Abstract
Avgränsning av en cells ultra är viktigt för att förstå dess funktion. Detta kan vara en skrämmande projekt för sällsynta celltyper sprids i hela vävnader gjorda av olika celltyper, såsom enteroendocrine celler i tarmepitelet. Dessa gastrointestinala sensorer av mat och bakterier har varit svår att studera eftersom de är dispergerade bland andra epitelceller i ett förhållande av 1: 1000. Nyligen har transgena reporter möss genererats för att identifiera enteroendocrine celler med hjälp av fluorescens. Ett av dessa är den peptid YY-GFP-mus. Genom att använda denna mus har vi utvecklat en metod för att korrelera konfokala och serieblock ansikte svepelektronmikroskop. Vi döpte metoden cocem3D och tillämpat det att identifiera en specifik enteroendocrine cell i vävnad och avslöja cellens ultra i 3D. Upplösningen på cocem3D är tillräcklig för att identifiera organ så små som sekretoriska vesiklar och för att skilja cellmembran för volym rendering. Cocem3D kan enkelt anpassas för att studera 3D ultrastrukturen hos andra typer specifika cell i deras naturliga vävnaden.
Introduction
Livet i en cell sker i tid och rum. Förändringar över tiden är ofta studeras med time-lapse mikroskopi i kombination med fluorescens avbildningstekniker, som super-upplösning mikroskopi. Space, särskilt arrangemanget av organ inuti en cell eller cell till cell interaktioner, kan endast erhållas genom en fullständig redogörelse för cellens fin struktur. En fullständig redovisning av en cells fin struktur kan också få klarhet i genomisk funktion i de fall där genomet är tillgänglig, liksom C. elegans nematod 1 eller den platta placozoa tricoplax adherens 2. Seriell sektione elektronmikroskopi är nu en reproducerbar, tidseffektivt och mindre dyr uppgift tack vare utvecklingen av automatiserade 3D elektronmikroskopiska tekniker, såsom serieblock ansikte svepelektronmikroskopi 3 (SBEM).
Behovet av strukturell information för att belysa funktionen är mycket tydlig i vissa cell typer där funktionen beror på fysiska cell-till-cell-interaktioner, såsom neuroner, Glia, eller sensoriska epitelceller. Vi är särskilt intresserade av att belysa hur sensoriska signaler från näringsämnen i lumen i tarmen är omvandlas till en elektrisk signal som i slutändan modulerar appetitive beteenden. Kretsen är komplex men börjar vid väggen i tarmen där näringsämnen kommer i kontakt med sensoriska epitelceller, kallade enteroendocrine celler. Till skillnad från andra sensoriska epitelialceller, såsom smakceller, är enteroendocrine celler dispergerade genom tarmepitelet vid ett förhållande av 1 till 1000 4-7. Följaktligen har de varit svåra att identifiera och studera, och under lång tid de sågs bara som en källa till tarmhormoner. Men med utvecklingen av cellspecifika fluorescens reporter möss, är den komplexa sensorisk funktion hos dessa celler att växa fram. Med hjälp av en av dessa reporter möss, en peptid YY-GFP (PyyGFP) mus, fann vi att enteroendocrINE-celler har en framträdande cytoplasmasvans som vi döpte neuropod. Utseendet på neuropods föreslog en konserverad funktion i cell-till-cell-kommunikation. Således resone vi att genom att dokumentera ultrastrukturen av en enteroendocrine cell, vars funktion neuropods kunde härledas.
Behovet av att förstå strukturen av ett bihang i en spridd cell som är svårt att identifiera var det huvudsakliga skälet till att utveckla en metod för att kombinera konfokalmikroskopi och SBEM. Cellen av intresse identifierades med användning PyyGFP enteroendocrine cellspecifika reporter möss. Metoden tillät oss att dokumentera hela ultra av en enteroendocrine cellen och dess neuropod. Inom neuropods, fann vi strukturella drag av neuronala axoner, och utanför neuropods, fann vi en fysisk relation till enter glia 8. I själva verket, neuropods innehåller ca 70% av alla sekretoriska vesiklar antyder en viktig roll i den sekretoriska funktion av dessa celler. Att bygga påstrukturdata, mer nyligen visade det sig att genom dessa neuropods, enteroendocrine celler och neuroner som innerverar tarmen bilda ett neuroepiteliala krets, liknande den i smakceller i tungan 8,9.
Avslöjande sådana funktioner av gastrointestinala chemosensory mekanismer härrörde från struktur uppgifter som samlats in med hjälp av denna korrelat mikroskopi metod. Vi tror att denna metod skulle kunna vara användbara inom andra områden av cellbiologi, särskilt när celler är dispergerade i vävnaderna vid ett mycket lågt förhållande. Vi hänvisade till metoden som korrelat konfokala och serieblock ansikte svepelektronmikroskop i 3D (Cocem3D). Metoden består av följande huvudsteg: vävnad dissektion, konfokalmikroskopi, SBEM bildbehandling, SBEM och konfokal bild korrelation, och manuell segmentering. Jämfört med andra korrelativa metoder, är begreppet ganska enkel eftersom korrelationen är fysisk snarare än kemisk.
Protocol
Alla djuromsorg och experiment gjordes i enlighet med ett protokoll som godkänts av Duke University Institutional Animal Care och användning kommittén.
Cocem3D härrörde från en kombination av tidigare publicerade protokoll 10,11 och tillämpades hit för att studera en viss enteroendocrine cell med hjälp av en PyyGFP reporter mus 12. Denna metod kan lätt tillämpas på andra celler av intresse med användning av kommersiellt tillgängliga transgena reporter möss. Metoden beskrivs i tre sektioner: Korrelat konfokalmikroskopi, serieblock ansikte svepelektronmikroskop (SBEM) och data rendering i 3D.
Korrelativ konfokalmikroskopi
Syftet med detta avsnitt är att skörda ett vävnadssegment från den distala kolon med dimensioner som tillåter korrelat konfokala och SBEM avbildning. Protokollet är som följer:
1. Skörd Tissue
- Förbered10 ml av 50 | ig / ml heparinlösning i PBS.
- Förbered xylazin / ketamin anestetikum lager genom att blanda 10 ml Ketamin (100 mg / ml) och 1 ml xylazin (20 mg / ml).
- Späd xylazin / ketamin lager 1: 4 i 0,1 M PBS.
- Bered en 100 ml fixeringslösning innehållande 4% paraformaldehyd och 0,1% glutaraldehyd i PBS.
- Söva en PyyGFP mus, 6 till 10 veckor gamla, med en dödlig dos av xylazin / ketamin bedövningsmedel. Injicera bedövningsmedel intraperitonealt på 0,15 ml per 20 g mus vikt.
- Bekräfta korrekt mus anesthetization genom att klämma svansen eller tår, och använd salva på ögonen för att förhindra torrhet.
- Använd en variabelt flöde peristaltikpump att BEGJUTA fixativ intracardially 10. Användning av kirurgiska saxar (13 cm lång) skar upp bukhålan för att exponera tarmar, hjärta och lungor. Håll hjärta med smal mönster böjda pincett (12 cm längd) och sätt fjärilsnål (19 G) från peristaltikpump into vänster ventrikel. Omedelbart skär höger förmak med fjäder raka sax (längd 4 mm). Perfundera vid en hastighet av 2 ml / min först med heparinlösning under 1 min, och därefter med iskall fixativ lösning för 15 min tills musens svans är helt stel.
Obs: Det är mycket viktigt att perfundera i långsam takt för att förhindra bristning av små fartyg i tarmslemhinnan. Bristning av fartyg kommer att kompromissa vävnadens ultra. Om perfusion är tillräcklig, bör levern blekna i färg inom 3-5 minuter. - Använda en liten sax öppna bukhålan och skära hela tjocktarmen från korsningen med blindtarmen till den distala rektum. Placera vävnaden i iskall PBS. Medan nedsänkt i PBS, uppskuren med små våren sax kolon längs tarmkäxet.
2. Analysera och Fästvävnadssegment
- Med användning av en skalpell, klippa ungefär sex små vävnadssegmenten (2 mm 2) från den distala kolon. Gör detta på ett ark of dentalvax och nedsänkt i några droppar PBS.
- Efter fixera vävnadssegment i fixativ lösning under 3 h vid 4 ° C.
3. Micro-dissekera vävnadsblock
- Bered 5% lågsmältande agaros i PBS och förvara den i ett vattenbad vid 45 ° C.
- Bädda vävnadssegment 5% låg smältpunkt agaros med en liten plastbehållare, som standardstorlek Tissue-Tek Cryomold.
- Montera de inbäddade sektionerna på en vibrerande blad mikrotom och fylla buffertfacket med iskall PBS.
- Skär 300 pm vävnadsremsor på 0,8 amplitud och 0,04 mm / sekund hastighet. Notera: Vid denna punkt kommer vävnadsremsor rubbas från agarosen.
- Åter bädda 300 pm vävnadsremsor i agaros och montera dem på mikrotomen vinkelrätt mot vibratome klinga.
- Med användning av en vibratom, skär vävnadsremsor med en tjocklek av 50 | im. Obs: De slutliga vävnadsblock bör vara ca 300 um bred x 50 um tjockt. Dessa dimensions optimeras från pilot konfokala experiment som visade att tjockleken hos enteroendocrine cell är mellan 15-20 um och neuropod längd 30-70 nm. Därför skulle en hel cell finnas inom ett block av vävnad 300 ^ m bred och 50 ^ m tjock om cellens orientering är parallell med ytan av vävnadsblock. Variera dessa dimensioner beroende på vävnads- och celltypen av intresse.
- Förvara vävnadsblock i PBS vid 4 ° C.
4. Confocal avbildning
- Förbered en nukleär fläck lösning genom att späda DAPI i PBS vid 1: 4000.
- Inkubera vävnadsblock i DAPI nukleära bets under 5 min. Obs: DAPI färgning underlättar särskiljande enskilda celler genom deras kärnor, vilket är till hjälp för att korrelera de konfokala och SBEM bilder.
- Mount vävnadsblock på laddade objektglas, tillsätt några droppar PBS, och täck dem med ett täckglas.
- Med hjälp av en konfokalmikroskop, identifierar blockets med intakt villi och PyyGFP celler av intresse och avbildas dem att få z-stackar optiska sektioner.
- Använd en 20X / 0.8 Zeiss Plan Apochromat mål att få z-stackar av 1 pm optiska sektioner.
- För z-stack, använda kanalerna för 405 nm (DAPI) för att bestämma förhållandet till andra celler, till 488 nm endogena GFP lokalisera cellen av intresse och differential interferens kontrast (DIC) för att bestämma platsen för cellen i förhållande till lumen.
- Använd bildupplösning på 1024 pixlar eller högre.
5. Bädda Blocks i agaros
- Bered 10 ml fixativ innehållande 4% paraformaldehyd och 2,5% glutaraldehyd i PBS.
- Avlägsna de vävnadsblock från glasskivan genom försiktig tillsats av PBS i kanterna på täckglas för att glida bort från glasskiva täckglas utan att skada vävnadsblock. Använd sedan en konst pensel för att överföra vävnadsblock från bilden till en 10,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 4% paraformaldehyd och 2,5% glutaraldehyd fixativ.
- Post-fix vävnadsblock O / N vid 4 ° C.
- Överför vävnadsblock till PBS. Sedan bädda block platta i 5% låg smältpunkt agaros genom sandwiching dem mellan två glasskivor.
Obs: Inbäddning blocken i ett tunt skikt av agaros eases bakre manipulering under färgning. - Skär agaros i en kvadrat och gör ett hack på den övre sidan. Anmärkning: Detta steg är nödvändigt för att bibehålla orienteringen i efterföljande steg.
- Förvara block i en 1,5 ml mikrocentrifugrör med PBS vid 4 ° C tills vidare bearbetning.
Serial Block-ansikte Svepelektronmikroskopi (SBEM)
I detta avsnitt, är vävnadsblocket beredda och avbildas med SBEM vid låg förstoring. Undersökningen bild av blocket ansiktet korreleras sedan med konfokala data för att identifiera den region som innehåller cellen av intresse. När regionenidentifieras, är vävnaden avbildas med en upplösning på 7 nm / pixel och skivor av 70 nm. Detta var tillräckligt för att lösa och urskilja stora täta kärn sekretoriska vesiklar från andra organeller. I enteroendocrine celler, denna typ av vesiklar varierar mellan 100 och 150 nm i diameter 13. Protokollet är som följer:
6. Färgning vävnadssnitt
- Ta bort vävnad från PBS och skölj tre gånger, 5 minuter vardera, i 0,1 M kakodylatbuffert.
- Fläcken block för ett h i 0,1% garvsyra upplöstes i 0,1 M kakodylatbuffert att förbättra kontrasten av cellmembran 14.
- Genomför efterföljande färgning och uttorkning av vävnad enligt den publicerade protokollet 11. Efter Deerinck et al., protokoll, framställa dessa lösningar: 1) 1% (vikt / volym) thiocarbonhydrazide (THC); 2) leda aspartat lösning; 3) 1% uranylacetat och 4) osmium tetraoxyde / kaliumferrocyanid (OSO4 / K Ferrocyanid). Blanda 4% OSO4 och 2xK Ferrocyanid lager [0,3 g K Ferrocyanid och 0,86 g Na kakodylat i 10 ml H2O] vid förhållandet 1: 1 för att göra OSO4 / K Ferrocyanid. Notera: Att ha vävnad inbäddad i agaros underlättar hantering under färgning. Försiktigt bort agaros för efterföljande harts infiltration.
- Skölj prover tre gånger, 5 min vardera, i 0,1 M kakodylatbuffert och därefter färgas med OSO4 / K Ferrocyanid, lösning 2 h vid 4 ° C.
- Skölj i ultrarent vatten tre gånger, 5 minuter vardera, och fläcken med TCH för 30 min vid 60 ° C.
- Skölj i ultrarent vatten tre gånger, 5 min vardera och fläck med 2% OSO4 (ingen K Ferrocyanid) under 60 min vid RT. Skölj igen i ultrarent vatten tre gånger, 5 min vardera.
- Stain med 1% uranylacetat O / N vid 4 ° C. Skölj i ultrarent vatten tre gånger, 5 min vardera.
- Fläcken med bly aspartat för 30 min vid 60 ° C. Skölj i ultrarent vatten tre gånger, 5 min vardera.
- Torka vävnader genom sköljning i Solutions med ökande koncentrationer av etanol. Skölj två gånger, 5 min vardera, med 50%, 75%, 85%, 95% och absolut 100% etanol. Vid slutet, skölj sektionerna med propylenoxid två gånger, 10 min vardera.
7. infiltrera och inbäddning vävnadssnitt i Resin
- Infiltrera block med harts med användning av den kommersiellt avaialble satsen. Bädda vävnader i harts med användning av en EPON inbäddning sats. Förbered en harts blandning av 48% epoxi, 20% ml DDSA, 30% ml NMA, och 2% DMP30. Agitera hartsblandningen kraftigt i 5 minuter och sedan placera blandningen i vakuum under 30 min för att tillåta bubblor att komma till ytan.
- Blanda harts med propylenoxid vid förhållandet 1: 1 och skaka kraftigt. Ta bort den sista uttorkning sköljningen från vävnader och lägga harts blandat med propylenoxid. Placera injektionsflaska med prover i en rotator O / N och lämnar flaskan oskyddad. Nästa dag, tillsätt nybakade EPON-harts och blanda under 90 min i rotator.
- Bädda in block i harts så platt som möjligt genom sandwiching dem imellan glasskivor som har härdats med släppmedel vätska för att hindra dem från att fastna vid varandra 15.
- När blocken är inbäddade platta, bota blocken ett tillägg 48 h vid 60 ° C.
- Dra glider isär för att frigöra blocken.
8. Montering och Trimning Tissue Block för Imaging
- Enligt en dissekera omfattning, matchar orienteringen av vävnadsblock inbäddade i harts med att de konfokala mikrofotografier för att underlätta identifiering av de regioner som innehåller cellerna av intresse innan trimning blocket.
- Trimma hartset inbäddade blocket manuellt ner till en ~ 500 x 500 um block ansikte.
- Montera blocket platt på en tapp innehållande ledande epoxy och torka under 30 minuter. Därefter lägger blocket platt på en yta och torr O / N vid 60 ° C.
- Täck blocket med kolloidalt silver vätska. Behåll vävnadssnitt platt för att säkerställa skivning av blocket i rät vinkel för att underlätta samarbetetrrelating serieblock ansikte och konfokala mikrofotografier.
9. SBEM
- (3View t .ex.,). Image blocket med hjälp av ett svepelektronmikroskop utrustad med en SBEM systemet
- Ställ initial tjocklek sektion vid ~ steg 2 um och skars till dess ansiktet av vävnaden kommer ut ur blocket.
- Skaffa en surver bild av hela blocket ansiktet.
- Använda Fiji programvara, ta mätningar av både serieblock ansikte och konfokala mikrofotografier för att skapa en gemensam nämnare och redogöra för prov snett fixering och färgning 16.
- Leta reda på intresseområde på blocket ansiktet genom att multiplicera nämnaren till koordinaterna i konfokala bilder. Använd även andra strukturella egenskaper, som läget för mikrovilli, gobletceller eller lamina propria, som referens.
- Bild regionen av intresse vid en 2,25 kV och 7 nm / pixel (eller 15,147X förstoring) i högvakuum läge. Inkrement slice bör fastställasvid 70 nm eller mindre.
- Samla SBEM data i rå 16-bitars .dm3 format.
10. Optimera SBEM bilder för Surface Segmente
- Konvertera SBEM bilder rå .dm3 format till 8-bitars .tiff.
- Filter .tiff bilder med hjälp av en 0,8 gaussian oskärpefilter i Fiji.
- Skala ner datamängden till 25% av den ursprungliga storlek och spara den som en .tiff stack för att minimera mängden RAM-minne som krävs för att hantera apparaten.
- Rikta bunten SBEM bilder med Fiji plugin "linjär stack anpassning sålla" i översättning läge och beskärs med hjälp av "grödan 3D" plugin. Obs: beskärning hjälper till att ytterligare minskat mängden RAM-minne som krävs för att segmentera och volymrendering.
Data Rendering i 3D
11. konfokalmikroskopi
- Rekonstruera z-stackar med den automatiska överträffa läget för "ytor" verktyg. Figur 1D visar en reconstruction för varje kanal med hjälp av släta alternativet, ytorna området detalj på 0,126 pm, och tröskel som absolut intensitet.
12. serieblock ansikte SEM
Obs: Manuell uppgifter segmentering är en mycket tidskrävande procedur och beroende på vilka funktioner som skall göras förfarandet kan ta flera veckor. Segmentering för videor och siffror som presenteras i Bohórquez et al. 2014 8 gjordes manuellt och tog ungefär 500 timmar på arbetskraft. Det rekommenderas att prioritera de viktiga funktioner som behöver rendering innan segmenteringsprocessen. Tillvägagångssättet är följande:
- Använd "ytor" verktyg i dragläge och "konturen" alternativet ritläget 50 msek till segment manuellt och volym återges cellen av intresse.
- Trace konturerna på varje del av cellen för smidigare rendering eller var 5 skivor för snabbare rendering.
- Export slutlig imåldrar använder "ögonblicksbild" verktyg med en upplösning på 300 dpi eller mer.
Representative Results
Den metod som presenteras här användes för att studera ultrastrukturen av en specifik cell i ett skikt av epitel. Cellen av intresse i detta fall är den svårfångade enteroendocrine cellen. Deras identifiering på plats har varit möjligt bara under de senaste åren med utveckling av cellspecifika fluorescens reporter möss. Under 2011 utvecklade vi en mus i vilken promotorn av hormonet PYY driver uttrycket av grönt fluorescerande protein 17. I detta PyyGFP mus, är enteroendocrine celler av den distala delen av tunntarmen och tjocktarmen lätt särskiljas under UV-ljus. Denna musmodell var en stiftelse för att identifiera ett vävnadsblock som innehåller en enteroendocrine cell och bearbeta det för SBEM. Korrelationen metoden kallas här som cocem3D och byggdes på tidigare publicerade protokoll 10,11.
Optimera dimensionerna hos vävnadsblock är kritisk för korrelationen. I preliminära experiment,det bestämdes att i ett vävnadsblock 300 fim lång x 50 ^ m tjockt antalet SBEM bilder reduceras till ett minimum samtidigt som det täcker hela kroppen av cellen av intresse. Figur 1A visar en vetter av dissektion med användning av ett vibrerande blad microtrome till erhålla vävnadsblock med rätt dimensioner. Minst 100 block erhålls innan sortera dem att plocka dem med intakta celler av intresse. Valda block är avbildade genom konfokal mikroskopi och bild z-stackar är optiskt åtskilda varje 1 ^ m (Figur 1B och C). Figur 1D visar en volym återges vy av en enteroendocrine cell i ileum från musen. Dess framträdande neuropod sträcker sig under epitelceller för ~ 60 pm.
Cellen av intresse hittas genom att korrelera de konfokala z-stackar med en SBEM bild av hela blocket ansiktet. Ett exempel presenteras här av ett block från den distala kolon av en PyyGFPmus. Efter erhållande av konfokala z-stackar (figur 2A) är blocket inbäddad i ett tunt skikt av lågsmältande agaros (Figur 2B). Detta är nödvändigt för efterföljande manipulering av blocket. Det är viktigt att bibehålla orienteringen av blocket så platt som möjligt att matcha de optiska skivor med SBEM skivor. I figur 2C, är en representativ bild visas av hela ytan av vävnadsblock. Delar av denna siffra har tidigare publicerats i Bohorquez et al., 2014 8. Detta senare korrelerad med den konfokala bilden genom att ta in landmärken konto vävnad och dimensioner. Figur 2D visar en överlagring av konfokala och SBEM bild av blocket, avslöjar exakta placeringen av vår cell av intresse.
När cellen har identifierats, är SBEM avbildning sker med en upplösning tillräckligt hög för att identifiera sekretoriska vesiklar och andra cellorganeller. Datauppsättningen presenterade hanre avbildades vid 7 nm per pixel som bilder av blocket togs varje 70 nm. De uppgifter som innehöll 643 bilder som spänner över 45 um av vävnadsdjupet. Några mikron rakas under inledande avbildning av hela blocket ytan vid låg förstoring. Rå SBEM datauppsättning förvärvades .dm3 format och omvandlas till .tiff för efterföljande hantering. Den SBEM stack klipptes med hjälp av Fiji programvara plugin "gröda (3D)" block att innehålla endast regionen av intresse. Detta minskar mängden RAM-minne som behövs för volymrendering. Cellen identifierades genom sin position och sekretoriska vesiklar, och segmente använder Imaris programvara. Figur 3 innehåller en rendering i 3D av enteroendocrine cellen.
Figur 1:. Korrelat konfokalmikroskopi (A) arbetsflöde för att dissekera en bit avtarmvävnad i en vävnad blocket 300 x 50 ^ m tjockt. (B) En representativ vävnad block av rätt dimensioner. Notera att ett vävnadsblock av dessa dimensioner från musen tunntarm spänner ca 3 villi eller, i fallet med kolon ca 8 kryptor. (C) En villus i tunntarmen som innehåller en cell av intresse. (D) En konfokala z-stack som framförs i 3D med hjälp Imaris programvara visar en enteroendocrine cell med en framstående neuropod kör under tarmepitelet. Blå = DAPI nukleära bets. Barer = 10 mikrometer. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Serieblock ansikte svepelektronmikroskop (A) Confocal bild av en sele.cted vävnadsblock från kolon innehåller PyyGFP enteroendocrine celler (grön) av intresse. (B) När blocket avbildas av konfokalmikroskopi, är det då inbäddad lägenhet i lågsmältande agaros med hjälp av objektglas. Bädda vävnaden blocket i agaros underlättar efterföljande manipulation, och skåran på vänstra hörnet hjälper till att montera blocket inom SBEM i rätt riktning. (C) SBEM bild av ansiktet av blocket. (D) Korrelation av konfokala data med SBEM att identifiera cell av intresse (vit pil). Bilder i c och d i denna siffra ändras från Bohorquez et al., 2014 8. Blå = DAPI nukleära bets. Barer = 10 mikrometer. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Uppgifter gör i 3D (A) Volym rendering av enteroendocrine cellen med hjälp av Imaris programvara. Cellen innehåller en neuropod packad med sekretoriska vesiklar. För en fullständig beskrivning av ultra av en enteroendocrine cell hänvisas till Bohórquez et al., 2014 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Gastrointestinal chemosensation framstår som ett spännande nytt område inom biomedicinsk forskning. Detta är till stor del på grund av upptäckten av funktionella smakreceptorer i enteroendocrine celler 18. Efterföljande studier har visat att enteroendocrine celler uttrycker specifika receptorer för näringsämnen, inklusive kolhydrater, lipider och aminosyror 5,6,19,20. Den katalytiska faktorn för dessa upptäckter har varit utvecklingen av reporter möss, i vilka enteroendocrine celler är fluorescensmärkt 20. Vi utvecklade ett av dessa möss, den PyyGFP musen, för att studera enteroendocrine cellerna i distala tunntarmen och tjocktarmen 17,21. Dessa celler är av intresse eftersom de utsöndrar PYY och glukagon-liknande peptid 1, som båda är inducerar mättnad 22,23. Vid den tiden, en komplett ultra-strukturell hänsyn till dessa celler saknades, som vi trodde var viktigt att förstå deras signaleringsmekanismer.
INNEHÅLL "> Här har vi beskrivit en visuellt en metod för att överbrygga konfokalmikroskopi med SBEM. Metoden kallat Cocem3D, som tillät oss att dokumentera hela ultra av enteroendocrine celler. Vi har rapporterat att dessa celler har en neuropod som innehåller tre fjärdedelar av alla de sekretoriska vesiklar 8. Inom neuropod finns neurofilament och likt neuronala axoner, är neuropods näring av enter gliaceller 8. Ännu viktigare, är det dock dessa neuropods som enteroendocrine celler ansluta fysiskt till nervceller innervating tarmen och kolon 9.En av styrkorna med cocem3D är dess enkelhet. Att minska vävnadsprovet i ett block som kan avbildas genom konfokal och SBEM underlättar identifieringen av en specifik cell i en vävnad. Sekretoriska blåsor och andra organeller kan identifieras med lätthet med en upplösning på 7 nm / pixel. Eftersom avsnitten i SBEM kasseras, ytterligare processjunga av vävnader för att identifiera specifika proteiner är inte ett alternativ på denna punkt. Men utvecklingen av metoder såsom ATUM 24, i vilka sektioner från vävnadsblocket bevaras, kommer sannolikt att möjliggöra identifiering av specifika proteiner i cellen. Att bestämma den särskilda platsen för chemosensory receptorer på enteroendocrine celler är väsentlig information för utvecklingen av läkemedelsterapier för fetma, eftersom enteroendocrine celler är en sensorisk gränssnitt mellan mat i tarmen och mättnad i hjärnan.
Disclosures
Dr Satish Medicetty är anställd och får 100% lön från Renovo Neural Inc; men detta inte ändrar författarens anslutning till Jove politik för att dela data och material. Ingen intressekonflikt deklareras för kvarvarande författare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life technologies | 10010023 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4%, freshly made in PBS, final pH 7.4 |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882 | |
| Dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Low-melting agarose | Life technologies | 16520-100 | 5%, freshly made in PBS |
| Standard Tissue-Tek Cryomold | Electron Microscopy Sciences | 62534-25 | |
| DAPI nuclear stain | Life technologies | D1306 | |
| Postively charged glass slides and coverslips | |||
| Fine art paintbrush #1 | |||
| Cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 11650 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21700 | |
| EMbed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Liquid releasing agent | Electron Microscopy Sciences | 70880 | |
| Liquid silver colloidal | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
| CircuitWorks conductive epoxy | ITW Chemtronics | CW2400 | |
| Variable flow peristaltic pump | VWR | 70730-064 | |
| VT1200S Vibrating blade microtome | Leica | ||
| Zeiss 780i confocal microscope | Carl Zeiss | ||
| Sigma VP Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss | ||
| 3view system | Gatan | ||
| Renovo Neural Inc (Cleveland, OH) | http://www.renovoneural.com | Renovo provides 3d EM services | |
| Fiji software | Open access software | ||
| Computer station with 16 GB of RAM or more | |||
| Data visualization software Imaris 7.5 | Bitplane |
References
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).
- Smith, C. L., et al. Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens. Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS biology. 2, e329 (2004).
- Engelstoft, M. S., et al. Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells. Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).
- Chandra, R., et al. Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion. The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).
- Wang, Y., et al. Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).
- Bohórquez, D. V., et al. An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy. PloS one. 9, e89881 (2014).
- Bohórquez, D. V., et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. The Journal of clinical investigation. , (2015).
- Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).
- Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California. San Diego San Diego, CA. (2010).
- Bohórquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).
- Nilsson, O., et al. Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon. Endocrinology. 129, 139-148 (1991).
- Mizuhira, V., Futaesaku, Y. New fixation method for biological membranes using tannic acids. Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).
- Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy. Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
- Bohórquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).
- Jang, H. J., et al. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).
- Liou, A. P., et al. The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin. Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).
- Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).
- Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets. Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).
- Batterham, R. L., et al. Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake. Nature. 418, 650-654 (2002).
- Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans. The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).
