Summary
深刻な臓器不足は移植のための限界腎臓移植片の使用の増加をもたらしました。限界移植片は特に不十分冷蔵を許容するので、これは、代替ストレージ·メソッドへの関心を引き起こしました。正常体温ex vivoで腎臓灌流（NEVKP）の技術は、移植前に腎臓移植のための新規の保存方法を表します。
Introduction
腎臓は、最も頻繁に移植固体器官です。透析1-4と比較した場合、末期腎疾患に罹患している患者では、腎移植は、より良い平均寿命、および生活の質の向上を提供しています。持続臓器不足は、移植医療（表1）5の分野で深刻な問題です。
| 米国* | Eurotransplant地域** | |
| 腎臓移植待機リストに患者 | 101563（2月、2015） | 10689（12月、2014年） |
| 2014年に移植され死亡したドナーの腎臓 | 10650 | 3119 |
| 中央値（年間で）死亡したドナーの腎臓移植に時間を待っています | * 5年まで | ** 4年まで |
表1腎臓米国とEurotransplant地域のグラフト不足。
腎臓移植の結果が負、長期透析6に付した患者のためのより悪い結果と、待機時間に影響されます。これは、古いドナーからの腎臓、複数の併存疾患（拡張基準ドナー（ECD）、および心臓死（DCD）の後に寄贈した腎臓とドナーとして、追加のドナー源として限界腎臓移植に関心を引き起こしました。であったであろうマージナルドナー腎臓を過去に減少しましたが、今、移植7のために考慮されています。
限界腎臓移植片の使用のための主要な障害は、低温無酸素ストレージの保存技術です。現在、腎臓移植片は、氷上で静的に格納されているか、酸素なしに4℃で灌流します。冷たい無酸素保存技術は、腎臓の保存時に進行中のグラフト損傷に関連して、ためmetabの不足のグラフト評価を許可していませんolismと尿産生。具体的には、限界腎臓移植片は、有意な腎障害、および臓器移植後臓器機能障害（DGF）8,9の高率で、その結果、不十分な低温貯蔵に耐えます。 DGFは貧しい長期移植片機能の予後因子です。
体外腎潅流は臓器の保存、評価、修復のための別の方法を表しています。ブタモデルでは、有益な結果は、正常体温の状態10,11の下でex vivoでの灌流腎臓のために提示されました。拡張基準ドナーから取り出した腎臓を移植12の直前に1時間灌流したときに2013年に実行される最初の臨床試験は、遅延移植片機能の低い率を示しました。
本稿では、正常体温ex vivoで腎臓灌流（NEVKP）のモデルを提示します。本研究の目的は、最小限に適用冷虚血時間を短縮し、NEVKPの期間を延長することです。 NEVKP冷蔵技術によって引き起こされ得る損傷を低減することを目的とする代替的保存方法です。
Protocol
注：試験プロトコールの概略を図1に示されています。
図1.試験プロトコル。正常体温ex vivoで腎臓灌流のこの研究プロトコルは、ブタのモデルに基づいています。外科的移植腎の血管の切開およびヒスチジン - トリプトファン - ケトグルタル酸（HTK）500mlで洗浄した後、移植片を取り出すことができます。 3時間冷蔵（SCS）の後、腎臓移植片は、指定された移植まで数時間のためにex vivoで （NEVKP）正常体温灌流します。
すべての動物は医学研究と「国立衛生研究所によって公開 ''実験動物の管理のためのガイド」、ナショナル協会によって定式化 '' '実験動物管理の原則」に準拠して人道的なケアを受けオンタリオ、カナダ。トロント一般研究所の動物管理委員会は、すべての研究を承認しました。
1.動物
- このプロトコルで - （33キロ27）男性のヨークシャー豚を使用してください。
2.オルガン検索
- 術前の手順
- 家は少なくとも1週間のための研究施設での男性のヨークシャーブタは彼らのストレスレベルを減少させることができます。麻酔導入前に6時間の最小値のための豚を高速です。
- ケタミン（25 mgの/ kg）を、アトロピン（0.04ミリグラム/ kg）を、およびミダゾラム（0.15ミリグラム/ kg）を筋肉内注射により豚の麻酔を開始します。その後、手術室（OR）に住宅設備から動物を輸送します。
- ORテーブルに仰臥位で豚を配置します。それが自然にイソフルランの5％と酸素の2 Lを呼吸させます。緩和後、喉頭鏡で声帯を露出させ、挿管によって引き起こされる痙攣を防止するために、2％リドカインでそれらをスプレー。 AF空気を5ml - 6.5ミリメートル管を有するター挿管は、3とカフをブロックします。
注：カプノメトリは気管チューブの正確な位置を明らかにしています。 - 2.5％のイソフルランガスを下げます。 16呼吸/分、10回換気量 - - 15ミリリットル/ kg体重14に人工呼吸器を設定します。密接に豚を監視します。心拍数および酸素飽和度は、パルスオキシメトリによって記録されます。
- 無菌条件下で、8.5神父を紹介セルジンガー法13内頸静脈に×10センチカテーテル。したがって、静脈血管を穿刺するために針を使用しています。ワイヤーを導入した後、カテーテルを用いて針を交換してください。ワイヤーを除去し、皮膚にカテーテルを固定します。手術全体の時間当たり乳酸リンゲル溶液200mlを管理します。
- 外科手術
- 手術野の消毒や報道の後、恥骨結合に剣状突起から正中切開を行います。露出を改善するために、と外科的アプローチを拡張左横切開。タオルで大小の腸を覆い、右の腎臓への最適なアクセスのために左側にそれらを配置します。
- 腹部大動脈から下大静脈（IVC）を分離。大動脈の背面から大動脈の枝を結紮。
- バックへの完全な大動脈解離の後、腎枝に頭蓋大動脈の周りに結紮糸を渡します。さらに、腸骨分岐の頭蓋2合字を配置します。左腎動脈の周りにネクタイを配置します。
- その付着組織から右腎を解放します。腎静脈、動脈、および尿管を解剖。
- 絞りを開いて、心臓にキロドナー重量1,000 IUのヘパリンを投与します。 DCDモデルでは、心停止を誘導するために全身ヘパリン化した後、心臓内3分のKCl 40 mvalを注入。心停止は暖かい虚血の出発点として評価されています。
- 一方、血液の採取のために、CPDAバッグのラインを接続（クエン酸、リン酸、ブドウ糖、Adenosine）左上頸静脈に導入カテーテルに。ソフトスピン（ブレーキなし1,500 XG）を実行します。無菌状態（安全キャビネットクラスII）下でプラズマと軟膜を削除し、輸血用赤血球を保存します。
- 腸骨分岐上記臓器フラッシュラインを大動脈にカニューレを挿入。大動脈と左腎動脈での合字を接続します。
- 100センチメートルのH 2 Oの圧力でヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸（HTK）溶液を用いて腎臓をフラッシュ胸部の静脈をクランプし、頸静脈カテーテルを介して血液を採取。腎臓の最適なフラッシュを確保するために腎静脈下の腹部の静脈をカットします。
- 右腎を完全にフラッシュした後、大動脈のセグメントに移植片を取り出します。腎静脈をカットし、長い尿管を残します。
- 灌流のための腎臓移植片のバック表の準備
- 付着組織から腎臓を解放します。タイAと大動脈の頭蓋部分を閉じますND 1/4 "×3/8"減速と下部にカニューレを挿入。大動脈からのより小さな動脈枝を縛ります。
- 直接1/4 "×3/8"減速と腎静脈にカニューレを挿入。 8神父と尿管を挿管チューブを供給します。
- NEVKP開始まで氷上に腎臓を配置します。
3.正常体温エクスビボ腎臓灌流（NEVKP）
- 灌流回路の作製
灌流回路は、新生児心肺バイパス装置（ 図2）で構成されています。
灌流回路の図2の模式図は、回路は、新生児心肺バイパス技術で構成されています。灌流溶液は、静脈リザーバ内に回収されます。遠心ポンプは、酸素富化し、37℃に加温する人工肺内へ溶液を推進します。 PAの後腎臓に腎動脈を通って、80 mmHgの - 動脈バブルフィルターをssing、灌流液は、60の圧力で駆動されます。静脈流出（0から3 mmHgの）は、静脈リザーバーに戻って灌流液をリードしています。注射器および注入ポンプは、追加の化合物との供給を確保します。尿を灌流を通じて収集されます。灌流回路特性を連続的に記録されています。毎時静脈および動脈血ガス試料、及び腎臓損傷マーカーが分析されます。- 腎臓灌流装置にカスタムメイド灌流回路を接続します。
- 静脈リザーバと人工肺にチューブを接続します。人工肺の動脈流出に動脈ラインのチューブを接続し、そのホルダにバブルフィルタを配置します。パージラインを接続します。静脈リザーバの入口に静脈ラインのチューブを接続します。
- 灌流時の評価のために、動脈コンセントに温度プローブを接続し、流量計とBUを接続bble動脈ラインチューブにセンサー、圧力ラインを接続します。レベルセンサを接続します。
- 静脈および動脈サンプルポートへの静脈と動脈サンプルラインを接続します。
- スタンドに臓器室を置き、下穴を通って静脈および動脈チューブをご紹介します。しっかりとテーブルとチャンバーにチューブを固定します。
- ローラーポンプに吸引チューブを挿入し、流体を収集するために、チャンバー内に一端を配置します。
- 95％O 2/5％CO 2および人工肺を含むガスタンクに酸素チューブを接続します。人工肺と臓器チャンバーに加熱ユニットチューブを接続します。
- 静脈および動脈流出ラインを閉じるには、チューブのクランプを使用してください。静脈リザーバーの流出に別のチューブクランプを適用します。
- 灌流液の調製、追加料金、および回路をプライミング
- で製造尿を交換するために、1つの輸液ポンプを使用して乳酸リンゲル。
- 静脈リザーバーに栄養（グルコース0.5ミリリットル/時、アミノ酸0.5ミリリットル/時）とインスリン（5 IU /時）を管理するために、1つのシリンジポンプを使用してください。直接動脈ラインに血管拡張剤（ベラパミル、0.25ミリグラム/時間）を注入する第2のシリンジポンプを使用しています。
- 灌流液と静脈リザーバーを埋めます。したがって、リンゲル乳酸（175ミリリットル）、静脈リザーバにスティーン溶液（200ml）で、DRO（26 ml）を、ヘパリン（千IU）、pHを調整するための重炭酸ナトリウム、およびグルコン酸カルシウムを注ぎます。最後に、洗浄した赤血球（125ミリリットル）を追加します。
- 人工心肺（HLM）に切り替えます。圧力、温度、レベル、および気泡センサパネルをアクティブにします。潅流全体のデータを記録するデータ管理システム（DMS）をアクティブにします。 37℃に灌流液および臓器チャンバーを暖めるために加熱ユニットをアクティブにします。 O 2供給を開きます。
- 静脈リザーバの背後にチューブクランプを開き、centrifugを解放完全に空気からアルポンプヘッド。 1000rpmで遠心ポンプを起動し、溶液が回路全体に推進することができます。動脈フィルタをバイパスチューブをクランプし、動脈フィルタから空気を放出します。
- 圧力ラインをゼロ。注射器および注入ポンプを起動します。
- 腎臓移植灌流
- 氷から腎臓を取り出し、臓器チャンバーに寝具に腎臓を配置。採尿器に尿カテーテルを配置します。静脈および動脈管は空気の自由であることを確認した後、チューブにコネクタを差し込みます。
- 動脈および静脈チューブライン間のショートカットを閉じます。遠心ポンプの速度を調節することにより、75 mmHgでの動脈圧を設定します。
- レコード圧力、動脈の流量、温度、およびDMSと連続気泡の存在。灌流を通して慎重に値を確認します。灌流の間に、チャンバー内に漏れた血液はコレですバック静脈リザーバに吸引チューブを介して、CTED。
- 生成された尿の量を記録します。毎時静脈血および尿サンプルを収集します。静脈および動脈血液ガスサンプルおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、および乳酸分析を取ることによって灌流を監視します。
- 灌流の終了時に、冷たいHTKで移植片を洗い流す、腎動脈と静脈からチューブを外し、移植まで滅菌臓器袋に氷の上に保管します。
Representative Results
心臓鼓動腎臓検索のモデルを使用して、6つの実験の結果を以下に示します。赤血球を調製しながら、 その場でのフラッシュおよび腎臓検索における後、移植片は3時間（SCS）のために氷上で保存しました。臨床設定では、これは、検索およびバックテーブル作成に要する時間をシミュレートします。 NEVKPを10時間行いました。
生理的条件を維持し、in vivoで腎臓のために周囲をシミュレートするために、臓器チャンバーを加熱し、密封する必要があります。灌流および尿置換液は、血液ガス分析、膠質浸透圧、および浸透圧のための生理的な値を表している必要があります。 その場でヨークシャーブタから得られた正常値（基準値）は、（ - 13図3）は、それぞれ、各図の説明に位置しています。 NEVKPの目的は、移植片が十分な酸素や栄養が供給されていることを確認することです。虚血CAとしてこのように安定した圧力に十分な酸素化のための良好な指標であるとの一定の流れを実現する、腎臓内の抵抗を増加させる、血管収縮を使用しています。 37°Cの目標グラフト温度はSCS後の臓器の復温を介して到達された後、フロー値及び腎内抵抗が全体を通して灌流周り60~80 mmHgでの一定の生理学的な圧力で安定したままである（ 図3および図4）。尿産生量は灌流液（ 図5）の組成に主に依存します。
静脈および動脈PO 2の毎時測定値は、腎臓の代謝活性を明らかにしました。 （ 図6）14 -酸素消費量は、式（PO 2 VEN）×流量/重量（PO 2技術）を用いて計算しました。灌流液pH中、HCO 3、および電解質は介入（ - 10図7）を必要とすることなく安定しています。リアルタイムASTおよび乳酸の測定は、細胞の損傷を監視するのに役立ちます。細胞傷害のパラメータの増加はNEVKP期間（ 図11及び12）の間に検出されません。灌流液の浸透圧が安定します（ 図13）です。組織学的評価は、軽微な変更（ - 16図14）を明らかにしています。
標準偏差（ml /分）図3.平均動脈流は。灌流を通して流れが生理的範囲内に残ります。 その場で測定されたブタの生理的な値は、：芸術を意味します。フロー：170±57ミリリットル/分（範囲83〜325ミリリットル/分）。
図4.腎内抵抗（IRR）、平均値と標準偏差（mmHgで/ ミリリットル/分）、平均動脈圧（MAP）は、60と80 mmHgの間で一定のままです。腎内の抵抗は、常に/ ml /分0.5 mmHgの下にあります。
図5の総尿量は、平均値と標準偏差（ml）の総尿量は、主に、灌流液の組成に依存します。尿産生が低いほど、浸透圧および浸透圧が高いです。
図6.酸素消費、平均と標準偏差（ml /分/ g）を得ました。
図7のpH静脈、平均値及び標準偏差のpH REMA重炭酸塩を投与することなく、生理的範囲内で一定のINS。 その場で測定された豚の生理値、：pHは7.46±0.06（範囲7.34から7.63）。
図8. HCO 3静脈、平均と標準偏差（ミリモル/リットル）。HCO 3は重炭酸塩を投与することなく、生理的範囲に残っています。 その場で測定された豚の生理値、：HCO 3 30.3±2.4ミリモル/ L（範囲21.6から35.8ミリモル/ L）。
図9.静脈ナトリウム濃度、平均値と標準偏差（ミリモル/ L）。ナトリウムは生理的範囲に残っています。その場で測定されたブタの生理的値：137.1＆＃177; 3.8ミリモル/ L（範囲118.7から140.9ミリモル/ L）。
図10.静脈カリウム濃度、平均値と標準偏差（ミリモル/ L）。カリウムは、生理的な範囲内で一定のままです。その場で測定されたブタの生理的値：3.85±0.46ミリモル/ L（範囲3.5から5.36ミリモル/ L）。
図11.静脈のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、平均と標準偏差（AST; U / L）。ex vivoでの正常体温腎臓灌流では、ASTは、細胞損傷のマーカーを示しています。 AST値は、灌流全体に低くなっています。
図12：乳酸 、平均値と標準偏差（ミリモル/ L）。 エクスビボ正常体温腎臓灌流では、乳酸塩は、細胞傷害のマーカーを表します。値は、灌流を通して安定しています。
図13：血清の浸透圧、平均値と標準偏差（ミリオスモル/ L）灌流液中の一定の浸透圧が低いが一定の尿産生を確保します。その場で測定されたブタの生理的な値：282±1.7ミリオスモル/ L（範囲279から283ミリオスモル/ L）。
図14：マイルド管状空胞形成を示す皮髄接合部の組織学（H＆E）50X / 200X倍率。壊死の兆候はありません。ARGET = "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図15：マイルド管状空胞形成を示す皮髄接合部の組織学（PAS）50X / 200X倍率。壊死の兆候はありません。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図16：組織学（TUNEL染色）25X / 200X倍率。ごくまれに核アポトーシスの非常に低い率を実証染色される。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
Discussion
この研究は、赤血球系溶液でNEVKPブタモデルにおける長期間優れた結果を用いて行うことができることを示しています。 10時間のex vivo灌流の間の腎臓は、安定した灌流パラメータ、アクティブ腎代謝、ホメオスタシス、および最小の腎損傷を示しました。
尿産生および腎臓損傷は、灌流液の組成に依存します。これは、生理的範囲内に灌流液の浸透圧および浸透圧を維持することが重要です。特に、低浸透圧は重要な腎臓浮腫に非生理学的に高い尿産生をもたらし、腎臓損傷のマーカーを増加します。スティーン溶液を含有アルブミンは膠質浸透圧を調節するために、および腎臓のための生理的条件をシミュレートするために、このモデルで選択されます。重炭酸ナトリウム及びグルコン酸カルシウムは、pHを生理的な値を達成するために、システムに追加され、HCO 3
正常体温ex vivoで腎臓灌流の技術はいくつかの制限があります。 エクスビボ灌流は負長い灌流期間に影響を与える可能性が腎臓のホルモンサポートに関連付けられていません。さらに、新しい技術が、この時点で、コストの増加と関連しています。将来の改善は、技術を簡素化し、コストを削減することがあります。ポータブル腎臓灌流装置の開発は完全に将来の冷腎臓の保存を回避することを可能にするかもしれません。
重度かつ持続臓器不足は限界臓器（ECDまたはDCD腎臓移植片）7の使用の増加につながります。現在、臓器保存は、静的冷蔵または低体温マシン灌流に基づいています。長時間の冷虚血時間が重要なインプを持っていたように標準的な基準15と限界移植片8,9の腎機能の結果に作用し、低温貯蔵を最小化する、新しい保存技術は、特に関心16-19です。
より広範限界移植片を使用するための主要な障害は、移植前に臓器の質と生存率を評価することができないことです。現在、ドナーの年齢、ドナーに関連する疾患、および移植片の暖かい虚血時間のみと臨床パラメータは、臓器が移植のために受け入れまたは拒否されたかどうかの決定のために使用されています。正常体温条件下で移植片を保持することにより、グラフト評価は、灌流特性に基づいて、データが可能です。腎血管流量、圧力、腎内抵抗、尿産生、酸素消費量、及び（例えば、ASTおよび乳酸など）、腎臓損傷パラメータとしてリアルタイムパラメータは、移植片の生存率を評価するための有用なパラメータであると考えています。
ADDITでイオン、NEVKP中のアクティブな代謝は、修復戦略のアプリケーションは、移植前に限界腎臓移植を向上させることができます。例えば、炎症誘発性経路、免疫調節、遺伝子転写、ならびに幹細胞投与の阻害は、保存時に腎臓移植を変更し、受信者の転帰を改善するために、将来の技術であってもよいです。
Acknowledgments
私たちは、カスタムメイドの腎臓灌流回路をご提供するためのソリン·グループ（ミラノ、イタリア）に感謝したいと思います。さらに、我々はシリンジポンプ、およびリーベ社＆Co KGに（ロイトリンゲン、ドイツ）との供給のためのスティーン·ソリューション、BBraun AG（メルズンゲン、ドイツ）をご提供するためXVIVO灌流社（ヨーテボリ、スウェーデン）をお願いいたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neonatal cardiopulmonary bypass technology | SORIN GROUP Canada Inc (Markham, Canada) | Custom made | Neonatal venous reservoir D100 (500 ml, 1/16" in- and outflow), neonatal oxygenator D100, centrifugal pump head (Revolution), arterial bubble filter (D130) |
| Heart lung machine, Stöckert S3 | SORIN GROUP Canada Inc (Markham, Canada) | Custom made | Centrifugal pump, roller pump, control panel (sensors for pressure, flow, temperature, bubbles, and level), oxygen blender, heater unit |
| Tubing | SORIN GROUP Canada Inc (Markham, Canada) | 01906BPC SG XS | 3/16" x 1/16" |
| 019071PC SG XS | 1/4" x 1/16" | ||
| 019060PC SG XH | 3/8" x 1/16" | ||
| Tubing connectors | SORIN GROUP Canada Inc (Markham, Canada) | Various sizes | |
| STEEN solution | XVIVO (Göteborg, SWE) | 19004 | 200 ml |
| Ringer's lactate | Baxter (Mississauga, ON, CAN) | JB2324 | 175 ml |
| Sodium bicarbonate | Hospira (Montréal, QC, CAN) | 6625050 | pH-dependent |
| Calcium gluconate | Pharmaceutical Partners of Canada (Richmond Hill, ON) | C31110 | Calcium-dependent |
| Heparin | Sandoz Canada Inc (Toronto, ON, CAN) | 10750 | 1,000 IU |
| Amino acid and glucose, Travasol 10% | Baxter (Mississauga, ON, CAN) | JB6760 | 1 ml/hr |
| Fast acting insulin, Novorapid | Novo Nordisk Canada Inc (Mississauga, ON, CAN) | DS6H748 | 5 IE/hr |
| Verapamil | Sandoz Canada Inc (Quebec, QC, CAN) | 52216 | 0.25 mg/hr |
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