).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28, 565-570 (2008).
- Schramm, R., et al. The subepicardial microcirculation in heterotopically transplanted mouse hearts: an intravital multifluorescence microscopy study. J Thorac Cardiovasc Surg. 134, 210-217 (2007).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp : JoVE. 238, (2007).
- Gong, W., et al. Introduction of modified cervical cardiac transplant model in mice. Exp Clin Transplant. 10, 158-162 (2012).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Chen, H., Zhang, Y., Zheng, D., Praseedom, R. K., Dong, J. Orthotopic kidney transplantation in mice: technique using cuff for renal vein anastomosis. PloS one. 8, e77278 (2013).
- Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141, 682-689 (2007).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2010).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. Am J Pathol. 153, 1301-1310 (1998).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20, 1123-1128 (2001).
- Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth. Comp Med. 51, 443-456 (2001).
