Introduction
מודל השתלת לב משמש לעתים קרובות כדי לחקור I / R-פגיעה, דחיית שתל, vasculopathy לאחר ההשתלה ואת היעילות של סוכני אימונומודולטוריים. מודלים העכבר לשלב יתרונות רבים כמו חיסוני הידועות ורקע גנטי, זמינותם של רבים זנים טהורים ומהונדסים ועלויות ניסוי נמוכות יחסית.
בשנת 1973, טכניקה של השתלת לב בבטן בעכברים תוארה לראשונה על ידי קורי et al 1. במודל זה שתלי הם revascularized ידי anastomoses קצה לצד של אב העורקים עולים לאב העורקים בבטן של הנמען ושל עורק הריאה הראשי לוריד הנבוב הנחות. בשנת 1991, טכניקת תפר להשתלת לב בצוואר הרחם בעכברים שתוארה על ידי חן et al 2. במודל זה זלוף עורקים הכליליים מדרדר היא הוקמה על ידי השקה של עורק התרדמה של הנמען לאב העורקים העולה של גראחורי. ניקוז ורידי הדם באמצעות סינוס כלילית לעלייה ימנית, החדר ממני והוא נפלט דרך עורק הריאה לוריד הנמען החיצוני הצוואר (איור 1). בהשוואה להשתלת שתל בטן מודל צוואר הרחם הוא פחות פולשנית והמיקום השטחי של השתל מאפשר נגישות קלה מאוד לבדיקות מעקב נוספות (למשל מישוש, אקו, מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital) 3,4.
למרות שיפורים טכניים 5,6, שימוש נרחב יותר של מודל זה הוגבל בשל קשיים טכניים לבצע anastomoses נתפר של כלי דם קטנים עם שכיחות גבוהה של דליפת השקה ופקקת. בשינה 1991, Matsuura et al. הציג את טכניקת השרוול שבקיר הכלי הוא everted מעל גליל סינטטי, אשר מאוד מקל המודל של לב צוואר רחם השתלה 7. הטכניקה הייתה פוrther אימץ למודלים השתלה ניסיוניים שונים, כוללים כליות 8, 9 לבלב, איבר 10, 11,12 בכבד, ריאות וכלי דם והשתלות 13,14 15. בהשוואה לטכניקת תפר הזמן הנדרש לanastomoses ו, ובכך, זמן איסכמיה החם הוא קצר יותר ויש סיבוכים משמעותי פחות כלי דם באמצעות טכניקת השרוול 16. יתר על כן, היא מאפשרת למנתחים עם קצת אימון במייקרו כדי לבצע את הפעולה עם שיעור הצלחה גבוה. חסרון של טכניקת השרוול הוא קשירת התנאי של עורק התרדמה המשותפת, אשר עשוי לשנות זלוף המוחין.
במאמר זה אנו מציגים וידאו טכניקת שרוול משופרת ופשוטה להשתלת לב בצוואר הרחם בעכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים אושרו על ידי הגרמני לב המרכז מינכן וממשלת בוואריה, גרמניה (GZ. 55.2-1-54-2532.3-17-13). בעלי חיים שוכנו במתקן הפתוגן ללא ספציפי וקיבלו טיפול אנושי בעמידה ב" העקרונות של מעבדה טיפול בבעלי חיים "שגובשו על ידי האגודה הלאומית למחקר רפואי ו" המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה" הניתן על ידי האקדמיה הלאומית למדעים ופורסם על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH פרסום לא. 86-23, מתוקן 1985).
הערה: סט שלם של מכשירי מייקרו סטרילי, כוללים שני מלקחיים מעוקלים וdilatators כלי, הכרחית להליך (איור 2 א). טיפול מונע באנטיביוטיקה סביב ניתוח הוא לא באופן שגרתי הכרחי אך ניתן להצביע בבעלי חיים מדוכאי חיסון. בעלי חיים הוקרבו באמצעות שאיפת isoflurane מסוף.
תורם הכנה ושתל קציר
<ol>2. הכנת נמען
- הכןהאזיקים לanastomoses על ידי חיתוך צינורות polyimide עם אזמל מס '11 או מספריים מתחת למיקרוסקופ. השרוול מורכב מגוף גלילי והארכה (1/3 של ההיקף) למיקום של מהדק כלי הדם, כל אחד מאורך של 1 מ"מ (איור 2b).
- להרדים את החיה ולאשר סובלנות כירורגית כפי שתואר לעיל. להזריק 0.25 מיליליטר תת עורי המלוח חם פתרון (SC) להחלפת נוזל.
- להסיר את השיער באזור צוואר הרחם תקין באמצעות מכונת גילוח חשמלית ומניח את החיה במצב שכיבה על משטח חם. אבטח את הרגליים עם גדילים של קלטת, תוך הימנעות מתיחת יתר הגפיים הקדמיים כמו זה יכול להתפשר נשימה. מכסה את העיניים בעזרת משחת עיניים כדי למנוע יובש. לחטא את האתר כירורגית שלוש פעמים עם chlorhexidine.
- לעשות חתך בעור רוחבי מזווית לסת זכות חריץ הצוואר.
- בבוטות לגייס שלוחהוריד הצוואר ernal. לצרוב ענפים בצד עם מלקחיים דו קוטביים ותחצה אותם.
- מחלקים את וריד הצוואר החיצוני בין חיבורי אותיות ברמה של המפגש עם הווריד מבלוטת submandibular.
- משוך את וריד הצוואר החיצוני דרך השרוול ולחסום את כלי proximally על ידי הצבת מהדק כלי דם על הרחבה של השרוול. הסר את המייתר ולהשקות את לומן כלי עם 01:10 מלוח heparinized.
- אוורט קיר הכלי מעל השרוול ולתקן את זה עם קשירת משי מראש 8-0 היקפי.
- הסר את החלק השטחי של שריר sternocleidomastoid.
- לגייס את עורק תרדמה המשותף תקין ויחצה את הכלי בין חיבורי אותיות מתחת להסתעפות התרדמה.
- משוך את העורק הראשי דרך השרוול ולחסום את כלי proximally על ידי הצבת מהדק Yasargil על ההארכה של השרוול. הסר את המייתר ולהשקות את לומן כלי עם 01:10 מלוח heparinized.
- בעדינות dilatדואר לומן עורקים עם dilatator כלי, אוורט קיר הכלי מעל השרוול ולתקן את זה עם קשירת משי מראש 8-0 היקפי.
- כדי להשיג מספיק מקום להשתלת שתל, להסיר את האונה הימנית של בלוטת submandibular.
- שמור את שדה הניתוח לח עד השתלה.
3. שתל השרשה
- מניחים את השתל באזור צוואר רחם הנמען הפוך עם אב העורקים חוקיים מדיאלית ועורק הריאה רוחבית.
- משוך את אב העורקים של השתל על השרוול עם העורק הראשי ולאבטח את ההשקה עם קשירת 8-0 משי היקפי.
- לחתוך את תא המטען ריאתי בהיבט הקדמי שלה ולמשוך אותו מעל השרוול עם וריד הצוואר החיצוני. שוב לאבטח את ההשקה עם קשירת 8-0 משי היקפי.
- הסר את המהדק על וריד הצוואר החיצוני, הבא על ידי unclamping של עורק התרדמה. הלב מתמלא מייד בדם. כדי לשפר reperfusion שחרר 37 מעלות תמיסת מלח חמה C על השתל. בדרך כלל לב מפתחת קצב סינוס בתוך דקה אחת. הסר את סיומת השרוול באתר הוורידים.
- ודא עמדת שתל נכונה, anastomoses חייב להיות מתח חופשי וכלי ללא פיתול. אל כלי צרובים של העור שכן הדבר עלולים לפגוע בריפוי פצע. דימום בדרך כלל מפסיק באופן ספונטני. סגור את העור עם תפר רציף אחת 8-0.
4. לאחר ניתוח טיפול
- הזרק sc תמיסת מלח 0.25 מיליליטר החם להחלפת נוזל.
- להרגיז סמים להזריק נלוקסון (1.2 מ"ג / קילוגרם), flumazenil (0.5 מ"ג / קילוגרם) וatipamezol (2.5 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) sc שמאל את החיה על הכרית החמה עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור על כיבה sternal. שימו לב לבעלי החיים, לפחות שעה אחת נוספת לרשום כל התנהגות חריגה. אל תחזרו לבעלי חיים שעברו ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים, עד recove מלאאדום.
- לספק שיכוך כאבים מקדים עם עצירות (0.05 מ"ג / קילוגרם sc שלוש פעמים ביום) או שיכוך כאבים חלופיים בהתאם לפרוטוקול מוסדי מקומי למשך מינימום של 72 שעות לאחר ההליך.
- המנתח ורופא וטרינר צריך לראות בעלי חיים באופן קבוע. במקרה של ירידה במשקל> 15%, אדישות, נפיחות או בעלי חיים זיהום הצד כירורגית מורדמים באמצעות שאיפת isoflurane מסוף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צוות שלנו בהצלחה יכול לבצע את הטכניקה שתוארה לאחר כ -20 ניתוחי אימונים. החלק המאתגר ביותר הוא אוורט קיר הכלי של עורק התרדמה על השרוול, כי זה בקלות מעיף אחורה וניסיונות מרובים עלולים להוביל לקריעה של הקיר. לאחר תקופת ההכשרה, זמן הניתוח הכולל הממוצע היה 60 ± 8 דקות. בסביבות 20 דקות נדרשות לקציר תורם, 25 דקות להכנת כלי צוואר הרחם ו -15 דקות לanastomoses וסגירת עור.
לחקירה שלי / R-פגיעה בשריר הלב ביצענו מעל 200 פעולות בעכברי C57BL / 6 syngeneic בהגדרות ניסיוניות שונות עם שיעור הצלחה ניתוחי של 92%. מוות מוקדם נגרם על ידי קשיים בביצוע anastomoses (n = 3) דליפה, בהשקה (n = 2) וכישלון לב-ריאה (n = 10). חיה אחת הייתה מורדמים לאחר התאוששות בשל ליקוי נוירולוגים. בין ניצולים סביב ניתוח, הישרדות שתל הייתה> 95% ב7 ימים (איור 4). מספר מקבלי שוחד syngeneic נשמר בחיים במשך 3 חודשים. למרות שלא באמצעות טיפול מונע באנטיביוטיקה, אנחנו לא רואים שום סיבוכי זיהומיות.
בסדרה ראשונה, 12 C57BL / 6 עכברי syngeneic הושתלו לבחינות ההיסטופתולוגיים (איור 3). שתלי נחשפו עד 4 שעות של איסכמיה הקרה על ידי אחסון על קרח על 4 מעלות צלזיוס לפני ההשתלה. השתלות נקצרו לאחר 7 ימים של reperfusion ומוכתם בhematoxylin ו eosin (H & E) ואדום סיריוס. בעלי החיים Nontransplanted (n = 6) שימש כקבוצת ביקורת. אני / R להוביל לתגובה דלקתית חזקה עם בצקת רקמה, hyperemia, leucocytes הסתננות, חסימת כלי דם וסיסטיק ביניים. בסדרה מוקדמת זו חיה אחת מתה לאחר הזרקה חוזרת ונשנית של קטמין / xylazine. סיבוך זה יכול להימנע על ידי שימוש נוסף הרדמה antagonizable מלאה כולל midazolam, medetomodine ופנטניל. < / P>
איור 1: (א) איור סכמטי של זרימת דם בצוואר הרחם Heterotopic לב להשתלות. דם מהעורק הראשי התזרים של הנמען מדרדר לאב העורקים עולים ולעורקים הכליליים לperfuse שתל הלב. ניקוז דם הוורידים לעלייה הימנית באמצעות סינוס כלילית, ממלא את החדר ממני והוא נפלט דרך עורק הריאה לוריד הצוואר החיצוני של הנמען. החדר השמאלי הוא עקף לחלוטין. (ב) Intraoperative צפה של anastomoses. אב העורקים עולים (2) הוא עצר את השרוול עם עורק התרדמה (1) ותא המטען ריאתי (3) על השרוול עם וריד הצוואר החיצוני (4). בתמונת ההשקה הוורידים עדיין לא הושלמה.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: (א) קבוצה של מכשירי מייקר סטרילי כוללים שני מלקחיים מעוקלים ושתי dilatators כלי מלאה נדרש. (ב) לanastomoses אזיקים 19-24 G עם מהדק הרחבה וכלי דם משמשים.
דוגמאות היסטולוגית הדגמת שריר לבי / R-פגיעה בsyngeneic C57BL / 6 עכברים H & מכתים E (הגדלת 20X) של לב מבעלי החיים שליטה (א) ומבעלי החיים לאחר איסכמיה הקרה 4 שעות ו -7 ימים של reperfusion (ב): איור 3.. אני ממושך / R הביא תגובה דלקתית חזקה עם אד הרקמהEMA, hyperemia, leucocytes הסתננות וחסימת כלי דם. בצביעה אדומה סיריוס הגדרה ניסיונית זהה (הגדלת 40X) הראה מסומן בתצהיר קולגן ביניים אחרי שR (ד) בהשוואה לקבוצת הביקורת (ג) /.
איור 4: עלילת לב שתל הישרדות קפלן-מאייר מוצגות הישרדות שתל בעכברי C57BL / 6 syngeneic.. בעלי חיים ור מורדמים ביום שלאחר ניתוח 7 לבדיקה ההיסטופתולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנו מעל 200 השתלות הושלמו לב עם שיעור הצלחה מעל 90% בהגדרות ניסוי שונים. עם הטכניקה שתוארה כאן, ההליך המלא ניתן לעשות זאת בתוך 60 דקות על ידי מנתח מנוסה. על ידי הכנת כלי צוואר הרחם לפני רכש איבר, הכולל זמן איסכמיה השתל יכול להיות מוגבל ל- 20 דקות. זמן להשתלה (זמן איסכמיה חם) הוא קצר יותר באופן משמעותי שימוש בטכניקת השרוול לעומת טכניקת תפר 16.
במקום פשוט מוציא את הלב כפי שתואר קודם לכן 5,17, אנו לגרום התקף לב על ידי מרוסס השתל עם פתרון cardioplegic בשימוש קליני ועל ידי היפותרמיה. פתרון Custodiol HTK גְבִישָׁן מכיל 10 mmol / L אשלגן וריכוזים נמוכים של נתרן, סידן ומגנזיום, וביעילות, עוצר את הלב. תוספי היסטידין, טריפטופן ו- ketoglutarate להפחית חמצת, לספק ATP ולהגן על קרום תא duאיסכמיה טבעת. זה דומה למצב הקליני של דום לב בשליטה במהלך ניתוח לב פתוח ועושה את זה מודל אידיאלי לחקירה שלי / R-פגיעה בשריר הלב. יתר על כן, היא מאפשרת יישום של סוכנים תרופתיים בפתרון cardioplegic בתחילת איסכמיה הקרה. אחסון של שתלים ב0-4 מעלות צלזיוס אפשרי עבור מרווח זמן מרבי של 4 שעות. זמן איסכמיה ממושך עלול להוביל לhypocontractility שריר לב מסובך overextension של חדרי לב תקין ודימום.
מניסיוננו, כמה מפתח נקודות קריטיות תקל revascularization המוצלחת. על ידי גיוס מלא של עורק התרדמה והשימוש באורך נמוך Yasargil הפרופיל מרבי מהדק vassel להשקה יכולה להישמר. ניתן להימנע vasospasm על ידי הטלת 01:10 papaverine מדולל על העורק. כדי להימנע מליקוי נוירולוגי עורק התרדמה הוא ligated מתחת להסתעפות לשמר את זרימת הדם בטחונות כדי לא הוא עורק תרדמה פנימי. לומן הכלי הוא מורחב בזהירות עם dilatator כלי עם קצה איכותי מאוד (0.2 מ"מ), תוך הימנעות קריעה של הקיר. מניסיוננו את המיקום של תפרים מחזיקים כפי שתואר לעיל 7 הוא לא חובה. הבחירה של גודל שרוול היא קריטית עבור revascularization המוצלחת. קוטר השרוול הפנימי להשקת עורקים צריך להיות קצת יותר גדול מהקוטר החיצוני של עורק התרדמה המשותף (250-300 מיקרומטר) כדי להסביר את חוסר ההתאמה עם אב העורקים עולים גדולים יותר של השתל. לעכברים במשקל אזיקי שימוש 20-25 גרם 22-24 G (קוטר פנימי שרוול 0.510-0.643 מ"מ) לעורק הראשי וחפתים 19-21 G (קוטר פנימי שרוול 0.724-0.912 מ"מ) לוריד הצוואר החיצוני . אנחנו מעדיפים חומר polyfilament תפר (משי) כמו זה מקל קשירה. מהדק כלי הדם מונח על ההארכה של השרוול. זה מגביל את הכלי ומאפשר eversion של הקיר.
ove_content "> היפותרמיה יש להימנע בזהירות שכן הוא מאריך התאוששות והוא אחד גורמים עיקריים לתמותה סביב ניתוח. neuroleptanalgesia Antagonizable באמצעות midazolam, medetomodine ופנטניל מספק סובלנות כירורגית טובה ומהדק התאוששות בהשוואה לקטמין / xylazine 18.למרות שמודל השתלת לב בצוואר הרחם הוא לא פיסיולוגי, מודל לב טעון שאינה בשל יווני הייחודיות של זרימת דם intracardiac, זה הוא כלי הכרחי בהשתלת לב ניסיונית. הפרטים הטכניים המוצגים בנייר וידאו זה צריכים לאפשר מחקרים להקים מודל זה קל יחסית במעבדות שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5, 733-735 (1973).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28, 565-570 (2008).
- Schramm, R., et al. The subepicardial microcirculation in heterotopically transplanted mouse hearts: an intravital multifluorescence microscopy study. J Thorac Cardiovasc Surg. 134, 210-217 (2007).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp : JoVE. 238, (2007).
- Gong, W., et al. Introduction of modified cervical cardiac transplant model in mice. Exp Clin Transplant. 10, 158-162 (2012).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Chen, H., Zhang, Y., Zheng, D., Praseedom, R. K., Dong, J. Orthotopic kidney transplantation in mice: technique using cuff for renal vein anastomosis. PloS one. 8, e77278 (2013).
- Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141, 682-689 (2007).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2010).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. Am J Pathol. 153, 1301-1310 (1998).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20, 1123-1128 (2001).
- Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth. Comp Med. 51, 443-456 (2001).
