Introduction
De harttransplantatie model wordt vaak gebruikt om I / R-schade, allograftafstoting, post-transplantvasculopathie en de efficiëntie van immunomodulerende middelen te onderzoeken. Muismodellen combineert vele voordelen, zoals de bekende immunologische en genetische achtergronden, de beschikbaarheid van vele inteelt en transgene stammen en relatief lage experimentele kosten.
In 1973, werd een techniek van abdominale harttransplantatie bij muizen eerst beschreven door Corry et al 1. In dit model transplantaten revascularisatie door end-to-side anastomose van de aorta ascendens abdominale aorta van de ontvanger en de belangrijkste longslagader de inferior vena cava. In 1991, een hechtdraad techniek voor cervicale harttransplantatie bij muizen werd beschreven door Chen et al 2. In dit model een retrograde coronaire perfusie wordt vastgesteld door anastomose van de halsslagader van de ontvanger aan de stijgende aorta van de grachterdek. Het veneuze bloed afvoeren via de coronaire sinus in het rechter atrium, het rechter ventrikel en uitgeworpen via de longslagader in de ontvangende uitwendige halsader (figuur 1). In vergelijking met de abdominale implantaat implantatie de cervicale model is minder invasief en oppervlakkige locatie van het implantaat maakt een zeer gemakkelijke toegankelijkheid voor aanvullende naonderzoeken (bijv palpatie, echocardiografie, intravitale fluorescentiemicroscopie) 3,4.
Ondanks technische verbeteringen 5,6, heeft een ruimer gebruik van dit model is beperkt als gevolg van technische problemen aan gehecht anastomosen van kleine schepen te voeren met een hoge incidentie van anastomosis lekkage en trombose. In 1991, Matsuura et al. introduceerde de manchet techniek waarbij de vaatwand wordt binnenstebuiten gekeerd op een synthetische cilinder, die sterk vergemakkelijkt het model van cervicale harttransplantatie 7. De techniek was further aangenomen voor diverse experimentele transplantatie modellen, waaronder de nieren 8, alvleesklier 9, ledematen 10, 11,12 lever-, long- 13,14 en vasculaire transplantatie 15. In vergelijking met de hechtdraad techniek de vereiste tijd voor anastomosen en aldus de warme ischemie korter is en er aanzienlijk minder vasculair complicaties met de manchet 16 techniek. Bovendien stelt chirurgen met weinig opleiding in microchirurgie om de operatie uit te voeren met een hoog slagingspercentage. Een nadeel van de manchet techniek is de vereiste ligering van de gemeenschappelijke halsslagader, die cerebrale perfusie kunnen veranderen.
In deze video paper presenteren we een verbeterde en vereenvoudigde manchet techniek voor cervicale harttransplantatie in muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door de Duitse Hart Centrum München en de regering van Beieren, Duitsland (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). De dieren werden gehuisvest in een bepaalde ziekteverwekker gratis faciliteit en kregen menselijke zorg in overeenstemming met de "Principles of Laboratory Animal Care" door de National Society for Medical Research en de "Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren" die door de National Academy geformuleerd van Wetenschappen en gepubliceerd door de National Institutes of Health (NIH Publication no. 86-23, herzien 1985).
LET OP: Een complete set van steriele microchirurgische instrumenten, waaronder twee gebogen pincet en schip dilatators, is noodzakelijk voor de procedure (Figuur 2a). Perioperatieve antibiotische profylaxe is niet routinematig nodig, maar bij immuungecompromitteerde dieren kan worden aangegeven. De dieren werden opgeofferd met klem isofluraan inademing.
Donor Voorbereiding en Graft Harvest
<ol>2. Ontvanger Voorbereiding
- Bereidende manchetten voor anastomosen door het snijden van de polyimide buis met een No. 11 scalpel of schaar onder de microscoop. De manchet bestaat uit een cilindrisch lichaam en een verlengstuk (1/3 van de omtrek) voor de plaatsing van de vasculaire klem, elk met een lengte van 1 mm (figuur 2b).
- Verdoven dier en bevestig chirurgische tolerantie zoals hierboven beschreven. Injecteren 0,25 ml warm zoutoplossing subcutaan (sc) voor vloeistof vervanging.
- Verwijder het haar van de juiste cervicale gebied met behulp van een elektrisch scheerapparaat en plaats het dier in liggende positie op een warm kussen. Zet de benen met strengen van tape, terwijl het vermijden overstrekken de voorste ledematen, want dit kan de ademhaling in gevaar brengen. Bedek de ogen behulp oogzalf tot droog voorkomen. Ontsmet de chirurgische plaats drie maal met chloorhexidine.
- Maak een dwarse incisie in de huid van rechts onderkaak hoek met de halsader notch.
- Botweg mobiliseren het externe halsader. Cauterize zijtakken met een bipolaire pincet en doorsnijden hen.
- Verdeel de externe halsader tussen ligaturen op het niveau van de samenvloeiing met de ader van de submandibulaire klier.
- Trek de externe halsader door de manchet en verstoppen het vat proximaal door een vasculaire klem op de verlenging van de manchet. Verwijder de ligatuur en irrigeren het lumen schip met 01:10 gehepariniseerde zoutoplossing.
- Evert de vaatwand op de manchet en bevestig het met een vooraf ingestelde omtrek 8-0 zijden ligatuur.
- Verwijder het oppervlakkige deel van de sternocleidomastoideus spier.
- Mobiliseren het recht gemeenschappelijke halsslagader en doorsnijden het schip tussen ligaturen onder de carotisbifurcatie.
- Trek de halsslagader door de manchet en verstoppen het vat proximaal door een Yasargil klem op de verlenging van de manchet. Verwijder de ligatuur en irrigeren het lumen schip met 01:10 gehepariniseerde zoutoplossing.
- Zachtjes dilate het arteriële lumen met een schip dilatator Evert de vaatwand op de manchet en bevestig het met een vooraf ingestelde omtrek 8-0 zijden ligatuur.
- Om voldoende ruimte voor graft implantatie krijgen, verwijdert u de juiste kwab van de submandibulaire klier.
- Houd het operatiegebied vochtige tot de implantatie.
3. Graft Implantatie
- Plaats het transplantaat in de ontvangende cervicale regio ondersteboven met de aorta mediaal georiënteerd en de longslagader zijwaarts.
- Trek de aorta van het transplantaat over de manchet met de halsslagader en zet de anastomose met een omtrek 8-0 zijden ligatuur.
- Incise de pulmonaire stam op de voorste aspect en trek het over de manchet met de externe halsader. Weer veilig de anastomose met een omtrek 8-0 zijden ligatuur.
- Verwijder de klem op de externe halsslagader, gevolgd door unclamping van de halsslagader. De harten vult onmiddellijk met bloed. Aan r verbetereneperfusion dalen 37 ° C warm zoutoplossing op het transplantaat. Normaal gesproken het hart ontwikkelt sinusritme binnen één minuut. Verwijder de manchet verlenging op het veneuze plaats.
- Let op de juiste positie graft, moet anastomoses spanningsvrij en schepen zonder torsie zijn. Niet dichtgeschroeid schepen van de huid, omdat dit kan wondgenezing schaden. Bloeden stopt meestal spontaan. Sluit de huid met een doorlopende hechting 8-0.
4. postoperatieve zorg
- Injecteren 0,25 ml warm zoutoplossing sc voor vloeistof vervanging.
- Om antagoniseren narcotica injecteren naloxon (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) en atipamezol (2,5 mg / kg lichaamsgewicht) sc links het dier op het warme pad totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging handhaven. Observeer het dier ten minste één extra uur anomalieën registreren. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot het volledig Recove niet terugrood.
- Geef preëmptieve analgetica met buprenorfine (0,05 mg / kg sc driemaal per dag) of een alternatief analgesie volgens een lokale institutioneel protocol voor een duur van 72 uur na de procedure.
- De chirurg en moet een dierenarts de dieren regelmatig te zien. In het geval van gewichtsverlies> 15%, apathie, zwelling of chirurgische kant infectie dieren worden gedood met behulp van terminal isofluraan inademing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ons team kon de beschreven techniek met succes uit te voeren na ongeveer 20 training operaties. De meest uitdagende gedeelte is de vaatwand van de halsslagader via manchet buiten keren, omdat dit flips heen en meerdere pogingen kan leiden tot scheuren van de wand. Na de stage, de gemiddelde totale operatieve tijd was 60 ± 8 min. Ongeveer 20 min nodig zijn voor de donor oogst, 25 min voor de bereiding van de cervicale schepen en 15 minuten voor anastomoses en de afsluiting huid.
Voor het onderzoek van myocardiale I / R-schade voerden we meer dan 200 operaties in syngene C57BL / 6 muizen in verschillende experimentele opstellingen met een chirurgische slagingspercentage van 92%. Vroege dood veroorzaakt door problemen bij het uitvoeren van de anastomosen (n = 3), naadlekkage (n = 2) hart- falen (n = 10). Één dier werd gedood na herstel als gevolg van neurologische stoornissen. Onder PO overlevenden transplantaatoverleving was> 95% bij7 dagen (figuur 4). Een aantal syngene transplantaat ontvangers zijn leven gehouden voor meer dan 3 maanden. Ondanks dat hij niet met behulp van antibiotica profylaxe, hebben we geen infectieuze complicaties te observeren.
In een eerste serie werden 12 syngene C57BL / 6-muizen getransplanteerd voor histopathologisch onderzoek (figuur 3). Transplantaten werden blootgesteld aan 4 uur koude ischemie door opslag op ijs bij 4 ° C vóór implantatie. Transplantaties werden geoogst 7 dagen na reperfusie en gekleurd met hematoxyline en eosine (H & E) en Sirius rood. Nontransplanted dieren (n = 6) dienden als controle. I / R leiden tot een sterke ontstekingsreactie met weefsel oedeem, hyperemie, infiltrerende leukocyten, microvasculaire occlusie en een interstitiële fibrose. In deze vroege serie dier overleed na herhaalde injectie van ketamine / xylazine. Deze complicatie kan verder worden voorkomen door volledige antagonizable verdoving zoals midazolam, medetomodine en fentanyl. < / p>
Figuur 1: (a) Schematische weergave van de bloedstroom in Heterotope Cervical harttransplantatie. Bloed uit halsslagader stroomt de ontvanger retrograde in de omhooggaande aorta en in de kransslagaders om de cardiale transplantaat perfuseren. Het veneuze bloed uitmondt in het rechter atrium via de coronaire sinus, vult het rechterventrikel en uitgeworpen via de longslagader in de externe halsader van de ontvanger. De linker ventrikel volledig omzeild. (B) Intraoperatieve View anastomosen. De stijgende aorta (2) wordt getrokken over de manchet van de halsslagader (1) en de pulmonale romp (3) over de manchet met de externe halsader (4). Op de foto de veneuze anastomose was nog niet afgerond.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: (a) Een complete set van steriele microchirurgische instrumenten, waaronder twee gebogen pincet en twee vat dilatators is vereist. (B) Voor anastomosen manchetten 19-24 G met verlenging en microvasculaire klemmen worden gebruikt.
Figuur 3: Histologische monsters Aantonen myocard I / R-schade in Syngene C57BL / 6 muizen H & E kleuring (20x vergroting) van de harten van controledieren (a) en van dieren na 4 uur koude ischemie en 7 dagen na reperfusie (b).. Langdurige I / R resulteerde in een sterke ontstekingsreactie met weefsel edema, hyperemie, infiltreren leukocyten en microvasculaire occlusie. In hetzelfde experimentele setting Sirius rood kleuring (40x vergroting) vertoonden duidelijk interstitieel collageen na I / R (d) vergeleken met de controlegroep (c).
Figuur 4:. Allograft Cardiac overleving Kaplan-Meier-curve tonen transplantaatoverleving in syngene C57BL / 6-muizen. Consumptieaardappelen dieren gedood op postoperatieve dag 7 voor histopathologisch onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben meer dan 200 cardiale transplantaties met een slagingspercentage van meer dan 90% in verschillende experimentele instellingen voltooid. Met de hier beschreven techniek, kan de volledige procedure binnen 60 minuten worden uitgevoerd door een ervaren chirurg. Door vóór orgaanverwerving de cervicale schepen voorbereiden, kan de totale transplantaat ischemie tijd worden beperkt tot 20 min. Tijd voor inplanting (warme ischemie tijd) aanzienlijk korter is met de manchet techniek in vergelijking met de hechtdraad 16 techniek.
In plaats van alleen het uitsnijden van het hart zoals hierboven beschreven 5,17, we hartstilstand veroorzaken perfuseren van het transplantaat met een klinisch gebruikte cardioplegische oplossing en onderkoeling. De kristalloïde Custodiol HTK oplossing bevat 10 mmol / l kalium en lage concentraties van natrium, calcium en magnesium, en effectief arresteert het hart. De additieven histidine, tryptofaan en een ketoglutaraat verminderen acidose, bieden ATP en beschermen van celmembranen during ischemie. Dit lijkt op de klinische conditie van een gecontroleerde hartstilstand tijdens open-hartchirurgie en is dit ideaal model voor het onderzoek van myocardiale I / R-schade. Bovendien maakt de toepassing van farmacologische middelen binnen de cardioplegische oplossing begin koude ischemie. Opslag van transplantaten bij 0-4 ° C kan maximaal tijdsinterval van 4 uur. Een langdurige ischemie tijd kan leiden tot myocard hypocontractility bemoeilijkt door overextension van de rechter hartkamers en bloeden.
In onze ervaring, zal een paar kritische key-punten succesvolle revascularisatie vergemakkelijken. Bij volledige inzet van de halsslagader en het gebruik van een low profile Yasargil clamp vassel maximale lengte voor anastomose kan worden behouden. Vasospasme kan worden vermeden door vallen 1:10 verdund papaverine op de slagader. Neurologische stoornis voorkomen dat de halsslagader onder de splitsing wordt geligeerd aan collaterale circulatie te behouden aan t Hij interne halsslagader. Het lumen van het vat wordt zorgvuldig verwijd met een schip dilatator met een superfijne (0,2 mm) tip terwijl het vermijden van scheuren van de muur. Volgens onze ervaringen plaatsing van hechtingen die zoals eerder beschreven 7 is niet verplicht. De selectie van de manchet grootte is van cruciaal belang voor een succesvolle revascularisatie. De manchet inwendige diameter arteriële anastomose moet iets groter zijn dan de buitendiameter van de gemeenschappelijke halsslagader (250-300 pm) overeenkomt met het mismatch met de grotere stijgende aorta van het implantaat zijn. Voor muizen met een gewicht van 20-25 g gebruik manchetten 22-24 G (binnenkant manchet diameter 0,510-0,643 mm) voor de halsslagader en manchetten 19-21 G (binnenkant manchet diameter 0,724-0,912 mm) voor de externe halsader . Wij geven de voorkeur polyfilament hechtmateriaal (zijde) omdat dit vergemakkelijkt knopen. De microvasculaire klem wordt geplaatst op de verlenging van de manchet. Dit immobiliseert het vat en vergemakkelijkt eversie van de wand.
ove_content "> moeten Onderkoeling zorgvuldig worden vermeden, omdat dit verlengt het herstel en is een belangrijke oorzaak van perioperatieve mortaliteit. Antagonizable neuroleptanalgesia met midazolam, medetomodine en fentanyl zorgt voor een goede chirurgische tolerantie en vastmaakt herstel in vergelijking met ketamine / xylazine 18.Hoewel het cervicale harttransplantatiemodel een niet-fysiologische, onbelaste hartmodel vanwege de unieke directionaliteit van intracardiale stroom is een onmisbaar hulpmiddel in experimentele harttransplantatie. De technische details die in deze video papier moet laten onderzoeken om dit model in hun laboratoria relatief eenvoudig vast te stellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5, 733-735 (1973).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28, 565-570 (2008).
- Schramm, R., et al. The subepicardial microcirculation in heterotopically transplanted mouse hearts: an intravital multifluorescence microscopy study. J Thorac Cardiovasc Surg. 134, 210-217 (2007).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp : JoVE. 238, (2007).
- Gong, W., et al. Introduction of modified cervical cardiac transplant model in mice. Exp Clin Transplant. 10, 158-162 (2012).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Chen, H., Zhang, Y., Zheng, D., Praseedom, R. K., Dong, J. Orthotopic kidney transplantation in mice: technique using cuff for renal vein anastomosis. PloS one. 8, e77278 (2013).
- Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141, 682-689 (2007).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2010).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. Am J Pathol. 153, 1301-1310 (1998).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20, 1123-1128 (2001).
- Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth. Comp Med. 51, 443-456 (2001).
