Introduction
Le modèle de la transplantation cardiaque est fréquemment utilisé pour enquêter sur I / R-blessure, le rejet d'allogreffe, la vasculopathie post-transplantation et l'efficacité des agents immunomodulateurs. Des modèles de souris combinent de nombreux avantages comme le immunologique connu et origines génétiques, la disponibilité de nombreuses souches consanguines et transgéniques expérimentales et les coûts relativement faibles.
En 1973, une technique de abdominale transplantation cardiaque chez la souris a été décrite par Corry et al 1. Dans ce modèle greffons sont revascularisés par anastomoses de l'aorte ascendante à l'aorte abdominale du destinataire et de l'artère pulmonaire principale à la veine cave inférieure end-to-côté. En 1991, une technique de suture du col pour une transplantation cardiaque chez la souris a été décrit par Chen et al deux. Dans ce modèle, une perfusion de l'artère coronaire rétrograde est établie par anastomose de l'artère carotide du bénéficiaire de l'aorte ascendante du grarrière. Les drains veineux via le sinus coronaire de sang dans l'oreillette droite, le ventricule droit et est éjecté par l'artère pulmonaire dans le receveur veine jugulaire externe (Figure 1). Par rapport à la greffe implantation abdominale le modèle col de l'utérus est moins invasive et l'emplacement superficiel de la greffe permet une accessibilité très facile pour les examens de suivi supplémentaires (par exemple, la palpation, l'échocardiographie, la microscopie à fluorescence intravitale) 3,4.
Malgré les améliorations techniques 5,6, une utilisation plus généralisée de ce modèle a été limitée en raison de difficultés techniques pour réaliser des anastomoses suturées de petits navires avec une incidence élevée de fuite de l'anastomose et la thrombose. En 1991, Matsuura et al. introduit la technique de manchon dans lequel la paroi du vaisseau est éversée sur un cylindre synthétique, ce qui facilite grandement le modèle de transplantation cardiaque du col 7. La technique était fucomplémen adopté pour différents modèles de transplantation expérimentales dont 8 rénale, pancréatique 9, branche 10, 11,12 hépatique, du poumon et de la transplantation 13,14 vasculaire 15. Par rapport à la technique de suture de la durée requise pour anastomoses et, par conséquent, le temps d'ischémie chaude est plus courte et il ya des complications vasculaires beaucoup moins en utilisant la technique de la coiffe 16. En outre, il permet aux chirurgiens avec peu de formation en microchirurgie pour effectuer l'opération avec un taux de réussite élevé. Un inconvénient de la technique du brassard est la ligature préalable de l'artère carotide commune, ce qui peut modifier la perfusion cérébrale.
Dans ce papier, nous présentons une vidéo technique de brassard améliorée et simplifiée pour cervicale transplantation cardiaque chez la souris.
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Protocol
Toutes les expériences ont été approuvés par l'Allemand Coeur Centre de Munich et le gouvernement de Bavière, Allemagne (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). Les animaux ont été logés dans un établissement exempt d'organismes pathogènes spécifiques et ont reçu des soins humaine en conformité avec les «Principes de laboratoire Animal Care" formulées par la Société nationale pour la recherche médicale et le «Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire" fournies par la National Academy des sciences et publié par les National Institutes of Health (NIH Publication no. 86-23, révisé 1985).
REMARQUE: Un ensemble complet d'instruments de microchirurgie stériles, y compris les deux pinces courbes et dilatateurs des vaisseaux, est nécessaire pour la procédure (Figure 2a). Antibioprophylaxie péri-opératoires ne sont pas systématiquement nécessaire mais peut être indiqué chez les animaux immunodéprimés. Les animaux ont été sacrifiés en utilisant l'inhalation isoflurane terminal.
Préparation des donateurs et des greffons récolte
<ol>2. Bénéficiaire Préparation
- Préparerles poignets pour anastomoses en coupant le tube de polyimide avec un scalpel n ° 11 ou une paire de ciseaux au microscope. La coiffe est constituée d'un corps cylindrique et un prolongement (1/3 de la circonférence) pour la mise en place de la pince vasculaire, chacune d'une longueur de 1 mm (figure 2b).
- Anesthésier l'animal et confirmer la tolérance chirurgical comme décrit ci-dessus. Injecter 0,25 ml solution saline chaude voie sous-cutanée (sc) pour le remplacement des liquides.
- Enlever les poils de la région cervicale droite en utilisant un rasoir électrique et placer l'animal dans une position couchée sur un bloc chaud. Fixez les pieds avec des brins de bande tout en évitant surexploiter les membres antérieurs, car cela peut compromettre la respiration. Couvrir les yeux à l'aide pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse. Désinfecter le site chirurgical à trois reprises avec de la chlorhexidine.
- Faire une incision de la peau transversale de l'angle mandibulaire droit à la veine jugulaire.
- Carrément mobiliser la posteveine jugulaire ernal. Cauterize branches latérales avec une pince bipolaire et transect eux.
- Divisez la veine jugulaire externe entre ligatures au niveau de la confluence avec la veine de la glande sous-maxillaire.
- Tirer la veine jugulaire externe par l'intermédiaire du manchon et de manière proximale occlure le vaisseau en plaçant une pince vasculaire sur le prolongement de la manchette. Retirer la ligature et irriguer la lumière du vaisseau avec une solution saline héparinée 01h10.
- Evert la paroi du vaisseau sur la manchette et le fixer avec un préréglage circonférentielle 8-0 ligature de soie.
- Retirer la partie superficielle du muscle sterno.
- Mobiliser le droit artère carotide commune et sectionner le navire entre ligatures en dessous de la bifurcation carotidienne.
- Tirer la carotide par l'intermédiaire du manchon et de manière proximale occlure le vaisseau en plaçant une pince Yasargil sur le prolongement de la manchette. Retirer la ligature et irriguer la lumière du vaisseau avec une solution saline héparinée 01h10.
- Doucement Dilate la lumière artérielle avec un dilatateur des vaisseaux, Evert la paroi du vaisseau sur la manchette et le fixer avec un préréglage circonférentielle 8-0 ligature de soie.
- Pour gagner assez d'espace pour implantation du greffon, enlever le lobe droit de la glande sous-maxillaire.
- Gardez le champ opératoire humide jusqu'à l'implantation.
3. implantation du greffon
- Placez la greffe chez le receveur région cervicale à l'envers avec l'aorte orienté médiane et l'artère pulmonaire latéralement.
- Tirez l'aorte de la greffe sur le brassard avec l'artère carotide et sécuriser l'anastomose avec un périphérique 8-0 ligature de soie.
- Inciser le tronc pulmonaire sur sa face antérieure et le tirer sur le brassard avec la veine jugulaire externe. Encore une fois sécuriser l'anastomose avec un périphérique 8-0 ligature de soie.
- Retirer la pince sur la veine jugulaire externe, à la suite par le desserrage de l'artère carotide. Les cœurs se remplit immédiatement avec du sang. Pour améliorer reperfusion baisse de 37 ° C une solution saline chaude sur la greffe. Normalement, le coeur se développe rythme sinusal en une minute. Retirez l'extension du brassard sur le site veineux.
- Veiller à la position correcte de la greffe, anastomoses doit être exempte de tensions et de navires sans torsion. Ne pas les navires cautérisées de la peau, car cela pourrait nuire à la cicatrisation des plaies. Habituellement, l'hémorragie arrête spontanément. Fermez la peau avec un seul 8-0 suture continue.
4. Soins postopératoires
- Injecter 0,25 ml chaude sc de solution saline pour le remplacement des liquides.
- Pour contrer les stupéfiants injectent naloxone (1,2 mg / kg), le flumazénil (0,5 mg / kg) et atipamezol (2,5 mg / kg de poids corporel) sc laissé les animaux sur le pavé chaud jusqu'à ce qu'il ait repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. Observez l'animal pendant au moins une heure supplémentaire pour enregistrer tout comportement anormal. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à leur entière Recoverouge.
- Fournir l'analgésie préventive de la buprénorphine (0,05 mg / kg sc trois fois par jour) ou une analgésie alternatif selon un protocole institutionnel local pour une durée minimale de 72 heures après l'intervention.
- Le chirurgien et un vétérinaire devraient voir des animaux régulièrement. En cas de perte de poids> 15%, de l'apathie, de l'enflure ou chirurgicales animaux d'infection de côté sont euthanasiés en utilisant l'inhalation isoflurane terminal.
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Representative Results
Notre équipe pourrait effectuer avec succès la technique décrite après environ 20 chirurgies de formation. La partie la plus difficile est de retourner la paroi de la cuve de l'artère carotide sur le brassard, parce qu'il retourne facilement en arrière et de multiples tentatives peut conduire à la déchirure de la paroi. Après la période de formation, le temps opératoire total moyen était de 60 ± 8 min. Environ 20 minutes sont nécessaires pour la récolte des donateurs, 25 min pour la préparation des vaisseaux cervicaux et 15 minutes pour anastomoses et fermeture de la peau.
Pour l'enquête de l'I / R-lésion myocardique nous avons effectué plus de 200 opérations dans syngénéique C57BL / 6 dans divers paramètres expérimentaux avec un taux de réussite chirurgicale de 92%. Une mort prématurée a été causé par des difficultés dans la réalisation des anastomoses (n = 3), une fuite anastomotique (n = 2) et l'insuffisance cardio-pulmonaire (n = 10). Un animal a été euthanasié après la récupération en raison de troubles neurologiques. Parmi les survivants périopératoires, la survie du greffon était> 95% à7 jours (figure 4). Un certain nombre de bénéficiaires de greffe syngéniques ont été maintenus en vie pendant plus de 3 mois. Malgré ne pas utiliser une antibioprophylaxie, on n'a pas observé de complications infectieuses.
Dans une première série, 12 syngéniques souris C57BL / 6 ont été transplantés pour les examens histopathologiques (Figure 3). Les greffes ont été exposés à 4 heures d'ischémie froide de stockage sur de la glace à 4 ° C avant l'implantation. Les transplantations ont été récoltées après 7 jours de reperfusion et colorées à l'hématoxyline et de l'éosine (H & E) et Sirius rouge. Animaux non transplantés (n = 6) ont servi de témoins. I / R conduisent à une forte réaction inflammatoire avec œdème des tissus, hyperémie, leucocytes infiltrant, occlusion microvasculaire et une fibrose interstitielle. Dans cette série tôt un animal est mort après une injection répétée de la kétamine / xylazine. Cette complication pourrait encore être évité en utilisant une anesthésie entièrement antagonizable y compris midazolam, medetomodine et le fentanyl. < / p>
Figure 1: (a) Illustration schématique du flux sanguin dans Heterotopic cervicale Transplantation cardiaque. Le sang provenant des flux de l'artère carotide du destinataire rétrograde dans l'aorte ascendante et dans les artères coronaires pour perfuser du greffon cardiaque. Les drains de sang veineux dans l'oreillette droite via le sinus coronaire, remplit le ventricule droit et est éjecté par l'artère pulmonaire dans la veine jugulaire externe du destinataire. Le ventricule gauche est complètement ignorée. (B) Voir peropératoire des anastomoses. L'aorte ascendante (2) est tiré au-dessus de la manchette à l'artère carotide (1) et le tronc pulmonaire (3) sur le manchon avec la veine jugulaire externe (4). Dans l'image de l'anastomose veineuse n'a pas encore été achevé.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: (a) Un ensemble complet d'instruments de microchirurgie stériles dont deux pince courbe et deux dilatateurs des vaisseaux est nécessaire. (B) Pour les anastomoses poignets de 19-24 G avec une extension et microvasculaires pinces sont utilisés.
Figure 3: histologique échantillons Démontrer myocarde I / R-dommage dans syngéniques C57BL / 6 coloration H & E (20X grossissement) de coeurs d'animaux de contrôle (a) et des animaux après 4 h ischémie froide et 7 jours de reperfusion (b).. Je prolongé / R a entraîné une forte réaction inflammatoire avec Ed tissulaireema, hyperémie, leucocytes infiltrant et occlusion microvasculaire. Dans le même cadre expérimental Sirius coloration rouge (40X) a montré marqué le dépôt de collagène interstitiel après I / R (d) par rapport au groupe de contrôle (C).
Figure 4:. Allogreffe cardiaque de survie de Kaplan-Meier figurent la survie du greffon dans C57BL / 6 syngéniques. Animaux Ware euthanasiés le jour postopératoire 7 pour un examen histopathologique.
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Discussion
Nous avons réalisé plus de 200 greffes cardiaques avec un taux de réussite de plus de 90% dans divers paramètres expérimentaux. Avec la technique décrite ici, la procédure complète peut être effectuée dans les 60 minutes par un chirurgien expérimenté. En préparant les vaisseaux cervicaux avant le prélèvement d'organes, le temps total greffon ischémie peut être limité à 20 min. Le temps d'implantation (temps d'ischémie chaude) est significativement plus courte en utilisant la technique de la coiffe par rapport à la technique de suture 16.
Au lieu d'exciser tout simplement le cœur comme décrit précédemment 5,17, nous induire un arrêt cardiaque par perfusion la greffe avec une solution cardioplégique utilisé cliniquement par hypothermie. La solution cristalloïde Custodiol HTK contient 10 mmol / l de potassium et de faibles concentrations de sodium, de calcium et de magnésium, et arrête efficacement le cœur. Les additifs de l'histidine, le tryptophane et l'a-cétoglutarate de réduire l'acidose, fournissent l'ATP et de protéger les membranes cellulaires Duanneau ischémie. Cela ressemble à l'état clinique d'un arrêt cardiaque contrôlée pendant la chirurgie à cœur ouvert et rend ce modèle idéal pour l'enquête de l'I / R-lésion myocardique. En outre, elle permet l'application d'agents pharmacologiques à l'intérieur de la solution cardioplégique au début de l'ischémie froide. Le stockage des greffons à 0-4 ° C est possible pour un intervalle de temps maximum de 4 heures. Un temps d'ischémie prolongée peut conduire à l'infarctus du hypocontractilité compliquée par surextension des cavités cardiaques droites et des saignements.
Dans notre expérience, quelques points-clés critiques faciliteront revascularisation réussie. En mobilisation complète de l'artère carotide et l'utilisation d'un faible profil Yasargil maximale de serrage de longueur vassel pour anastomose peut être conservé. Le vasospasme peut être évité en laissant tomber 01:10 papaverine dilué sur l'artère. Pour éviter des troubles neurologiques de l'artère carotide est ligaturé sous la bifurcation pour préserver la circulation collatérale à t il artère carotide interne. La lumière du vaisseau est soigneusement dilaté avec un dilatateur des vaisseaux avec un ultra-fin (0,2 mm) pointe tout en évitant la déchirure de la paroi. Dans notre expérience, le placement des sutures de maintien comme décrit précédemment 7 est pas obligatoire. La sélection de la taille brassard est crucial pour la revascularisation réussie. Le diamètre interne du brassard pour anastomose artérielle doit être un peu plus grand que le diamètre extérieur de l'artère carotide commune (250 à 300 um) pour tenir compte de la non-concordance avec le plus grand aorte ascendante du greffon. Pour souris pesant 20-25 g Utilisez poignets de 22 à 24 G (diamètre intérieur brassard de 0,510 à 0,643 mm) pour l'artère carotide et poignets de 19 à 21 G (diamètre intérieur brassard de 0,724 à 0,912 mm) pour la veine jugulaire externe . Nous préférons matériel de suture polyfilament (de soie) car cela facilite nouage. La pince microvasculaire est placée sur le prolongement de la manchette. Ceci immobilise le récipient et facilite le retournement de la paroi.
ove_content "> hypothermie doit être soigneusement évitée car elle prolonge la récupération et est une cause majeure de mortalité périopératoire. neuroleptanalgésie Antagonizable utilisant midazolam, fentanyl medetomodine et fournit une bonne tolérance chirurgicale et fixe la récupération par rapport à la kétamine / xylazine 18.Bien que le modèle de transplantation cardiaque col de l'utérus est un non-physiologique, modèle de coeur non chargé en raison de la directionnalité unique de flux sanguin intracardiaque, il est un outil indispensable dans la transplantation cardiaque expérimentale. Les détails techniques présentés dans ce document vidéo devraient permettre des recherches pour établir ce modèle relativement facile dans leurs laboratoires.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
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