Introduction
Трансплантация сердца модель часто используется для исследования I / R-травмы, отторжения трансплантата, после трансплантации васкулопатии и эффективность иммуномодулирующих агентов. Мышиные модели сочетают много преимуществ, как известный иммунологических и генетических фонов, наличие многих инбредных и трансгенных линий и относительно низких затрат экспериментальных.
В 1973 году методика брюшной трансплантации сердца у мышей была впервые описана Corry и др 1. В этой модели трансплантаты реваскуляризированных по конец в бок анастомоза восходящей аорты в брюшной аорты получателя и главного легочной артерии в нижнюю полую вену. В 1991 году методика шов шейки трансплантации сердца у мышей была описана Чен и др 2. В этой модели ретроградной перфузии коронарных артерий устанавливается анастомоза сонную артерию получателя, чтобы восходящей аорты ГРКормовая. В венозных стоков крови через коронарный синус в правое предсердие, правый желудочек и выбрасывается через легочную артерию в получателя внешнего яремной вены (рис 1). По сравнению с брюшной трансплантата имплантации шейки модель является менее инвазивным и поверхностное расположение трансплантата позволяет очень легкий доступ для дополнительных последующих испытаний (например, пальпации, эхокардиография, прижизненный флуоресцентной микроскопии) 3,4.
Несмотря на технические усовершенствования 5,6, более широкое использование этой модели было ограничено из-за технических трудностей, чтобы выполнить пришитых анастомозов мелких сосудов с высокой частотой утечки анастомоза и тромбоза. В 1991 году Мацуура и др. представил методику манжеты, в котором стенка сосуда выворачивают через синтетического цилиндра, что значительно облегчает модель трансплантации сердца шейки 7. Техника была фуrther принят на различных экспериментальных моделях трансплантации почек в том числе 8, поджелудочной железы, 9 конечности 10, печеночная 11,12, легких и сосудистой 13,14 трансплантации 15. По сравнению с методом шовного требуемое время анастомозов и, таким образом, время тепловой ишемии короче и есть значительно меньше, сосудистых осложнений с использованием метода манжеты 16. Кроме того, она позволяет хирургам с небольшим обучения в микрохирургии, чтобы выполнить операцию с высокой скоростью успеха. Недостатком метода манжеты является необходимым условием лигирование общей сонной артерии, которые нарушают перфузию головного мозга.
В этом видео статье мы представляем улучшенный и упрощенный метод манжеты для шейного трансплантации сердца у мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты были одобрены немецким сердечного центра Мюнхена и правительства Баварии, Германия (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). Животные были размещены в определенном свободного объекта патогена и получил человеческая забота в соответствии с «Принципами лабораторных животных", сформулированных "Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных", предоставленной Национальной академии Национального общества медицинских исследований и наук и опубликован Национальными Институтами Здоровья (NIH Publication нет. 86-23, пересмотренная в 1985 году).
ПРИМЕЧАНИЕ: Полный набор стерильных инструментов микрохирургических, в том числе двух изогнутых щипцов и dilatators сосудов, необходим для процедуры (рис 2а). Послеоперационные антибиотикопрофилактика не регулярно необходимым, но может быть указано в ослабленным иммунитетом животных. Животные были принесены в жертву с помощью терминала ИФ ингаляции.
Донор Подготовка и трансплантат урожая
<ол>2. Получатель Подготовка
- Подготовитьманжеты для анастомоза путем разрезания трубы полиимида с № 11 скальпелем или ножницами под микроскопом. Манжета состоит из цилиндрического корпуса и расширением (1/3 окружности) для размещения сосудистый зажим, каждый из длиной 1 мм (рис 2b).
- Обезболить животное и подтвердить хирургического толерантность, как описано выше. Вводите 0,25 мл теплой солевой раствор подкожно (SC) для замены жидкости.
- Удалить волосы с правой шейной области, используя электрическую бритву и поместите животное в лежачем положении на теплый площадку. Закрепите ножки нитей ленты, избегая чрезмерного передние конечности, так как это может поставить под угрозу дыхание. Обложка глаза, используя глазной мази, чтобы предотвратить сухость. Лечить хирургический участок три раза хлоргексидина.
- Сделайте поперечный разрез кожи с правого угла нижней челюсти к яремной выемкой.
- Тупо мобилизовать добernal яремной вены. Прижигание боковые ветви с биполярным пинцетом и секут их.
- Разделите внешнюю яремную вену между лигатур на уровне слияния с вены из подчелюстной железы.
- Вытяните внешнюю яремную вену через манжеты и закупоривать сосуд проксимальнее путем размещения сосудов зажим на расширение манжеты. Удалить лигатуры и орошения просвет сосуда с 1:10 гепаринизированным физиологического раствора.
- Эверт стенки сосуда на манжете и закрепить его с заданной окружности 8-0 шелковой лигатуры.
- Удаление поверхностного часть кивательной мышцы.
- Мобилизация правой общей сонной артерии и секут судно между лигатурами ниже бифуркации сонной артерии.
- Потяните сонную артерию через манжеты и закупоривать сосуд проксимальнее путем размещения зажим Yasargil о продлении манжеты. Удалить лигатуры и орошения просвет сосуда с 1:10 гепаринизированным физиологического раствора.
- Аккуратно dilatе просвета артерии с расширяющая мышца сосудов, выворачивания стенки сосуда над манжеты и закрепить его с заданной окружности 8-0 шелковой лигатуры.
- Чтобы получить достаточно места для трансплантата имплантации, удалить правую долю подчелюстной железы.
- Держите операционное поле влажная до имплантации.
3. Прививка Имплантация
- Поместите трансплантата у реципиента шейного отдела вниз с аорты ориентированной медиально и легочной артерии с боков.
- Извлеките аорту трансплантата через манжету с сонной артерии и обеспечить анастомоза с круговой 8-0 шелковой лигатурой.
- Надрезать легочный ствол на его передней аспекте и потяните ее на манжете с наружной яремной вены. Опять закрепить анастомоза с круговой 8-0 шелковой лигатуры.
- Снимите зажим на наружной яремной вены, следуя за unclamping сонной артерии. Сердца сразу наполняется кровью. Для повышения гeperfusion на 37 ° C теплый солевой раствор на трансплантата. Обычно сердце развивается синусовый ритм в течение одной минуты. Удалить расширение манжеты на венозной сайте.
- Обеспечьте правильное положение трансплантата, анастомозы должны быть без натяжения и сосуды без кручения. Не прижигали сосуды кожи, так как это может ухудшить заживление ран. Кровотечение обычно останавливается спонтанно. Закройте кожу с помощью одного 8-0 непрерывным швом.
4. Послеоперационный
- Вводите 0,25 мл теплой солевой раствор подкожно для замены жидкости.
- Для антагонизм наркотики вводят налоксон (1,2 мг / кг), флумазенил (0,5 мг / кг) и atipamezol (2,5 мг / кг массы тела) подкожно покинул животное на теплой подушки, пока он не пришел в сознание достаточно, чтобы поддерживать грудины лежачее положение. Соблюдайте животное, по крайней мере, одного дополнительного часа зарегистрироваться ненормального поведения. Не возвращать животное, не претерпела операцию на компании других животных, пока полностью Recoveкрасный.
- Обеспечить преимущественное обезболивания с бупренорфином (0,05 мг / кг подкожно три раза в день) или альтернативный обезболивание в соответствии с местной институциональной протокола в течение минимального срока 72 ч после процедуры.
- Хирург и ветеринар должен увидеть животных регулярно. В случае потери веса> 15%, апатия, отек или хирургических инфекций сторона животных усыпляют с помощью терминала ИФ ингаляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наша команда может успешно выступить описанной методики примерно через 20 учебных кабинетов. Наиболее сложным является выворачивания стенки сосуда сонной артерии по сравнению с манжетой, потому что он легко переворачивается назад и многочисленные попытки могут привести к разрыву стенки. После периода подготовки, средняя общая продолжительность операции составила 60 ± 8 мин. Около 20 мин требуется для сбора урожая доноров, 25 мин для подготовки шейки матки и сосудов 15 минут анастомозов и закрытия кожи.
Для исследования миокарда I / R-травмы мы провели более 200 операций в сингенных мышей C57BL / 6 в различных экспериментальных условиях с хирургическим вероятностью успеха 92%. Ранняя смерть была вызвана трудностями в выполнении анастомозов (п = 3), анастомоза утечки (п = 2) и сердечно-легочной недостаточности (п = 10). Одно животное было умерщвлено после восстановления связи с неврологическими нарушениями. Среди послеоперационных выживших, выживаемость трансплантата была> 95% при7 дней (Рисунок 4). Ряд сингенным привитых получателей были живы в течение более 3 месяцев. Несмотря на не используя антибиотикопрофилактику, мы не наблюдали каких-либо инфекционных осложнений.
В первой серии, 12 сингенные C57BL / 6 мышей были пересажены для гистологических исследований (рисунок 3). Трансплантатов подвергались 4 ч холодной ишемии путем хранения на льду при 4 ° С перед имплантацией. Трансплантация собирали через 7 дней реперфузии и окрашивали в гематоксилином и эозином (H & E) и Sirius красного. Nontransplanted животных (п = 6) в качестве контроля. / Р приводит к сильной воспалительной реакции с тканевой отек, гиперемия, проникающих лейкоцитов, микрососудов окклюзии и интерстициального фиброза. В этой ранней серии одно животное погибло после повторного введения кетамина / ксилазина. Это осложнение может быть дополнительно избежать, используя полностью antagonizable анестезии в том числе мидазолама, medetomodine и фентанила. < / P>
Рисунок 1: (а) Схематическое изображение кровотока в Гетеротопическая шейки трансплантации сердца. Кровь из потоков получателя сонной артерии ретроградным в восходящей аорте и в коронарных артериях заливать сердечный трансплантат. Венозная кровь стекает в правом предсердии через коронарный синус, заполняет правый желудочек и выбрасывается через легочную артерию в наружную яремную вену реципиента. Левый желудочек полностью обойти. (Б) Интраоперационная Посмотреть анастомозов. Восходящей аорты (2) натягивается на манжете с сонной артерии (1) и легочного ствола (3) над манжетой с внешней яремной вены (4). В картине еще не завершена венозная анастомоза.JPG "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: (а) полный набор стерильных инструментов, включая микрохирургические две изогнутые щипцы и две dilatators сосудов требуется. (Б) Для анастомозов манжетами из 19-24 G с расширением и микрососудистых зажимов используются.
Фигура 3: Гистологический Образцы Демонстрация инфаркт I / R-травмы у сингенных мышей C57BL / 6 Н & Е окрашивание (20X увеличении) сердец контрольных животных (А) и от животных после 4 ч холодовой ишемии и 7 дней реперфузии (б).. Продолжительные / Р привело к сильной воспалительной реакции с тканевой издEMA, гиперемия, проникают лейкоциты и микрососудов окклюзии. В то же экспериментальных условиях Сириус красный для окрашивания (40-кратном увеличении) показали заметное интерстициальный отложение коллагена после того, как / R (г) по сравнению с контрольной группой (с).
Рисунок 4:. Сердечный аллотрансплантата выживания Каплана-Мейера участок отображения жизнеспособности трансплантатов у сингенных мышей C57BL / 6. Животные посуды эвтаназии на 7 сутки после операции для гистопатологического исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы выполнили более 200 пересадок сердца с вероятностью успеха более 90% в различных экспериментальных условиях. С помощью техники, описанной здесь, полная процедура может быть сделано в течение 60 мин с помощью опытного хирурга. По получении шейки сосудов, прежде закупок органов, общее время ишемии трансплантата может быть ограничена до 20 мин. Время для имплантации (время тепловой ишемии) значительно короче с использованием метода манжеты в сравнении со способом шва 16.
Вместо того чтобы просто вырезая сердце, как описано ранее 5,17, мы побудить остановку сердца путем перфузии трансплантата с клинически используемой кардиоплегического решения и переохлаждения. Кристаллоидов решение Кустодиол НТК содержит 10 ммоль / л калий и низкие концентрации натрия, кальция и магния, и эффективно задерживает сердце. Добавки гистидин, триптофан и кетоглутарата уменьшить ацидоз, обеспечивают АТФ и защищать клеточные мембраны дюкольцо ишемии. Это напоминает клиническое состояние контролируемой остановки сердца во время операции на открытом сердце и делает эту модель идеальной для расследования инфаркта I / R-травмы. Кроме того, это позволяет применять фармакологических агентов внутри кардиоплегическом растворе, в начале холодовой ишемии. Хранение при 0-4 трансплантатов ° C возможно для максимального интервала времени 4 ч. Длительное время ишемия может привести к инфаркту hypocontractility осложненной перенапряжением правых камер сердца и кровотечения.
По нашему опыту, несколько критических ключевые точки будут способствовать успешному реваскуляризации. По полной мобилизации сонной артерии и использование низкопрофильной Yasargil зажим максимальной длины Vassel для анастомоза могут быть сохранены. Вазоспазм можно избежать падения 1:10 разбавленный папаверин на артерии. Чтобы избежать неврологические нарушения сонная артерия лигируют ниже бифуркации сохранить коллатеральное кровообращение Т он внутренняя сонная артерия. Просвета сосуда тщательно расширены с расширяющая мышца сосуд с тончайшей (0,2 мм) наконечником, избегая образования трещин на стене. По нашему опыту размещение холдинговых швов, как описано ранее 7 не является обязательным. Выбор размера манжеты решающее значение для успешной реваскуляризации. Внутренний диаметр манжеты для артериальной анастомоз должен быть несколько больше, чем внешний диаметр общей сонной артерии (250-300 мкм) с учетом рассогласования с большей восходящей аорты трансплантата. Для мышей весом 20-25 г использование манжеты от 22 до 24 г (внутри манжеты диаметром от 0.510 до 0.643 мм) для сонной артерии и манжеты с 19 по 21 G (внутри манжеты диаметром от 0,724 до 0,912 мм) для внешнего яремной вены , Мы предпочитаем polyfilament шовный материал (шелк), так как это облегчает завязывая. Микроваскулярного зажим находится на расширение манжеты. Это удерживает судно и облегчает выворачивание стенки.
ove_content "> гипотермии необходимо тщательно избегать, так как это продлевает восстановление и является основной причиной, госпитальная летальность. Antagonizable neuroleptanalgesia использованием мидазолама, фентанил и medetomodine обеспечивает хорошую хирургическую терпимости и крепится восстановление по сравнению с кетамином / ксилазина 18.Несмотря на то, шейки модель трансплантации сердца не является физиологичным, не загружается модель сердца из-за уникальной направленности внутрисердечной кровотока, это незаменимый инструмент в экспериментальной трансплантации сердца. Технические детали показаны в этом видео статье должны позволить исследования, чтобы установить эту модель относительно легко в своих лабораториях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5, 733-735 (1973).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28, 565-570 (2008).
- Schramm, R., et al. The subepicardial microcirculation in heterotopically transplanted mouse hearts: an intravital multifluorescence microscopy study. J Thorac Cardiovasc Surg. 134, 210-217 (2007).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp : JoVE. 238, (2007).
- Gong, W., et al. Introduction of modified cervical cardiac transplant model in mice. Exp Clin Transplant. 10, 158-162 (2012).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Chen, H., Zhang, Y., Zheng, D., Praseedom, R. K., Dong, J. Orthotopic kidney transplantation in mice: technique using cuff for renal vein anastomosis. PloS one. 8, e77278 (2013).
- Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141, 682-689 (2007).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2010).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. Am J Pathol. 153, 1301-1310 (1998).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20, 1123-1128 (2001).
- Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth. Comp Med. 51, 443-456 (2001).
