Abstract
Afbakening van ultrastructuur een cel is van belang voor het begrijpen van zijn functie. Dit kan een ontmoedigende project zeldzame celtypen verspreid gedurende weefsels van diverse celtypen, zoals entero-endocriene cellen van het darmepitheel zijn. Deze gastrointestinale sensoren van voedsel en bacteriën moeilijk te bestuderen omdat ze verspreid zijn onder andere epitheliale cellen bij een verhouding van 1: 1000. Onlangs hebben transgene reporter muizen werden gegenereerd om entero-endocriene cellen te identificeren met behulp van fluorescentie. Een daarvan is het peptide YY-GFP muis. Met deze muis, ontwikkelden we een methode om confocale en serieblok-face scanning elektronenmicroscopie correleren. We noemden de methode cocem3D en toegepast op een specifiek entero-endocriene cellen te identificeren in het weefsel en onthullen ultrastructuur van de cel in 3D. De resolutie van cocem3D volstaat organellen celmembranen identificeren zo klein secretorische blaasjes en te onderscheiden van volume rendering. Cocem3D kan gemakkelijk worden aangepast aan de 3D ultrastructuur andere specifieke celtypen te bestuderen in hun eigen weefsel.
Introduction
Het leven in een cel vindt plaats in tijd en ruimte. Veranderingen in de tijd worden vaak bestudeerd met behulp van time-lapse microscopie gecombineerd met fluorescentie beeldvormende technieken, zoals super-resolutie microscopie. Ruimte, in het bijzonder de opstelling van organellen binnen een cel of cel-cel interacties, kunnen alleen worden verkregen door een volledige weergave van fijne structuur van de cel. Een volledig overzicht van fijne structuur van een cel kan ook leiden duidelijkheid genomische functie wanneer het genoom beschikbaar is, zoals C. elegans nematode 1 of de platte Placozoa tricoplax adherens 2. Seriële coupes elektronenmicroscopie is nu een reproduceerbaar, tijd efficiënte en minder kostbare aangelegenheid dankzij de ontwikkeling van geautomatiseerde 3D elektronenmicroscopie technologieën zoals serieblok-face scanning elektronenmicroscopie 3 (SBEM).
De noodzaak van structurele informatie te functioneren opheldering is duidelijk door bepaalde cell types indien functie is afhankelijk van fysieke cel-cel interacties, zoals neuronen, glia of sensorische epitheelcellen. We zijn vooral geïnteresseerd ophelderen hoe zintuiglijke signalen van voedingsstoffen in de lumen van het darmkanaal getransduceerd in een elektrisch signaal dat uiteindelijk moduleert begerend gedrag. Het circuit is complex maar begint aan de darmwand onvoldoende opname in contact komen met sensorische epitheelcellen, genaamd entero-endocriene cellen. In tegenstelling tot andere sensorische epitheelcellen, zoals smaak cellen worden entero-endocriene cellen gedispergeerd door het darmepitheel in een verhouding van 1-1000 4-7. Daarom hebben zij moeilijk te identificeren en bestuderen, en gedurende lange tijd zij werden beschouwd als bron van darmhormonen. Maar met de ontwikkeling van cel-specifieke fluorescentie reporter muizen, de complexe sensorische functie van deze cellen is ontstaan. Met behulp van een van deze reporter muizen, een peptide YY-GFP (PyyGFP) muis, vonden we dat enteroendocrine cellen hebben een prominente cytoplasmastaart dat we de naam neuropod. Het uiterlijk van neuropods suggereerde een geconserveerd functie in cel-tot-cel communicatie. Zo redeneerden we dat documenteren de ultrastructuur van de entero-endocriene cel, de functie van neuropods kan worden afgeleid.
De noodzaak om de structuur van een aanhangsel begrijpen een gedispergeerde cel die moeilijk te identificeren is de belangrijkste reden voor de ontwikkeling van een werkwijze voor confocale microscopie en SBEM combineren. De cel plaats werd geïdentificeerd met behulp PyyGFP entero-endocriene cel-specifieke reporter muizen. De methode liet ons toe om het hele ultrastructuur van een entero-endocriene cellen en zijn neuropod documenteren. Binnen neuropods, vonden we structurele kenmerken van neuronale axonen en buiten neuropods, vonden we een fysieke relatie met enterische glia 8. Inderdaad, neuropods bevatten ongeveer 70% van secretoire vesikels suggereert een belangrijke rol bij de secretoire functie van deze cellen. Voortbouwend op destructuurgegevens onlangs vonden we dat door deze neuropods, entero-endocriene cellen en neuronen innerveren de darm vormen een neuro-epitheliale circuit, vergelijkbaar met die van cellen smaak in de tong 8,9.
Het blootleggen van dergelijke functies van gastro-intestinale chemosensory mechanismen vloeide voort uit structurele gegevens verzameld met behulp van deze correlatieve microscopie methode. Wij geloven dat deze methode kan nuttig zijn in andere gebieden van celbiologie, vooral wanneer cellen worden gedispergeerd in de weefsels op een zeer lage verhouding. We verwezen naar de werkwijze correlatieve confocale en serieblok gezicht scanning elektronenmicroscopie in 3D (Cocem3D). De methode bestaat uit de volgende stappen: weefsel dissectie, confocale microscopie, SBEM imaging, SBEM en confocale image correlation en handmatige segmentatie. In vergelijking met andere methoden correlatieve Het concept is vrij eenvoudig omdat de correlatie fysische plaats van chemische.
Protocol
Alle dierlijke zorg en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met een protocol door de Duke University Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd.
Cocem3D veroorzaakt door een combinatie van eerder gepubliceerde protocollen 10,11 en werd hier toegepast op een specifieke entero-endocriene cel met een reporter PyyGFP muis 12 bestuderen. Deze werkwijze kan gemakkelijk worden toegepast op andere cellen van belang in de handel verkrijgbare transgene reporter muizen. De werkwijze wordt beschreven in drie secties: Correlatieve confocale microscopie, serieblok face scanning elektronenmicroscopie (SBEM) en data teruggeven in 3D.
Correlatieve confocale microscopie
Het doel van deze sectie is om een weefsel segment van de distale colon van dimensies die correlatieve confocale en SBEM beeldvorming mogelijk te oogsten. Het protocol is als volgt:
1. Oogsten de Tissue
- Bereiden10 ml van 50 ug / ml heparine-oplossing in PBS.
- Bereid xylazine / ketamine anesthetische voorraad door mengen van 10 ml ketamine (100 mg / ml) en 1 ml xylazine (20 mg / ml).
- Verdunnen xylazine / ketamine voorraad 1: 4 in 0,1 M PBS.
- Bereid een 100 ml fixeeroplossing met 4% paraformaldehyde en 0,1% glutaaraldehyde in PBS.
- Verdoven een PyyGFP muis, 6-10 weken oud, met een letale dosis van xylazine / ketamine anesthesie. Injecteer de verdoving intraperitoneaal op 0,15 ml per 20 g muis gewicht.
- Bevestig de juiste muis verdoving door knijpen de staart of tenen, en gebruik zalf op de ogen tot droog te voorkomen.
- Gebruik een variabel debiet peristaltische pomp fixeer intracardiaal 10 perfuseren. Met behulp van chirurgische scharen (13 cm lengte) opengesneden de buikholte naar de darmen, hart en longen bloot. Houd hart met smalle-patroon gebogen pincet (12 cm lengte) en steek vlinder naald (19 G) van peristaltische pomp into verliet ventrikel. Onmiddellijk dwars atrium met veer straight schaar (lengte 4 mm). Perfuseren met een snelheid van 2 ml / minuut eerst met heparine oplossing gedurende 1 min, en vervolgens met ijskoud fixatief gedurende 15 min tot staart muis volledig stijf.
Opmerking: Het is zeer belangrijk om perfuseren met een lage snelheid om barsten van kleine vaartuigen in de intestinale mucosa voorkomen. Barsten van de schepen zal ultrastructuur van het weefsel in gevaar brengen. Als perfusie voldoende is, moet de lever bleke draaien in kleur binnen 3-5 min. - Met behulp van kleine schaar te openen de buikholte en uitsnijden het gehele colon van de verbinding met de blindedarm naar het distale rectum. Plaats het weefsel in ijskoude PBS. Terwijl ondergedompeld in PBS, opengesneden met kleine lente schaar de dikke darm langs de mesenterium.
2. Opheldering en Fixing weefselsegmenten
- Met behulp van een scalpel gesneden ongeveer 6 kleine weefselsegmenten (2 mm 2) vanaf het distale colon. Doe dit op een vel of tandheelkundige wax en ondergedompeld in een paar druppels PBS.
- Na de vaststellen van de weefsel segmenten fixeeroplossing gedurende 3 uur bij 4 ° C.
3.-Micro ontleden Tissue Blocks
- Bereid 5% laagsmeltende agarose in PBS en bewaar het in een waterbad bij 45 ° C.
- De weefselsegmenten insluiten in 5% laagsmeltende agarose met een kleine plastic container, zoals de standaardmaat Tissue-Tek Cryomold.
- Monteer de ingebedde coupes op een trillend mes microtoom en vul de buffer lade met ijskoude PBS.
- Snij 300 urn weefselstrips 0.8 amplitude en 0,04 mm / sec snelheid. Opmerking: Op dit punt zal de weefselstrips losraken uit de agarose.
- Re-insluiten 300 micrometer weefsel strips in agarose en monteer ze op microtoom loodrecht op het blad van de vibratome's.
- Met een vibratome gesneden weefselstrips bij een dikte van 50 urn. Opmerking: De uiteindelijke weefselblokken moet ongeveer 300 urn breed x 50 urn dik zijn. Deze dimensions geoptimaliseerd van experimentele confocale experimenten die toonden dat de dikte van de entero-endocriene cel tussen 15-20 urn en neuropod's length 30-70 nm. Daarom kan een gehele cel valt binnen een blok weefsel 300 pm breed en 50 urn dik zijn indien de oriëntatie van de cel parallel aan het vlak van het weefsel blok. Deze afmetingen variëren afhankelijk van het weefsel en celtype van belang.
- Bewaar de weefselblokken in PBS bij 4 ° C.
4. Confocale Imaging
- Bereid een nucleaire kleuroplossing door verdunning DAPI in PBS bij 1: 4000.
- Incubate weefsel blokken in DAPI nucleaire vlek voor 5 min. Opmerking: DAPI vlekken vergemakkelijkt onderscheidende individuele cellen door hun kernen, die nuttig is voor het correleren van de confocale en SBEM beelden.
- Mount weefsel blokken op opgeladen glasplaatje, voeg een paar druppels PBS, en bedek ze met een dekglaasje.
- Met behulp van een confocale microscoop, identificeren blocks met intacte villi en PyyGFP cellen van belang en afgebeeld hen om z-stacks optische secties te verkrijgen.
- Gebruik een 20X / 0.8 Zeiss Plan Apochromat doel z-stacks van 1 micrometer optische secties te verkrijgen.
- Voor de z-stack, gebruikt de kanalen 405 nm (DAPI) de verhouding tot andere cellen te bepalen, 488 nm GFP endogeen voor de cel van belang te lokaliseren en differentiële interferentie contrast (DIC) naar locatie van de cel te bepalen ten opzichte van de lumen.
- Gebruik beeldresolutie van 1.024 pixels of hoger.
5. Embedding Blokken in Agarose
- Bereid 10 ml fixeermiddel met 4% paraformaldehyde en 2,5% glutaaraldehyde in PBS.
- Verwijder het weefsel blokken van het glaasje door voorzichtig PBS in de randen van het dekglaasje glijdt het dekglaasje van het glaasje zonder schade aan het weefsel te blokkeren. Gebruik vervolgens een kunst penseel om het weefsel blok overdracht van de glijbaan naar een 10,5 ml microcentrifugebuis met 4% paraformaldehyde en 2,5% glutaaraldehyde fixeermiddel.
- Post-fix weefselblokken O / N bij 4 ° C.
- Transfer weefsel blokken om PBS. Dan insluiten blokken flat in 5% laagsmeltende agarose door sandwiching ze tussen twee glasplaatjes.
Opmerking: Verankering van blokken in een dunne laag van agarose vergemakkelijkt posterior manipulatie tijdens kleuring. - Snijd de agarose in een vierkant en maak een inkeping op de bovenste kant. Opmerking: Deze stap is noodzakelijk om de oriëntatie volgende stappen behouden.
- Bewaren blokken in een 1,5 ml microcentrifuge buis met PBS bij 4 ° C tot verdere verwerking.
Serial Block-face Scanning Electron Microscopy (SBEM)
In deze paragraaf wordt het weefsel blok voorbereid en afgebeeld met SBEM bij lage vergroting. Het onderzoek afbeelding van het blok gezicht wordt vervolgens gecorreleerd met de confocale data aan de regio die de cel van belang te identificeren. Zodra de regiowordt geïdentificeerd, wordt het weefsel afgebeeld met een resolutie van 7 nm / pixel en plakken van 70 nm. Dit was voldoende om op te lossen en te onderscheiden grote dichte kern secretie blaasjes van andere organellen. In entero-endocriene cellen, dit soort vesicula varieert tussen 100 en 150 nm in diameter 13. Het protocol is als volgt:
6. kleuring Tissue Secties
- Verwijder weefsel uit PBS en driemaal spoelen, 5 minuten elk, in 0,1 M cacodylaatbuffer.
- Stain blocks 1 uur in 0,1% looizuur opgelost in 0,1 M cacodylaatbuffer contrast van celmembranen 14 verbeteren.
- Voeren daaropvolgende kleuring en uitdroging van het weefsel volgens de gepubliceerde protocol 11. Na Deerinck et al. protocol, bereidt de volgende oplossingen: 1) 1% (w / v) thiocarbonhydrazide (THC); 2) leiden aspartaat oplossing; 3) 1% uranyl acetaat en 4) osmium tetraoxyde / kaliumferrocyanide (OsO 4 / K Ferrocyanide). Meng 4% OsO 4 en 2xK Ferrocyanide voorraad [0,3 g K Ferrocyanide en 0,86 g Na cacodylate in 10 ml H 2 O] 1: 1 ratio naar OsO 4 / K Ferrocyanide maken. Opmerking: Na het weefsel ingebed in agarose vergemakkelijkt behandeling tijdens kleuring. Verwijder agarose voor volgende hars infiltratie zorgvuldig.
- Spoel monsters driemaal, 5 minuten elk, in 0,1 M cacodylaatbuffer en kleuren met OsO4 / K Ferrocyanide oplossing gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Spoelen met ultrapuur water driemaal, 5 minuten elk, en vlek met TCH gedurende 30 minuten bij 60 ° C.
- Spoelen met ultrapuur water driemaal, 5 minuten elk en vlek met 2% OsO 4 (geen K Ferrocyanide) gedurende 60 min bij RT. Spoel opnieuw in ultra zuiver water drie keer, 5 minuten elk.
- Vlek met 1% uranylacetaat O / N bij 4 ° C. Spoel in ultra zuiver water drie keer, 5 minuten elk.
- Vlek met lead aspartaat gedurende 30 minuten bij 60 ° C. Spoel in ultra zuiver water drie keer, 5 minuten elk.
- Dehydrateer weefsels door spoelen in solutions met toenemende concentraties ethanol. Spoel 2 keer, 5 minuten elk, met 50%, 75%, 85%, 95% en 100% absolute ethanol. Eind Spoel secties met propyleenoxide tweemaal, 10 minuten elk.
7. Infiltrating and Embedding Tissue Secties in hars
- Infiltreren de blokken met hars met de commercieel avaialble kit. Insluiten weefsels in hars met behulp van een EPON inbedding kit. Bereid een harsmengsel van 48% Epoxy, 20% DDSA ml, 30 ml NMA% en 2% DMP30. Schud harsmengsel krachtig gedurende 5 minuten en plaats mengsel in vacuüm gedurende 30 min staan om luchtbellen te boven komen.
- Meng hars met propyleenoxide in verhouding 1: 1 en schud krachtig. Verwijder de uiteindelijke dehydratie spoeling uit weefsels en voeg hars gemengd met propyleenoxide. Plaats injectieflacon met monsters in een rotator O / N en verlaat flacon afgetopte. De volgende dag, toevoegen van vers EPON hars en meng gedurende 90 min in rotator.
- Insluiten blokken in hars zo plat mogelijk door sandwiching ze intussen glasplaatjes die zijn uitgehard met vloeibaar lossingsmiddel om te voorkomen dat ze aan elkaar plakken 15.
- Zodra de blokken vlak zijn ingebed, harden de blokken voor een toevoeging 48 uur bij 60 ° C.
- Trek slides elkaar om de blokken vrij.
8. Montage en Trimmen de Tissue Block for Imaging
- Onder een ontleding scope, overeenkomen met de oriëntatie van het weefsel blokken ingebed in hars met die van de confocale microfoto vergemakkelijking identificeren van de gebieden met de cellen van belang voor het trimmen van het blok.
- Trim de hars ingesloten blok handmatig naar beneden om een ~ 500 x 500 pm block-face.
- Monteer het blok plat op een pin met geleidende epoxy en droog gedurende 30 min. Daarna lag het blok plat op een oppervlak en droog O / N op 60 ° C.
- Coat het blok met colloïdaal zilver vloeistof. Handhaaf de weefselcoupes plat snijden van het blok waarborgen haaks op co vergemakkelijkenrrelating de seriële block-face en confocale microfoto.
9. SBEM
- Afbeelding het blok met behulp van een Scanning Electron Microscope voorzien van een SBEM systeem (e .G., 3View).
- Stel de eerste sectie dikte bij ~ 2 micrometer stappen en snijd tot het gezicht van weefsel blijkt uit het blok.
- Verwerven van een Surver beeld van het hele blok gezicht.
- Met behulp van Fiji software, metingen van zowel de seriële block-face en confocale microfoto nemen om een gemeenschappelijke noemer en rekening voor monster kromtrekken genereren tijdens fixatie en kleuring 16.
- Zoek het gebied van de rente op het blok gezicht door de noemer te vermenigvuldigen met de coördinaten in de confocale beelden. Gebruik ook andere structurele kenmerken, zoals de positie van microvilli, goblet cellen of lamina propria, als referentie.
- Afbeelding regio van belang bij een 2.25 kV en 7 nm / pixel (of 15,147X vergroting) in hoog vacuüm mode. Stappen Slice moet worden ingesteldbij 70 nm of minder.
- Verzamel SBEM data in ruwe 16-bit .dm3 formaat.
10. Optimizing SBEM Images for Surface Segmentatie
- SBEM beelden van ruwe .dm3-formaat te converteren naar 8-bit tiff.
- Filter .tiff beelden met behulp van een 0,8 Gaussian Blur filter in Fiji.
- De schaal van het ingesteld op 25% van de oorspronkelijke grootte van gegevens en deze opslaan als een .tiff stack om de hoeveelheid RAM-geheugen nodig om de set te behandelen minimaliseren.
- Lijn de stapel SBEM beelden met behulp van de Fiji-plugin "lineaire stack afstemming met SIFT" in de vertaling modus en bijgesneden met behulp van de "crop 3D" plugin. Opmerking: bijsnijden helpt om verder verlaagd de hoeveelheid RAM-geheugen die nodig is voor het segmenteren en het volume rendering.
Gegevens Rendering in 3D
11. Confocale microscopie
- Reconstrueren z-stacks met de automatische overtreffen modus van de "vlakken" tool. Figuur 1D, toont een reconstruction van elk kanaal met de gladde optie op de oppervlakken gebied detail op 0,126 micrometer en drempelwaarden als absolute intensiteit.
12. Serial Block-face SEM
Opmerking: De handmatige data segmentatie is een zeer tijdrovende procedure en afhankelijk van de kenmerken van de procedure kan enkele weken duren om te worden gemaakt. Segmentatie voor de video's en cijfers gepresenteerd in Bohórquez et al. 2014 8 werd met de hand gedaan en duurde ongeveer 500 uur van de arbeid. Het wordt aanbevolen om de essentiële kenmerken nodig rendering voor het begin van de segmentatie proces prioriteit. De procedure is als volgt:
- Gebruik de "vlakken" tool in de draw mode en de "contour" optie in het tekenen van de wijze van 50 msec te segmenteren handmatig en volume maakte de cel van belang.
- Trace contouren op elk stukje van de cel voor een soepeler rendering of elke 5 schijfjes voor snellere rendering.
- Export uiteindelijke imleeftijden met behulp van het "snapshot" tool met een resolutie van 300 dpi of meer.
Representative Results
De hier gepresenteerde methode werd gebruikt om de ultrastructuur van een bepaalde cel te bestuderen in een laag epitheel. De cel van belang is in dit geval de ongrijpbare entero-endocriene cel. Hun identificatie in situ is mogelijk geworden in de laatste jaren met de ontwikkeling van cel-specifieke fluorescentie reporter muizen. In 2011 ontwikkelden we een muis waarin de promoter van het hormoon PYY drijft de expressie van groen fluorescent eiwit 17. In dit PyyGFP muis worden entero-endocriene cellen van het distale deel van de dunne darm en colon gemakkelijk onderscheiden onder UV licht. Dit muismodel was een stichting naar een tissue blok met een entero-endocriene cellen te identificeren en te verwerken voor SBEM. De correlatie methode wordt hier genoemd als cocem3D en werd gebouwd op de eerder gepubliceerde protocollen 10,11.
Het optimaliseren van de afmetingen van de weefselblokje is essentieel voor de correlatie. In voorlopige experimenten,werd vastgesteld dat in een weefselblok 300 um lang x 50 urn dik het aantal SBEM afbeeldingen wordt geminimaliseerd, terwijl die het lichaam van de cel van belang. Figuur 1A toont overziet van de dissectie met een vibreerblad microtrome aan verkrijgen van het weefsel blok met de juiste afmetingen. Ten minste 100 blokken worden verkregen vóór sortering door hen aan die met intacte cellen van belang te kiezen. Geselecteerde blokken worden afgebeeld door confocale microscopie en het z-stacks worden optisch gescheiden om 1 urn (figuur 1B en C). Figuur 1D toont een volume weergegeven aanzicht van een entero-endocriene cel in het ileum van de muis. Zijn prominente neuropod strekt zich onder epitheelcellen van ~ 60 micrometer.
De cel van belang wordt gevonden door het correleren van de confocale z-stacks een SBEM beeld van het hele blok gezicht met. Een voorbeeld wordt hier gepresenteerd van een blok van de distale colon van een PyyGFPmuis. Na het verkrijgen confocale z-stacks (Figuur 2A), wordt het blok ingebed in een dunne laag van laagsmeltende agarose (figuur 2B). Dit is noodzakelijk voor de daaropvolgende manipulatie van het blok. Het is belangrijk dat de oriëntatie van het blok zo plat mogelijk om de optische schijven met SBEM segmenten overeenkomen handhaven. In figuur 2C wordt een representatief beeld weergegeven van het gehele oppervlak van het weefsel blok. Delen van deze figuur zijn eerder gepubliceerd in Bohorquez et al., 2014 8. Dit werd vervolgens gecorreleerd met de confocale afbeelding met inachtneming weefsel monumenten en afmetingen. Figuur 2D toont een overlay van het beeld SBEM confocale en het blok, waaruit de precieze locatie van onze cel van belang.
Zodra de cel is geïdentificeerd, wordt SBEM beeldvorming gedaan op een resolutie hoog genoeg om secretie blaasjes en andere celorganellen te identificeren. De set gegevens presenteerde hijre werd afgebeeld bij 7 nm per pixel als beeld van het blok werden elke 70 nm. De set gegevens 643 beelden die overspannen 45 pm van het weefsel diepte. Een paar micrometer worden geschoren tijdens de eerste beeldvorming van het hele blok gezicht bij lage vergroting. De set ruwe SBEM data werd verkregen in .dm3 formaat en omgevormd tot .tiff voor verdere afhandeling. De SBEM stack werd bijgesneden met behulp van de Fiji-software plugin "gewas (3D)" blok om alleen de regio van belang bevatten. Dit vermindert de hoeveelheid RAM-geheugen die nodig is voor het volume rendering. De cel werd geïdentificeerd door het positie en secretoire vesikels en gesegmenteerd behulp Imaris software. Figuur 3 bevat een weergave in 3D van de entero-endocriene cel.
Figuur 1:. Correlatieve confocale microscopie (A) workflow een stuk ontledendarmweefsel in een weefselblok 300 x 50 urn dik. (B) Een vertegenwoordiger weefselblokje van de juiste afmetingen. Merk op dat een weefsel blok van deze afmetingen van de muis dunne darm meet ongeveer 3 villi of, in het geval van de dikke darm ongeveer 8 crypten. (C) Een villi in de dunne darm met een cel van belang. (D) Een confocale z-stack in 3D behulp Imaris software toont een entero-endocriene cel een prominente neuropod loopt onder het darmepitheel. Blauw = DAPI nucleaire vlek. Bars = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Serial block-face scanning elektronenmicroscopie (A) confocale beeld van een Sele.CTED weefsel blok van de dikke darm met PyyGFP entero-endocriene cellen (groen) van belang. (B) Wanneer het blok wordt afgebeeld door confocale microscopie, wordt vervolgens ingebed flat in laagsmeltende agarose gebruikt objectglaasjes. Inbedding het weefsel blok in agarose vergemakkelijkt latere manipulatie, en de inkeping op de linker hoek helpt om het blok binnen de SBEM monteren in de juiste oriëntatie. (C) SBEM beeld van het gezicht van het blok. (D) Correlatie van de confocale gegevens SBEM naar cel van belang (witte pijl) te identificeren. Images in c en d van dit cijfer worden gewijzigd ten opzichte van Bohorquez et al., 2014 8. Blauw = DAPI nucleaire vlek. Bars = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Gegevens teruggeven in 3D (A) Volume teruggeven van entero-endocriene cel met behulp Imaris software. De cel bevat een neuropod vol secretorische blaasjes. Voor een volledige beschrijving van de ultrastructuur van een entero-endocriene cellen, verwijzen wij u naar Bohórquez et al., 2014 8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Gastro-intestinale chemosensation is in opkomst als een spannende nieuwe veld in het biomedisch onderzoek. Dit is voor een groot deel te wijten aan de ontdekking van functionele smaakreceptoren in enteroendocrine cellen 18. Daaropvolgende studies hebben aangetoond dat enteroendocrine cellen brengen specifieke receptoren voor nutriënten, zoals koolhydraten, vetten en aminozuren 5,6,19,20. De katalytische factor van deze ontdekkingen is de ontwikkeling van reporter muizen, waarbij entero-endocriene cellen fluorescerend gelabeld 20. We ontwikkelden een van deze muizen de PyyGFP muis om entero-endocriene cellen van de distale dunne darm en colon 17,21 bestuderen. Deze cellen zijn van belang omdat zij afscheiden PYY en glucagon-achtige peptide-1, die beide induceren van verzadiging 22,23. Op het moment, een compleet ultra-structurele rekening van deze cellen ontbrak, die we geloofden was essentieel voor hun signalering mechanismen te begrijpen.
NHOUD "> Hier beschreven we een visueel een methode om confocale microscopie te overbruggen met SBEM. De methode wordt aangeduid als Cocem3D, die ons toeliet om het volledige ultrastructuur van entero-endocriene cellen te documenteren. We hebben gemeld dat deze cellen hebben een neuropod dat drie- bevat vierde van alle secretoire vesicles 8. In het neuropod er neurofilaments en net als neuronale axons worden neuropods gevoed door enterische gliacellen 8. Belangrijker is echter dat deze neuropods entero-endocriene cellen fysiek aansluiten op neuronen innerveren de darm en colon 9.Een van de sterke punten van cocem3D is de eenvoud. Vermindering van het weefselmonster in een blok dat kan worden afgebeeld door confocale en SBEM vergemakkelijkt de identificatie van een specifieke cel in een weefsel. Secretorische blaasjes en andere organellen kunnen worden geïdentificeerd met gemak op een resolutie van 7 nm / pixel. Omdat de secties in SBEM worden weggegooid, verdere proceszingen van de weefsels om specifieke eiwitten te identificeren is geen optie op dit punt. De ontwikkeling van methoden zoals ATUM 24, waarbij gedeelten van de weefselblokje bewaard, waarschijnlijk de identificatie van specifieke eiwitten in de cel mogelijk maken. Het bepalen van de specifieke locatie van chemosensory receptoren op entero-endocriene cellen essentiële informatie voor de ontwikkeling van antivirale therapieën voor obesitas, omdat entero-endocriene cellen zintuiglijke interface tussen voedsel in de darm en verzadiging in de hersenen.
Disclosures
Dr. Satish Medicetty is een werknemer van en ontvangt 100% salaris van Renovo Neural Inc; dit echter niet vasthouden van de auteur om Jupiter beleid te veranderen op gegevens en materiaal te delen. Geen belangenconflict wordt verklaard voor de resterende auteurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life technologies | 10010023 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4%, freshly made in PBS, final pH 7.4 |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882 | |
| Dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Low-melting agarose | Life technologies | 16520-100 | 5%, freshly made in PBS |
| Standard Tissue-Tek Cryomold | Electron Microscopy Sciences | 62534-25 | |
| DAPI nuclear stain | Life technologies | D1306 | |
| Postively charged glass slides and coverslips | |||
| Fine art paintbrush #1 | |||
| Cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 11650 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21700 | |
| EMbed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Liquid releasing agent | Electron Microscopy Sciences | 70880 | |
| Liquid silver colloidal | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
| CircuitWorks conductive epoxy | ITW Chemtronics | CW2400 | |
| Variable flow peristaltic pump | VWR | 70730-064 | |
| VT1200S Vibrating blade microtome | Leica | ||
| Zeiss 780i confocal microscope | Carl Zeiss | ||
| Sigma VP Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss | ||
| 3view system | Gatan | ||
| Renovo Neural Inc (Cleveland, OH) | http://www.renovoneural.com | Renovo provides 3d EM services | |
| Fiji software | Open access software | ||
| Computer station with 16 GB of RAM or more | |||
| Data visualization software Imaris 7.5 | Bitplane |
References
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).
- Smith, C. L., et al. Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens. Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS biology. 2, e329 (2004).
- Engelstoft, M. S., et al. Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells. Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).
- Chandra, R., et al. Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion. The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).
- Wang, Y., et al. Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).
- Bohórquez, D. V., et al. An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy. PloS one. 9, e89881 (2014).
- Bohórquez, D. V., et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. The Journal of clinical investigation. , (2015).
- Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).
- Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California. San Diego San Diego, CA. (2010).
- Bohórquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).
- Nilsson, O., et al. Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon. Endocrinology. 129, 139-148 (1991).
- Mizuhira, V., Futaesaku, Y. New fixation method for biological membranes using tannic acids. Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).
- Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy. Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
- Bohórquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).
- Jang, H. J., et al. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).
- Liou, A. P., et al. The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin. Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).
- Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).
- Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets. Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).
- Batterham, R. L., et al. Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake. Nature. 418, 650-654 (2002).
- Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans. The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).
