Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Korrelative Confocal og 3D Electron Microscopy af et specifikt Sensory Cell

doi: 10.3791/52918 Published: July 19, 2015

Abstract

Afgrænsning af en celles ultrastruktur er vigtigt for at forstå dens funktion. Dette kan være en skræmmende projekt for sjældne celletyper diffunderede gennem væv fremstillet af forskellige celletyper, såsom enteroendocrine celler af det intestinale epitel. Disse gastrointestinale sensorer af mad og bakterier har været vanskeligt at studere, fordi de er spredt blandt andre epitelceller i et forhold på 1: 1.000. For nylig er transgene reporter mus blevet genereret til at identificere enteroendocrine celler ved hjælp af fluorescens. Et af disse er det peptid YY-GFP mus. Brug af denne mus, vi udviklet en metode til at korrelere konfokal og seriebloknummer-face scanning elektronmikroskopi. Vi kaldte metoden cocem3D og anvendt den til at identificere en bestemt enteroendokrine celle i væv og afsløre cellens ultrastruktur i 3D. Opløsningen på cocem3D er tilstrækkelig til at identificere organeller så lille som sekretoriske vesikler og til at skelne cellemembraner for volumen rendering. Cocem3D kan let tilpasses til at studere 3D ultrastruktur andre specifikke celletyper i deres native væv.

Introduction

Livet inde i en celle foregår i tid og rum. Ændringer over tid er ofte studeres ved hjælp af time-lapse mikroskopi kombineret med fluorescens imaging teknikker, ligesom super opløsning mikroskopi. Plads, især arrangementet af organeller inde i en celle eller celle-til-celle-interaktioner, kan kun udledes ved en fuldstændig redegørelse for cellens fine struktur. En omfattende hensyn til en celles fin struktur kan også bringe klarhed til genomisk funktion i tilfælde, hvor genomet er tilgængelig, ligesom C. elegans nematode 1 eller den flade placozoa tricoplax adherens 2. Seriel sektionering elektronmikroskopi er nu en reproducerbar, tid effektiv og mindre bekostelig opgave takket være udviklingen af automatiserede 3D ​​elektron mikroskopi teknologier, som seriebloknummer-face scanning elektronmikroskopi 3 (SBEM).

Behovet for strukturel information til at belyse funktionen er meget tydeligt i visse cell typer hvor funktion afhænger af fysiske celle-til-celle-interaktioner, såsom neuroner, glia eller sensoriske epithelceller. Vi er især interesserede i at belyse, hvorledes sensoriske signaler fra næringsstoffer i lumen af ​​tarmen transduceres til et elektrisk signal, der i sidste ende modulerer appetitforstyrrelser adfærd. Kredsløbet er kompliceret, men begynder ved væggen af ​​tarmen, hvor næringsstoffer kommer i kontakt med sensoriske epithelceller, kaldet enteroendocrine celler. I modsætning til andre sensoriske epithelceller, såsom smag celler, enteroendocrine celler spredt i hele tarmen epitel i et forhold på 1 til 1000 4-7. Derfor har de været vanskeligt at identificere og studere, og i lang tid, de blev betragtet kun som en kilde til gut hormoner. Men med udviklingen af ​​celle-specifik fluorescens reporter mus, er den komplekse sensoriske funktion af disse celler opstå. Ved hjælp af en af ​​disse reporter mus, et peptid YY-GFP (PyyGFP) mus, fandt vi, at enteroendocrIne celler har en fremtrædende cytoplasmatiske hale, som vi navngivet neuropod. Fremkomsten af ​​neuropods foreslog et konserveret funktion i celle-til-celle kommunikation. Således har vi ræsonnerede, at ved at dokumentere ultrastruktur en enteroendokrin celle, kunne funktionen af ​​neuropods afledes.

Behovet for at forstå strukturen af ​​et vedhæng på en spredt celle, som er vanskeligt at identificere var den vigtigste rationale for at udvikle en metode til at kombinere konfokal mikroskopi og SBEM. Cellen af ​​interesse blev identificeret ved anvendelse PyyGFP enteroendokrine cellespecifikke reporter mus. Metoden gav os mulighed for at dokumentere hele ultrastruktur en enteroendokrine celle og dens neuropod. Inden neuropods fandt vi strukturelle træk af neuronale axoner, og uden neuropods, fandt vi en fysisk forhold til enterisk glia 8. Faktisk neuropods indeholder ca. 70% af alle sekretoriske vesikler tyder på en væsentlig rolle i den sekretoriske funktion af disse celler. Med udgangspunkt i denstrukturelle data, mere for nylig fandt vi, at gennem disse neuropods, enteroendocrine celler og neuroner innerverer tarmen danner en neuroepitel kredsløb, svarende til den i smag celler i tungen 8,9.

Afdækning af sådanne funktioner i gastrointestinale chemosensory mekanismer stammede fra strukturelle data indsamlet ved hjælp af denne korrelative mikroskopi metode. Vi mener, at denne metode kan være nyttig på andre områder af cellebiologi, navnlig når cellerne er dispergeret inden vævene på et meget lavt forhold. Vi henviser til de metoder som korrelative konfokal og seriebloknummer face scanning elektronmikroskopi i 3D (Cocem3D). Metoden består af følgende hovedtrin: væv dissektion, konfokal mikroskopi, SBEM billedbehandling, SBEM og konfokal billede korrelation, og manuel segmentering. Sammenlignet med andre korrelative metoder, konceptet er ret simpelt, fordi sammenhængen er fysiske snarere end kemiske.

Protocol

Alle dyr pleje og eksperimenter blev udført i overensstemmelse med en protokol godkendt af Duke University Institutional Animal Care og brug Udvalg.

Cocem3D stammede fra en kombination af tidligere offentliggjorte protokoller 10,11 og blev anvendt her for at studere et bestemt enteroendokrine celle ved hjælp af en PyyGFP reporter mus 12. Denne metode kan let anvendes på andre celler af interesse ved anvendelse af kommercielt tilgængelige transgene reporter mus. Metoden er beskrevet i tre afsnit: korrelative konfokal mikroskopi, seriebloknummer-face scanning elektronmikroskopi (SBEM), og data gengivelse i 3D.

Korrelative Konfokal mikroskopi

Formålet med dette afsnit er at høste et væv segment fra den distale colon af dimensioner, der tillader korrelativ konfokal og SBEM billeddannelse. Protokollen er som følger:

1. Høst af Tissue

  1. Forbered10 ml 50 ug / ml heparin-opløsning i PBS.
  2. Forbered xylazin / ketamin anæstesi lager ved at blande 10 ml ketamin (100 mg / ml) og 1 ml xylazin (20 mg / ml).
    1. Fortynd xylazin / ketamin lager 1: 4 i 0,1 M PBS.
  3. Forbered en 100 ml fikseringsopløsning indeholdende 4% paraformaldehyd og 0,1% glutaraldehyd i PBS.
  4. Bedøver en PyyGFP mus, 6 til 10 uger gammelt, med en dødelig dosis af xylazin / ketamin bedøvelse. Injicere bedøvelsesmiddel intraperitonealt på 0,15 ml pr 20 g mus vægt.
  5. Bekræft ordentlig mus bedøvelse ved at knibe halen eller tæer, og bruge salve på øjnene for at forhindre tørhed.
  6. Bruge en variabel flow peristaltisk pumpe til at perfundere fiksativ intracardialt 10. Anvendelse af kirurgiske sakse (13 cm længde) skåret åbne bughulen for at blotlægge tarmene, hjerte og lunger. Hold hjerte med smal-mønster buede pincet (12 cm længde), og indsæt butterfly kanyle (19 G) fra peristaltisk pumpe into venstre ventrikel. Straks, klippe højre atrium med foråret lige saks (længde 4 mm). Perfundere med en hastighed på 2 ml / min først med heparin-opløsning i 1 minut, og derefter med iskold fikseringsopløsning i 15 minutter, indtil mus hale er helt stiv.
    Bemærk: Det er meget vigtigt at perfundere ved en langsom hastighed for at forhindre sprængning af små fartøjer i tarmslimhinden. Sprængfyldt af skibe vil kompromittere vævets ultrastruktur. Hvis perfusion er tilstrækkelig, bør leveren vende blege i farven inden 3-5 min.
  7. Brug af en lille saks åbne bughulen og udskære hele tyktarmen fra krydset med coecum til den distale endetarmen. Placer væv i iskold PBS. Mens nedsænket i PBS, skåret op med små spring saks tyktarmen langs mesenteriet.

2. dissekere og Fastsættelse vævssegmenter

  1. Ved hjælp af en skalpel, skæres omkring 6 små væv segmenter (2 mm 2) fra den distale colon. Gør dette på et ark of dental voks og neddykket i nogle få dråber PBS.
  2. Post-fastsætte vævssegmenter i fikseringsopløsning i 3 timer ved 4 ° C.

3. Micro-dissekere væv Blocks

  1. Forbered 5% lavtsmeltende agarose i PBS og holde det i et vandbad ved 45 ° C.
  2. Integrere vævssegmenter i 5% lavtsmeltende agarose med en lille plastikbeholder, ligesom standard størrelse Tissue-Tek kryoformen.
  3. Monter indlejrede sektioner på en vibrerende klinge mikrotom og fylde bufferen bakke med iskold PBS.
  4. Sender 300 um vævsstrimler ved 0,8 amplitude og 0,04 mm / sek hastighed. Bemærk: På dette tidspunkt vil de vævsstrimler løsnes fra agarosen.
  5. Re-indlejre 300 um væv strimler i agarose og montere dem på mikrotom vinkelret på vibratome klinge.
  6. Ved hjælp af en vibratom, skåret vævsstrimler ved en tykkelse på 50 um. Bemærk: De endelige vævsblokke bør være omkring 300 um bred x 50 um tyk. Disse dimensions er optimeret fra pilot konfokale eksperimenter, som viste, at tykkelsen af ​​enteroendokrine celle er mellem 15-20 um og neuropod længde 30-70 nm. Derfor kunne en hel celle være indeholdt i en blok af væv 300 um bred med 50 um tyk, hvis cellen orientering er parallel med den flade af vævsblokken. Varierer disse dimensioner afhængigt af vævet og celletypen af ​​interesse.
  7. Opbevar vævsblokke i PBS ved 4 ° C.

4. Konfokal Imaging

  1. Forbered en nuklear løsning plet ved at fortynde DAPI i PBS ved 1: 4.000.
  2. Inkuber vævsblokke i DAPI nuklear farvning i 5 min. Bemærk: DAPI farvning letter karakteristiske individuelle celler ved deres kerner, hvilket er nyttigt for korrelere konfokal og SBEM billeder.
  3. Mount væv blokke på ladet glasplade, tilsæt et par dråber PBS, og dække dem med et dækglas.
  4. Ved anvendelse af et konfokalt mikroskop, identificere bloks med intakt villi og PyyGFP celler af interesse og filmede dem at få z-stakke optisk sektioner.
    1. Brug en 20X / 0.8 Zeiss Plan Apochromat målsætning at opnå z-stakke af 1 um optiske sektioner.
    2. For z-stak, bruge kanalerne til 405 nm (DAPI) at bestemme forholdet til andre celler, til 488 nm endogen GFP lokalisere cellen af ​​interesse, og kontrast differential interferens (DIC) for at bestemme placeringen af ​​cellen i forhold til den lumen.
    3. Brug billedopløsning på 1.024 pixels eller højere.

5. indlejring Blocks i Agarose

  1. Forbered 10 ml fixativ indeholdende 4% paraformaldehyd og 2,5% glutaraldehyd i PBS.
  2. Fjern vævsblokke fra objektglasset ved forsigtigt at tilsætte PBS i kanterne af dækglasset at glide dækglasset væk fra objektglasset uden at beskadige vævet blok. Brug derefter en kunst pensel til at overføre vævet blok fra dias til en 1.5 Ml mikrocentrifugerør indeholdende 4% paraformaldehyd og 2,5% glutaraldehyd fiksativ.
  3. Post-fix væv blokke O / N ved 4 ° C.
  4. Overførsel vævsblokke til PBS. Derefter indlejre blokke flade i 5% lavtsmeltende agarose ved indlægning dem mellem to glasplader.
    Bemærk: Integrering blokkene i et tyndt lag af agarose letter posterior manipulation under farvning.
  5. Skær agarose i en firkant og lave en kærv på den øverste side. Bemærk: Dette trin er nødvendigt for at opretholde orienteringen i efterfølgende trin.
  6. Store blokke i et 1,5 ml mikrocentrifugerør med PBS ved 4 ° C indtil yderligere forarbejdning.

Serial Block-face scanningselektronmikroskopi (SBEM)

I dette afsnit er vævet blok forberedt og afbildet med SBEM ved lav-forstørrelse. Undersøgelsen billede af blokken ansigt er derefter korreleret med det konfokale data til at identificere den region, der indeholder cellen af ​​interesse. Når regionenidentificeres, vævet afbildet ved en opløsning på 7 nm / pixel og skiver af 70 nm. Dette var tilstrækkeligt til at løse og skelne store-tætte kerne sekretoriske vesikler fra andre organeller. I enteroendocrine celler, denne type af vesikler varierer mellem 100 og 150 nm i diameter 13. Protokollen er som følger:

6. Farvning vævssnit

  1. Fjerne væv fra PBS og skyl tre gange, 5 minutter hver, i 0,1 M cacodylatbuffer.
  2. Farv blokke i 1 time i 0,1% garvesyre opløst i 0,1 M cacodylatbuffer at forbedre kontrasten af cellemembraner 14.
  3. Udfør efterfølgende farvning og dehydrering af væv i overensstemmelse med den offentliggjorte protokol 11. Efter Deerinck et al. protokol, forberede disse løsninger: 1) 1% (vægt / volumen) thiocarbonhydrazide (THC); 2) føre aspartat løsning; 3) 1% uranylacetat, og 4) osmium tetraoxyde / kaliumferrocyanid (OsO4 / K ferrocyanid). Bland 4% Oso 4 og 2xK ferrocyanid stock [0,3 g K ferrocyanid og 0,86 g Na cacodylat i 10 ml H2O] ved 1: 1-forhold for at gøre OsO4 / K ferrocyanid. Bemærk: At have vævet indlejret i agarose letter håndtering under farvning. Fjern forsigtigt agarose til efterfølgende harpiks infiltration.
  4. Skyl prøver tre gange, 5 minutter hver, i 0,1 M cacodylatbuffer og derefter farves med OSO4 / K ferrocyanid opløsning i 2 timer ved 4 ° C.
  5. Skylles i ultrarent vand tre gange, 5 minutter hver, og pletten med TCH i 30 minutter ved 60 ° C.
  6. Skyl i ultrarent vand tre gange, 5 minutter hver og pletten med 2% OsO4 (ingen K ferrocyanid) i 60 minutter ved stuetemperatur. Skylles igen i ultrarent vand tre gange, 5 minutter hver.
  7. Pletten med 1% uranylacetat O / N ved 4 ° C. Skyl i ultrarent vand tre gange, 5 minutter hver.
  8. Pletten med bly aspartat i 30 minutter ved 60 ° C. Skyl i ultrarent vand tre gange, 5 minutter hver.
  9. Dehydrere væv ved rensning i opklaringns med stigende koncentrationer af ethanol. Skyl 2 gange, 5 minutter hver, med 50%, 75%, 85%, 95% og 100% absolut ethanol. I slutningen, skylles sektioner med propylenoxid to gange, 10 min hver.

7. infiltrere og forankring vævssnit i Resin

  1. Infiltrere blokkene med harpiks ved anvendelse af kommercielt avaialble kit. Indkapsle væv i harpiks under anvendelse af et EPON indlejring kit. Forbered en harpiks blanding af 48% Epoxy, 20% ml DDSA, 30% ml NMA, og 2% DMP30. Omrøre harpiksblanding kraftigt i 5 minutter og derefter placere mix i vakuum i 30 minutter for at tillade bobler at komme op til overfladen.
  2. Bland harpiks med propylenoxid ved 1: 1-forhold og rystes kraftigt. Fjern den endelige dehydrering skylning fra væv og tilføje harpiks blandet med propylenoxid. Placer hætteglasset med prøver i en rotator O / N og efterlade hætteglas reducerede. Den næste dag, tilsættes frisk gjort EPON harpiks og blandes i 90 minutter i rotator.
  3. Indlejre blokke i harpiks som flade som muligt ved sandwiching dem imellem objektglas, der er blevet helbredt med flydende slipmiddel for at forhindre dem i at klæbe til hinanden 15.
  4. Når blokkene er indlejret flad, helbrede blokkene i yderligere 48 timer ved 60 ° C.
  5. Træk glider fra hinanden for at frigive blokke.

8. Montering og Trimning af Tissue Bloker for Imaging

  1. Under en dissekering omfang, matcher orienteringen af ​​vævsblokke indlejret i harpiks med at de konfokale micrographs at lette at identificere de områder, der indeholder cellerne af interesse før trimning blokken.
  2. Trim harpiksen indlejrede blok manuelt ned til en ~ 500 x 500 um block-ansigt.
  3. Monter blok fladt på en tap, der indeholder ledende epoxy og tørre i 30 min. Derefter lå blokken fladt på en overflade og tør O / N ved 60 ° C.
  4. Coat blokken med kolloid sølv væske. Opretholde vævssnit flade for at sikre udskæring af blokken i en ret vinkel for at lette correlating den serielle blok-ansigt og konfokale mikrografer.

9. SBEM

  1. Billede blokken ved hjælp af en Scanning Elektron Mikroskop udstyret med et SBEM-system (f .eks., 3View).
  2. Sæt indledende afsnit tykkelse ved ~ 2 um trin og skære indtil ansigtet af væv kommer ud af blokken.
  3. Erhverve en surver billede af hele blokken ansigtet.
  4. Ved hjælp af Fiji-software, tage målinger af både den serielle blok-ansigt og konfokale mikrografier at generere en fællesnævner og redegøre for prøve vridning under fiksering og farvning 16.
  5. Find interesseområdet på blokken ansigt ved at gange nævneren til koordinaterne i konfokale billeder. Brug også andre strukturelle træk, ligesom placeringen af ​​microvilli, slimceller eller lamina propria, som reference.
  6. Billede region af interesse på en 2,25 kV og 7 nm / pixel (eller 15,147X forstørrelse) i højvakuum-tilstand. Intervaller Skær bør fastsættesved 70 nm eller mindre.
  7. Saml SBEM data i rå 16-bit .dm3 format.

10. Optimering SBEM Billeder til Surface Segmentering

  1. Konverter SBEM billeder fra rå .dm3 format til 8-bit .tiff.
  2. Filter .tiff billeder ved hjælp af en 0,8 Gaussisk sløring filter i Fiji.
  3. Nedtrappe datasættet til 25% af den oprindelige størrelse og gemme det som en .tiff stak for at minimere mængden af ​​RAM-hukommelse er nødvendige for at håndtere sættet.
  4. Juster stakken af ​​SBEM billeder ved hjælp af Fiji plugin "lineær stak tilpasning til SIFT" i oversættelse mode og beskåret ved hjælp af "crop 3D" plugin. Bemærk: Beskæring er med til yderligere reduceret mængden af ​​RAM-hukommelse er nødvendig for at segmentere og volumen rendering.

Data Rendering i 3D

11. Konfokal mikroskopi

  1. Rekonstruere z-stakke ved hjælp af den automatiske overgå tilstand af "overflader" værktøj. Figur 1D, viser en recygning af hver kanal ved hjælp af den glatte option på, detaljen overflader område ved 0,126 um, og tærskelværdiansættelse som absolut intensitet.

12. Serial Block-face SEM

Bemærk: segmentering Manuel data er en meget tidskrævende procedure, og afhængigt af de funktioner, der skal gengives proceduren kan tage flere uger. Segmentering for videoer og tallene i Bohórquez et al 2014 8. Blev gjort manuelt, og tog omkring 500 timer af arbejdskraft. Det anbefales at prioritere de væsentlige funktioner, der kræver rendering, før du begynder segmentering processen. Proceduren er som følger:

  1. Brug "overflader" værktøj i draw tilstand og "kontur" option på tegning tilstand på 50 msek til segment manuelt og volumengengivet cellen af ​​interesse.
  2. Trace konturer på hver skive af cellen for jævnere gengivelse eller hver 5 skiver til hurtigere rendering.
  3. Eksport endelige imaldre ved hjælp af "snapshot" værktøj med en opløsning på 300 dpi eller mere.

Representative Results

Metoden præsenteres her blev anvendt til at undersøge ultrastrukturen af ​​en specifik celle i et lag af epithel. Cellen af ​​interesse i dette tilfælde er den undvigende enteroendokrine celle. Deres identifikation in situ har været muligt kun i de sidste par år med udviklingen af celle-specifikke fluorescens reporter mus. I 2011 udviklede vi en mus, hvori promotoren af hormonet PYY driver ekspressionen af grønt fluorescerende protein 17. I denne PyyGFP mus, er enteroendocrine celler af den distale del af tyndtarmen og colon let skelnes under UV-lys. Denne musemodel var et fundament til at identificere et væv blok indeholder et enteroendokrine celle og behandle den for SBEM. Korrelationen Metoden kaldes her som cocem3D og blev bygget på tidligere offentliggjorte protokoller 10,11.

Optimering dimensionerne af vævsblokken er kritisk for korrelation. I indledende eksperimenter,blev det bestemt, i et væv blok 300 um lang x 50 um tyk antallet af SBEM billeder er reduceret til et minimum, samtidig dækker hele kroppen af cellen af interesse. Figur 1A viser en overser af dissektion under anvendelse af en vibrerende kniv microtrome til opnå vævsblokken med de rigtige dimensioner. Mindst 100 blokke er fremstillet før sortering gennem dem at samle dem med intakte celler af interesse. Udvalgte blokke er afbildet ved konfokal mikroskopi og image z-stakke er optisk adskilt hver 1 um (figur 1B og C). Figur 1D viser et volumengengivet afbildning af en enteroendokrin celle i ileum af musen. Dens fremtrædende neuropod strækker nedenunder epitelceller til ~ 60 um.

Cellen af ​​interesse findes ved korrelere konfokale z-stakke med en SBEM billede af hele blokken ansigtet. Et eksempel præsenteres her af en blok fra den distale colon af en PyyGFPmus. Efter opnåelse konfokale z-stakke (figur 2A), er blokken indlejret i et tyndt lag af lavtsmeltende agarose (figur 2B). Dette er nødvendigt for efterfølgende manipulation af blokken. Det er vigtigt at fastholde orienteringen af ​​blokken så fladt som muligt at matche de optiske skiver med de SBEM skiver. I figur 2C er et repræsentativt billede vist af hele ansigtet af vævet blokken. Dele af dette tal er tidligere publiceret i Bohorquez et al., 2014 8. Dette blev efterfølgende korreleret med konfokale billede ved at tage hensyn vartegn og dimensioner væv. Figur 2D viser en overlejring af konfokal og SBEM billede af blokken, afslører præcise placering af vores celle af interesse.

Når cellen er blevet identificeret, er SBEM billeddannelse sker ved en opløsning høj nok til at identificere sekretoriske vesikler og andre celleorganeller. Datasættet præsenterede hanre blev afbildet ved 7 nm per pixel som billeder af blokken blev udtaget hver 70 nm. Datasættet indeholdt 643 billeder, der spænder 45 um af vævet dybde. Et par mikrometer barberes under indledende billeddannelse af hele blokken ansigt ved lav forstørrelse. Den rå SBEM datasæt blev erhvervet i .dm3 format og omdannet til .tiff til efterfølgende håndtering. Den SBEM stak blev beskåret ved hjælp af Fiji-software plugin "afgrøde (3D)" blok til kun indeholder regionen af ​​interesse. Dette reducerer mængden af ​​RAM-hukommelse er nødvendig for volumen rendering. Cellen blev identificeret ved sin position og sekretoriske vesikler, og segmenteret hjælp Imaris software. Figur 3 indeholder en gengivelse i 3D af enteroendokrine celle.

Figur 1

Figur 1:. Korrelative konfokal mikroskopi (A) Workflow at dissekere et stykketarmvæv i et væv blok 300 x 50 um tyk. (B) Et repræsentativt væv blok af de rigtige dimensioner. Bemærk, at et væv blok af disse dimensioner fra musen tyndtarmen spænder omkring 3 villi eller, i tilfælde af tyktarmen omkring 8 krypter. (C) En villus i tyndtarmen indeholdende en celle af interesse. (D) en konfokal z-stak gengives i 3D hjælp Imaris software viser en enteroendokrin celle med en fremtrædende neuropod henne under tarmepitelet. Blå = DAPI nuklear farvning. Bars = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Serial blok-face scanning elektronmikroskopi (A) Konfokal billede af en sele.CTED væv blok fra tyktarmen indeholder PyyGFP enteroendokrine celler (grøn) af interesse. (B) Når blokken afbildes ved konfokal mikroskopi, er det derefter indlejret fladt i lavtsmeltende agarose hjælp objektglas. Indlejring vævet blok i agarose letter efterfølgende manipulation, og hakket på venstre hjørne er med til at montere blokken i SBEM i den rigtige retning. (C) SBEM billede af ansigtet af blokken. (D) Korrelation af konfokale data med SBEM at identificere cellen af interesse (hvid pil). Billeder i c og d af dette tal er ændret fra Bohorquez et al., 2014 8. Blå = DAPI nukleare pletten. Bars = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Data rendering i 3D (A) Volumen gengivelse af enteroendokrine celle ved hjælp Imaris software. Cellen indeholder en neuropod pakket med sekretoriske vesikler. For en komplet beskrivelse af ultrastruktur en enteroendokrine celle, henvises til Bohórquez et al., 2014 8. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Gastrointestinal chemosensation fremstår som et spændende nyt område inden for biomedicinsk forskning. Dette er i stor del på grund af opdagelsen af funktionelle smagsreceptorer i enteroendocrine celler 18. Efterfølgende undersøgelser har vist, at enteroendocrine celler udtrykker specifikke receptorer for næringsstoffer, herunder kulhydrater, lipider og aminosyrer 5,6,19,20. Den katalytiske faktor for disse opdagelser har været udviklingen af reporter mus, hvori enteroendocrine celler er fluorescensmærket 20. Vi udviklede en af disse mus, den PyyGFP mus, at studere enteroendocrine celler af den distale tyndtarm og tyktarm 17,21. Disse celler er af interesse, fordi de udskiller PYY og glucagon-lignende peptid 1, som begge er inducere af mæthed 22,23. På det tidspunkt en fuldstændig ultra-strukturel hensyn til disse celler manglede, som vi mente var vigtigt at forstå deres signaling mekanismer.

Indholdsproduktion "> Her beskrev vi en visuelt en metode til at bygge bro konfokal mikroskopi med SBEM. Fremgangsmåden er nævnt som Cocem3D, hvilket tillod os at dokumentere den komplette ultrastruktur enteroendocrine celler. Vi har rapporteret, at disse celler har en neuropod der indeholder tre fjerdedele af alle de sekretoriske vesikler 8. Inden for neuropod, der neurofilamenter og meget gerne neuronale axoner er neuropods næres af enteriske gliaceller 8. Vigtigere er det dog disse neuropods der enteroendokrine celler forbinde fysisk til neuroner innerverer tarmen og colon 9.

En af styrkerne ved cocem3D er dets enkelhed. Reduktion af vævsprøven i en blok, der kan afbildes ved konfokal og SBEM letter identifikation af en specifik celle i et væv. Sekretoriske vesikler og andre organeller kan identificeres med lethed ved en opløsning på 7 nm / pixel. Fordi afsnittene i SBEM bortskaffes, yderligere processynge af væv til at identificere specifikke proteiner er ikke en mulighed på dette tidspunkt. Men udvikling af metoder såsom ATUM 24, i hvilke afsnit fra vævsblokken bevares, vil sandsynligvis muliggøre identifikation af specifikke proteiner i cellen,. Bestemmelse af specifikke placering af chemosensory receptorer på enteroendocrine celler er vigtig information for udviklingen af ​​lægemiddelterapier for fedme, fordi enteroendocrine celler er en sensorisk grænseflade mellem fødevarer i tarmen og mæthed i hjernen.

Disclosures

Dr. Satish Medicetty er ansat af og modtager 100% løn fra Renovo Neural Inc; Men dette ikke ændre forfatterens tilslutning til Jove politik om datadeling og materialer. Nogen interessekonflikt angives til de resterende forfattere.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline Life technologies 10010023
Heparin sodium salt Sigma H4784
Paraformaldehyde  Sigma 158127 4%, freshly made in PBS, final pH 7.4
Glutaraldehyde Sigma G5882
Dental wax Electron Microscopy Sciences 72660
Low-melting agarose Life technologies 16520-100 5%, freshly made in PBS
Standard Tissue-Tek Cryomold Electron Microscopy Sciences 62534-25
DAPI  nuclear stain Life technologies D1306
Postively charged glass slides and coverslips
Fine art paintbrush #1
Cacodylate buffer Electron Microscopy Sciences 11650
Tannic acid Electron Microscopy Sciences 21700
EMbed 812 kit  Electron Microscopy Sciences 14120
Liquid releasing agent  Electron Microscopy Sciences 70880
Liquid silver colloidal    Electron Microscopy Sciences 12630
CircuitWorks conductive epoxy   ITW Chemtronics CW2400
Variable flow peristaltic pump VWR 70730-064
VT1200S Vibrating blade microtome Leica
Zeiss 780i confocal microscope Carl Zeiss 
Sigma VP Scanning Electron Microscope  Carl Zeiss 
3view system Gatan
Renovo Neural Inc (Cleveland, OH) http://www.renovoneural.com Renovo provides 3d EM services
Fiji software Open access software
Computer station with 16 GB of RAM or more
Data visualization software Imaris 7.5  Bitplane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).
  2. Smith, C. L., et al. Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens. Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).
  3. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS biology. 2, e329 (2004).
  4. Engelstoft, M. S., et al. Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells. Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).
  5. Chandra, R., et al. Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion. The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).
  6. Wang, Y., et al. Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).
  7. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).
  8. Bohórquez, D. V., et al. An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy. PloS one. 9, e89881 (2014).
  9. Bohórquez, D. V., et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. The Journal of clinical investigation. (2015).
  10. Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).
  11. Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. University of California. San Diego San Diego, CA. (2010).
  12. Bohórquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).
  13. Nilsson, O., et al. Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon. Endocrinology. 129, 139-148 (1991).
  14. Mizuhira, V., Futaesaku, Y. New fixation method for biological membranes using tannic acids. Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).
  15. Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy. Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  17. Bohórquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).
  18. Jang, H. J., et al. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).
  19. Liou, A. P., et al. The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin. Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).
  20. Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).
  21. Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets. Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).
  22. Batterham, R. L., et al. Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake. Nature. 418, 650-654 (2002).
  23. Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans. The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).
  24. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).
Korrelative Confocal og 3D Electron Microscopy af et specifikt Sensory Cell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bohórquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J. Vis. Exp. (101), e52918, doi:10.3791/52918 (2015).More

Bohórquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J. Vis. Exp. (101), e52918, doi:10.3791/52918 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter