Introduction
O modelo de transplante cardíaco é freqüentemente usada para investigar I / R-lesão, rejeição do enxerto, doença vascular pós-transplante ea eficiência dos agentes imunomoduladores. Mouse modelos combinam muitas vantagens como o imunológica conhecida e origens genéticas, a disponibilidade de muitas estirpes puras e transgénicas experimentais e custos relativamente baixos.
Em 1973, uma técnica de transplante cardíaco abdominal em ratinhos foi descrita pela primeira vez por Corry et al 1. Neste modelo enxertos são revascularizada pelo ponta-a-lado anastomose da aorta ascendente a aorta abdominal do receptor e da principal artéria pulmonar à veia cava inferior. Em 1991, a técnica de sutura para o transplante cardíaco cervical em ratos foi descrita por Chen et al 2. Neste modelo a perfusão coronária retrógrada é estabelecido por anastomose da artéria carótida do destinatário à aorta ascendente do grpopa. Os drenos de sangue venoso, através do seio coronário no átrio direito, ventrículo direito e é ejetado através da artéria pulmonar para o destinatário veia jugular externa (Figura 1). Em comparação com a implantação do enxerto abdominal modelo cervical é menos invasiva ea localização superficial do enxerto permite um acesso muito fácil para exames de acompanhamento adicionais (por exemplo palpação, ecocardiografia, microscopia de fluorescência intravital) 3,4.
Apesar das melhorias técnicas 5,6, uma utilização mais generalizada deste modelo tem sido limitada devido a dificuldades técnicas para realizar anastomoses suturadas de pequenos vasos com alta incidência de vazamento de anastomose e trombose. Em 1991, Matsuura et ai. introduziu o manguito técnica em que a parede do vaso é revirado sobre um cilindro de síntese, o que facilita grandemente o modelo de transplante de coração 7 do colo do útero. A técnica foi further adotado para vários modelos experimentais de transplante renal, incluindo 8, 9 pancreático, membro 10, hepáticos 11,12, 13,14 e transplante de pulmão vascular 15. Em comparação com a técnica de sutura o tempo necessário para a anastomose e, assim, o tempo de isquemia quente é mais curto e existem complicações vasculares significativamente menor, utilizando a técnica do manguito 16. Além disso, ele permite que os cirurgiões com pouco treinamento em microcirurgia para executar a operação com uma elevada taxa de sucesso. Uma desvantagem da técnica de braçadeira é pré-requisito para a ligação da artéria carótida comum, o que pode alterar a perfusão cerebral.
Neste artigo, apresentamos um vídeo técnica manguito melhorado e simplificado para o transplante cardíaco cervical em camundongos.
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Protocol
Todos os experimentos foram aprovados pelo alemão Heart Center Munique eo Governo da Baviera, Alemanha (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). Os animais foram alojados em uma instalação livre de patógenos específicos e recebeu cuidados humanos em conformidade com os "Princípios de Laboratório Animal Care" formuladas pela Sociedade Nacional de Pesquisa Médica e do "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" fornecido pela Academia Nacional de Ciências e publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH publicação 86-23 no., revista, 1985).
NOTA: Um conjunto completo de instrumentos de microcirurgia estéreis, incluindo duas pinças curvas e dilatadores dos vasos, é necessário para o procedimento (Figura 2a). Profilaxia com antibióticos perioperatórios não é rotineiramente necessária, mas pode ser indicada em animais imunocomprometidos. Os animais foram sacrificados usando inalação de isoflurano terminal.
Doador de Preparação e Graft Colheita
<ol>2. Destinatário Preparação
- Prepararos punhos para anastomoses por corte do tubo de poliimida com um bisturi n ° 11 ou uma tesoura ao microscópio. A braçadeira é constituída por um corpo cilíndrico e uma extensão (1/3 da circunferência) para a colocação da pinça vascular, cada uma com um comprimento de 1 mm (Figura 2b).
- Anestesiar o animal e confirmar tolerância cirúrgico, tal como descrito acima. Injectar 0,25 ml de soro fisiológico morno solução por via subcutânea (sc) para a reposição de líquidos.
- Remover os pêlos da região cervical direita usando um barbeador elétrico e colocar o animal em decúbito dorsal sobre uma almofada quente. Prenda os pés com fios de fita, evitando overstretching os membros dianteiros, pois isso pode comprometer a respiração. Cubra os olhos usando pomada oftálmica para prevenir o ressecamento. Desinfetar o local da cirurgia três vezes com clorexidina.
- Faça uma incisão transversa da pele a partir do ângulo da mandíbula direito ao entalhe jugular.
- Sem rodeios mobilizar a extErnal veia jugular. Cauterizar ramos laterais com um fórceps bipolares e transecto-los.
- Dividir a veia jugular externa entre ligaduras no nível de confluência com a veia a partir da glândula submandibular.
- Puxe a veia jugular externa através do manguito e oclusão do vaso proximal, colocando um grampo vascular sobre a extensão do punho. Remova a ligadura e irrigar o lúmen do vaso com 01:10 salina heparinizada.
- Evert parede do vaso através da braçadeira e fixe-o com uma predefinição circunferencial 8-0 seda ligadura.
- Remova a parte superficial do músculo esternocleidomastóideo.
- Mobilizar a artéria carótida comum direita e transecto embarcação entre ligaduras abaixo da bifurcação carotídea.
- Puxe a artéria carótida através do manguito e oclusão do vaso proximal, colocando um grampo Yasargil sobre a extensão do punho. Remova a ligadura e irrigar o lúmen do vaso com 01:10 salina heparinizada.
- Gentilmente dilate do lúmen arterial, com um dilatador navio, everter parede do vaso através da braçadeira e fixe-o com uma predefinição circunferencial 8-0 seda ligadura.
- Para ganhar espaço suficiente para a implantação do enxerto, remover o lobo direito da glândula submandibular.
- Mantenha o campo operatório úmido até a implantação.
3. Enxerto Implantação
- Coloque o enxerto na região cervical do receptor de cabeça para baixo com a aorta orientada medialmente e a artéria pulmonar lateralmente.
- Puxe a aorta do enxerto sobre o manguito com a artéria carótida e garantir a anastomose com uma ligadura circunferencial 8-0 seda.
- Inciso do tronco pulmonar no seu aspecto anterior e puxe-o sobre o manguito com a veia jugular externa. Novamente garantir a anastomose com uma ligadura circunferencial 8-0 seda.
- Remover o grampo na veia jugular externa, seguindo por desclampeamento da artéria carótida. Os corações enche imediatamente com sangue. Para aumentar reperfusion cair 37 ° C soro fisiológico morno para o enxerto. Normalmente, o coração se desenvolve em ritmo sinusal dentro de um minuto. Remover o manguito extensão no local venoso.
- Assegurar a posição correta do enxerto, anastomoses deve ser livre de tensão e vasos sem torção. Não vasos cauterizados da pele uma vez que este pode prejudicar a cicatrização de feridas. Sangramento geralmente pára espontaneamente. Fechar a pele com uma sutura contínua única 8-0.
4. Cuidados Pós-Operatórios
- Injectar 0,25 ml quente sc solução salina para a reposição de líquidos.
- Para antagonizar narcóticos injectar a naloxona (1,2 mg / kg), o flumazenil (0,5 mg / kg) e atipamezol (2,5 mg / kg de peso corporal) SC esquerdo do animal na almofada quente até ter recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Observar o animal durante pelo menos uma hora adicional para registar qualquer comportamento anormal. Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente Recovevermelho.
- Fornecer analgesia preemptiva com buprenorfina (0,05 mg / kg sc três vezes por dia) ou uma analgesia alternativa de acordo com um protocolo institucional local por um período mínimo de 72 horas após o procedimento.
- O cirurgião e um veterinário deve ver os animais regularmente. Em caso de perda de peso> 15%, a apatia, inchaço ou infecção lado cirúrgicos animais são sacrificados usando inalação de isoflurano terminal.
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Representative Results
Nossa equipe pode executar com êxito a técnica descrita após cerca de 20 cirurgias de formação. A parte mais desafiadora é a everter parede do vaso da artéria carótida sobre o punho, porque facilmente vira para trás e múltiplas tentativas podem levar a rasgar do muro. Após o período de treinamento, o tempo cirúrgico médio total foi de 60 ± 8 min. Cerca de 20 min são necessários para a colheita doador, 25 min para a preparação dos vasos cervicais e 15 minutos para anastomoses e fechamento da pele.
Para a investigação de I / R-lesão miocárdica realizamos mais de 200 operações em sing�ico camundongos C57BL / 6 em várias configurações experimentais com uma taxa de sucesso cirúrgico de 92%. Morte precoce foi causado por dificuldades na realização das anastomoses (n = 3), deiscência de anastomose (n = 2) e insuficiência cardiopulmonar (n = 10). Um animal foi sacrificado após recuperação devido ao comprometimento neurológico. Entre os sobreviventes perioperatória, a sobrevivência do enxerto foi de> 95% em7 dias (Figura 4). Um número de receptores de enxertos sing�icos foram mantidos vivos por mais de 3 meses. Apesar de não usar a profilaxia antibiótica, não observamos quaisquer complicações infecciosas.
Numa primeira série, 12 singeneicos C57BL / 6 murganhos foram transplantadas para exames histopatológicos (Figura 3). Os enxertos foram expostos a 4 h de isquemia fria por armazenamento em gelo a 4 ° C antes da implantação. Os transplantes foram colhidos após 7 dias de reperfusão e coradas em hematoxilina e eosina (H & E) e vermelho Sirius. Nontransplanted animais (n = 6) serviram como controlos. A I / R conduz a uma forte reacção inflamatória do tecido com edema, hiperemia, os leucócitos infiltrantes, a oclusão microvascular e uma fibrose intersticial. Nesta série cedo um animal morreu após uma injecção repetida de cetamina / xilazina. Esta complicação pode ser ainda evitado pelo uso de uma anestesia totalmente antagonizable incluindo midazolam, medetomodine e fentanil. < / p>
Figura 1: (a) representação esquemática do fluxo sanguíneo em Heterotopic Cervical Transplante de Coração. O sangue, através do fluxo da artéria carótida do destinatário retrógrada da aorta ascendente e para dentro das artérias coronárias para perfundir o enxerto cardíaco. Os drenos de sangue venoso para o átrio direito através do seio coronariano, enche o ventrículo direito e é ejetado através da artéria pulmonar na veia jugular externa do destinatário. O ventrículo esquerdo é completamente ignorado. (B) intra-operatória Vista de anastomoses. A aorta ascendente (2) é puxada através da braçadeira com a artéria carótida (1) e o tronco pulmonar (3) sobre a manga com a veia jugular externa (4). Na foto a anastomose venosa ainda não tinha sido concluída.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: (a) Um conjunto completo de instrumentos de microcirurgia estéreis, incluindo duas pinças curvas e dois dilatadores dos vasos é necessária. (B) Para anastomoses punhos de 19-24 G com uma extensão e microvasculares grampos são usados.
Figura 3: histológica exemplos demonstrando miocárdio I / R-lesão em sing�icos camundongos C57BL / 6 H & coloração E (magnificação 20X) de corações de animais controle (A) e de animais após 4 h de isquemia fria e 7 dias de reperfusão (b).. Prolongada I / R, resultou numa reacção inflamatória forte com o tecido Edema, hiperemia, infiltrando leucócitos e oclusão microvascular. Na mesma configuração experimental Sirius coloração vermelha (aumento de 40 vezes) mostraram grandes deposição de colágeno intersticial após I / R (d) em relação ao grupo controle (c).
Figura 4:. Cardiac Allograft Survival de Kaplan-Meier que são visualizadas a sobrevivência do enxerto em singeneicos C57BL / 6. Animais utilidades domésticas sacrificados no 7º PO para exame histopatológico.
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Discussion
Nós completamos mais de 200 transplantes cardíacos com uma taxa de sucesso superior a 90% em várias configurações experimentais. Com a técnica descrita aqui, o procedimento completo pode ser feito no prazo de 60 min por um cirurgião experiente. Ao preparar os vasos cervicais antes de colheita de órgãos, o tempo total de isquemia do enxerto pode ser limitada a 20 min. Tempo para o implante (tempo de isquemia quente) é significativamente mais curta utilizando a técnica de braçadeira em comparação com a técnica de sutura 16.
Em vez de simplesmente excisão do coração, como descrito anteriormente 5,17, nós induzimos parada cardíaca por perfusão do enxerto com uma solução cardioplégica utilizada clinicamente e por hipotermia. A solução HTK Custodiol® cristalóide contém baixas concentrações de sódio, de cálcio e de magnésio 10 mmol / L e de potássio, e efectivamente prende o coração. Os aditivos de histidina, triptofano e a-cetoglutarato reduzir acidose, fornecer ATP e proteger as membranas celulares duisquemia anel. Isto assemelha-se a condição clínica de uma parada cardíaca controlada durante a cirurgia de coração aberto e torna este modelo ideal para a investigação de I / R-lesão miocárdica. Além disso, permite a aplicação de agentes farmacológicos dentro da solução cardioplégica, no início de isquemia fria. Armazenamento de enxertos a 0-4 ° C é possível que um intervalo de tempo máximo de 4 horas. Um tempo de isquemia prolongado pode levar a hipocontratilidade do miocárdio complicado por overextension das câmaras cardíacas direitas e sangramento.
Em nossa experiência, alguns críticos pontos-chave facilitará a revascularização bem sucedida. Por mobilização completa da artéria carótida e a utilização de um baixo perfil Yasargil comprimento máximo braçadeira vassel para a anastomose pode ser preservada. Vasoespasmo pode ser evitada por queda 01:10 papaverina diluída para a artéria. Para evitar comprometimento neurológico da artéria carótida é ligada abaixo da bifurcação para preservar a circulação colateral para t ele artéria carótida interna. O lúmen do vaso dilatado é cuidadosamente com um dilatador navio com um superfino (0,2 mm) ponta, evitando rompimento da parede. Na nossa experiência, a colocação das suturas que prendem como descrito anteriormente 7 não é obrigatória. A seleção do tamanho do manguito é crucial para a revascularização bem sucedida. O diâmetro interior do manguito para anastomose arterial deve ser um pouco maior do que o diâmetro externo da artéria carótida comum (250-300 um) para dar conta da incompatibilidade com o maior aorta ascendente do enxerto. Para ratinhos pesando 20-25 g de uso punhos de 22 a 24 g (diâmetro interno cuff de 0,510 para 0,643 milímetros) para a artéria carótida e punhos de 19 a 21 G (diâmetro interno cuff de 0,724 para 0,912 milímetros) para a veia jugular externa . Nós preferimos material de sutura polyfilament (seda), pois isso facilita a amarração. O grampo microvascular é colocada sobre a extensão do punho. Isto imobiliza o recipiente e facilita a eversão da parede.
ove_content "> A hipotermia devem ser evitados, uma vez que prolonga a recuperação e é uma das principais causas de mortalidade peri-operatória. neuroleptanalgesia Antagonizable usando midazolam, medetomodine e fentanil proporciona boa tolerância cirúrgico e prende recuperação na comparação com cetamina / xilazina 18.Embora o modelo de transplante de coração do colo do útero é um não-fisiológico, o modelo não-carregado coração devido à direcionalidade única de fluxo sanguíneo intracardíaca, é uma ferramenta indispensável no transplante cardíaco experimental. Os dados técnicos apresentados neste trabalho de vídeo deve permitir pesquisas para estabelecer este modelo relativamente fácil em seus laboratórios.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
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