Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Korrelerende Confocal og 3D Elektronmikroskopi av en bestemt Sensory Cell

doi: 10.3791/52918 Published: July 19, 2015

Abstract

Avgrensing av en celles ultrastructure er viktig for å forstå dens funksjon. Dette kan være en skremmende prosjekt for sjeldne celletyper som spredes gjennom vev laget av ulike celletyper, som for eksempel enteroendocrine cellene i tarm epitel. Disse gastrointestinale sensorer av mat og bakterier har vært vanskelig å studere fordi de er dispergert blant de epitelceller i et forhold på 1: 1000. Nylig har transgene mus reporter blitt generert for å identifisere enteroendocrine celler ved hjelp av fluorescens. En av disse er peptid YY-GFP mus. Ved hjelp av denne musen, har vi utviklet en metode for å relatere konfokal og serie blokk-ansikt scanning elektronmikroskopi. Vi kalte metoden cocem3D og brukt den til å identifisere en bestemt enteroendocrine celle i vev og avsløre cellenes ultrastructure i 3D. Oppløsningen av cocem3D er tilstrekkelig til å identifisere organ så liten som sekretoriske vesikler og å skille cellemembraner for volum rendering. Cocem3D kan enkelt tilpasses for å studere 3D ultrastructure andre spesifikke celletyper i sitt eget vev.

Introduction

Livet i en celle finner sted i tid og rom. Endringer over tid er ofte studert ved hjelp av time-lapse mikros kombinert med fluorescens imaging teknikker, som super-oppløsning mikroskopi. Plass, særlig anordningen av organeller i en celle eller celle-til-celle-interaksjoner, kan bare være avledet av en fullstendig redegjørelse for cellens finstruktur. En omfattende redegjørelse for en celle fin struktur kan også bringe klarhet i genomisk funksjon i tilfeller hvor genomet er tilgjengelig, som C. elegans nematode en eller flat placozoa tricoplax adherens to. Serial seksjonering elektronmikroskopi er nå en reproduserbar, tidseffektiv, og mindre kostbar oppgave takket være utviklingen av automatiserte 3D elektronmikros teknologier, som serie blokk-ansikt scanning elektronmikros 3 (SBEM).

Behovet for strukturell informasjon for å belyse funksjonen er meget tydelig i visse celtyper l hvor funksjonen avhenger av fysiske celle-til-celle-vekselvirkninger, så som neuroner, gliaceller, eller sensoriske epitelceller. Vi er spesielt interessert i å belyse hvordan sensoriske signaler fra næringsstoffer i lumen av tarmen blir omformet til et elektrisk signal som til slutt modulerer appetitive atferd. Kretsen er kompleks, men begynner i veggen av tarmen hvor næringsstoffene kommer i kontakt med sensoriske epitelceller, kalt enteroendocrine celler. I motsetning til andre sensoriske epitelceller, slik som smaks celler, enteroendocrine cellene dispergert i tarmepitelet i et forhold på 1 til 1000 4-7. Derfor har de vært vanskelig å identifisere og studere, og for lang tid de ble sett på bare som en kilde til gut hormoner. Men med utviklingen av celle-spesifikke fluorescens rapportør mus, komplekset sensorisk funksjon av disse cellene dukker opp. Bruker en av disse reporter mus, et peptid YY-GFP (PyyGFP) mus, fant vi at enteroendocrine celler har en fremtredende cytoplasmatiske hale som vi heter neuropod. Utseendet av neuropods foreslått en konservert funksjon i celle-til-celle-kommunikasjon. Således begrunnet vi at ved å dokumentere den ultra av en enteroendocrine celle, kan funksjonen til neuropods utledes.

Behovet for å forstå strukturen av et vedheng i en dispergert celle som er vanskelig å identifisere var den viktigste begrunnelsen for å utvikle en metode for å kombinere konfokal mikroskopi og SBEM. Cellen av interesse ble identifisert ved hjelp av PyyGFP enteroendocrine celle-spesifikke reporter mus. Metoden tillater oss å dokumentere hele ultrastructure av en enteroendocrine celle og dens neuropod. Innenfor neuropods, fant vi strukturelle trekk ved nevronale aksoner, og utenfor neuropods, fant vi et fysisk forhold til ente gliaceller 8. Faktisk neuropods inneholder ca 70% av alle sekretoriske vesikler som antyder en viktig rolle i den sekretoriske funksjon av disse cellene. Bygger påstrukturelle data i den senere tid har vi funnet at gjennom disse neuropods, enteroendocrine celler og nevroner innervating tarmen danner en neuroepithelial krets, lik som smaks celler i tungen 8,9.

Avdekke slike funksjoner av gastrointestinale chemosensory mekanismer stammet fra strukturelle data samlet inn ved hjelp av denne samsvarmikros metoden. Vi tror at denne metoden kan være nyttig i andre områder av cellebiologi, særlig hvor cellene er dispergert i vev ved et meget lavt forhold. Vi referert til den metode som er korrelative konfokal og serieblokkflate scanning elektronmikroskopi i 3D (Cocem3D). Metoden består av følgende hovedtrinn: vev disseksjon, konfokalmikroskopi, SBEM bildebehandling, SBEM og confocal bilde korrelasjon, og manuell segmentering. Sammenlignet med andre korrelative metoder, er konseptet ganske enkelt fordi korrelasjonen er fysisk snarere enn kjemisk.

Protocol

Alle dyr omsorg og forsøkene ble gjort i henhold til en protokoll godkjent av Duke University Institutional Animal Care og bruk komité.

Cocem3D stammet fra en kombinasjon av tidligere publiserte protokoller 10,11 og ble brukt for å studere et bestemt enteroendocrine celle ved hjelp av en PyyGFP reporter mus 12. Denne fremgangsmåten kan lett anvendes på andre celler av interesse ved å bruke kommersielt tilgjengelige transgene rapportør mus. Metoden er beskrevet i tre seksjoner: korrelative konfokal mikroskopi, serie blokk-ansikt-scanning elektronmikroskopi (SBEM), og datagjengivelses i 3D.

Korrelerende Konfokalmikroskopi

Målet med denne delen er å høste en vev segment fra den distale colon av dimensjoner som gjør at korrelative konfokal og SBEM bildebehandling. Protokollen er som følger:

1. Høsting av Tissue

  1. Forberede10 ml 50 ug / ml heparin-løsning i PBS.
  2. Forbered xylazine / Ketamin bedøvelse lager ved å blande 10 ml av ketamin (100 mg / ml) og 1 ml av xylazin (20 mg / ml).
    1. Fortynne xylazine / ketamin lager 1: 4 i 0,1 M PBS.
  3. Tilbered en 100 ml fiksativ oppløsning inneholdende 4% paraformaldehyd og 0,1% glutaraldehyd i PBS.
  4. Bedøve en PyyGFP mus, 6 til 10 uker gamle, med en dødelig dose av xylazine / ketamin bedøvelse. Injisere bedøvelses intraperitonealt på 0,15 ml per 20 g mus vekt.
  5. Bekreft skikkelig muse anesthetization ved å knipe halen eller tær, og bruke salve på øynene for å hindre tørrhet.
  6. Bruk en variabel flyt peristaltisk pumpe til perfuse fiksativ intracardially 10. Ved hjelp av kirurgisk saks (13 cm lengde) kuttet åpne bukhulen å eksponere tarmen, hjerte og lunger. Hold hjerte med smal-mønster buede tang (12 cm lengde) og sett butterfly nål (19 G) fra slangepumpe into venstre ventrikkel. Umiddelbart, kuttet høyre atrium med våren rett saks (lengde 4 mm). Perfuse med en hastighet på 2 ml / min, først med heparin-løsning i 1 minutt, og deretter med iskald fikseringsmiddel-løsning i 15 minutter inntil musens hale er helt stiv.
    Merk: Det er veldig viktig å perfuse ved en lav hastighet for å unngå sprengning av små fartøy i tarmslimhinnen. Sprengning av skip vil kompromittere vevets ultrastructure. Hvis perfusjon er tilstrekkelig, bør leveren blir blek i fargen i 3-5 min.
  7. Bruke liten saks åpne bukhulen og avgifts hele tykktarmen fra krysset med cecum til distal endetarmen. Plasser vevet i iskald PBS. Mens nedsenket i PBS, skåret opp med små våren saks kolon langs mesentery.

2. dissekere og Fikse Tissue segmenter

  1. Ved hjelp av en skalpell, kuttet ca 6 små vev segmenter (2 mm 2) fra den distale colon. Gjør dette på et ark of dental voks og neddykket i noen få dråper av PBS.
  2. Post-fikse vev segmentene i fiksativ løsning i 3 timer ved 4 ° C.

3. Micro-dissekere vevsblokker

  1. Forbered 5% lavtsmeltende agarose i PBS og holde den i et vannbad ved 45 ° C.
  2. Embed vevet segmentene i 5% lav-smelting agarose hjelp av en liten plastbeholder, som standard størrelse Tissue-Tek Cryomold.
  3. Monter den innebygde seksjoner på en vibrerende blad mikrotom og fyll bufferbrettet med iskald PBS.
  4. Skjær 300 mikrometer vev strimler på 0,8 amplitude og 0,04 mm / sek hastighet. Merk: På dette punktet, vil vevet strimler forskyves fra agarose.
  5. Re-embed 300 mikrometer vev strimler i agarose og montere dem på mikrotom vinkelrett på vibratome bladet.
  6. Ved hjelp av en vibratome, skjære vev strimler med en tykkelse på 50 um. Merk: De endelige vevsblokker bør være ca 300 mikrometer brede x 50 mikrometer tykt. Disse dimensions optimaliseres fra pilot konfokale forsøk som viste at tykkelsen enteroendocrine celle er mellom 15-20 mikrometer og neuropod lengde 30-70 nm. Derfor kan en hel celle inneholdes i en blokk av vev 300 mikrometer brede ved 50 um tykt hvis cellens orientering er parallell med flaten av vev blokken. Variere disse dimensjonene avhengig av vev og celletype av interesse.
  7. Oppbevar vevsblokker i PBS ved 4 ° C.

4. Confocal Imaging

  1. Forberede en kjernefysisk flekken løsning ved å fortynne DAPI i PBS ved 1: 4000.
  2. Inkuber vevsblokker i DAPI nukleær flekk i 5 min. Merk: DAPI farging letter skille enkeltceller av sine kjerner, noe som er nyttig for å korrelere konfokale og SBEM bilder.
  3. Mount vevsblokker på ladet glass slide, legge til et par dråper av PBS, og dekk dem med et dekkglass.
  4. Ved hjelp av en konfokalmikroskop, identifisere blokks med intakt villi og PyyGFP celler av interesse og fotografert dem å få z-stabler optiske seksjoner.
    1. Bruk en 20X / 0.8 Zeiss Plan Apochromat mål å oppnå z-stabler av en mikrometer optiske seksjoner.
    2. For den z-stabelen, bruker kanalene for 405 nm (DAPI) for å bestemme forholdet til andre celler, til 488 nm endogent GFP lokalisere den celle av interesse, og kontrast differensialinterferens (DIC) for å bestemme plasseringen av cellen i forhold til lumen.
    3. Bruk bildeoppløsning på 1024 piksler eller høyere.

5. Inkludering Blokker i Agarose

  1. Forbered 10 ml fiksativ som inneholder 4% paraformaldehyde og 2,5% glutaraldehyd i PBS.
  2. Fjern de vevsblokker fra glass-slide ved forsiktig tilsetning av PBS i kantene av dekkglass for å skyve bort fra dekkglasset uten å skade vevet blokken. Deretter bruker du en fin kunst pensel til å overføre vev kvartal fra lysbilde til et 10,5 ml mikro tube som inneholder 4% paraformaldehyde og 2,5% glutaraldehyd fiksativ.
  3. Post-fix vevsblokker O / N ved 4 ° C.
  4. Overfør vevsblokker til PBS. Deretter legge blokker flate i 5% lav-smelting agarose ved å klemme dem mellom to glassplater.
    Merk: Inkludering blokkene i et tynt lag av agarose letter posterior manipulasjon under farging.
  5. Kutt agarose i en firkant og gjør et hakk på oversiden. Merk: Dette trinnet er nødvendig for å opprettholde orienteringen i etterfølgende trinn.
  6. Oppbevar blokker i et 1,5 ml mikrosentrifugerør med PBS ved 4 ° C inntil videre behandling.

Serial Block-ansikt Scanning elektronmikroskopi (SBEM)

I denne delen er det vevsblokk forberedt og avbildes med SBEM ved lav forstørrelse. Undersøkelsen bilde av blokkflate blir så korrelert med det konfokale data for å identifisere den region som inneholder cellen av interesse. Når regionener identifisert, er vevet avbildet med en oppløsning på 7 nm / pixel og skiver av 70 nm. Dette var nok til å løse og skille store rike kjerne sekretoriske vesikler fra andre organeller. I enteroendocrine celler, denne type vesikler varierer mellom 100 og 150 nm i diameter 13. Protokollen er som følger:

6. Farging vevssnitt

  1. Fjerne vev fra PBS og skylles tre ganger, 5 minutter hver, i 0,1 M kakodylatbuffer.
  2. Flekke blokker for 1 time i 0,1% garvesyre oppløst i 0,1 M kakodylatbuffer å forbedre kontrasten av cellemembraner 14.
  3. Gjennomføre påfølgende farging og dehydrering av vev i henhold til protokoll som er publisert 11. Etter Deerinck et al. protokollen, forberede disse oppløsninger: 1) 1% (w / v) thiocarbonhydrazide (THC); 2) føre aspartate løsning; 3) 1% uranylacetat og 4) osmium tetraoxyde / kaliumferrocyanid (OsO 4 / K Ferrocyanide). Bland 4% OsO 4 og 2xK Ferrocyanide stam [0,3 g K Ferrocyanide og 0,86 g Na-cacodylat i 10 ml H2O] i forholdet 1: 1 for å gjøre OsO 4 / K Ferrocyanide. Merk: Å ha vev innebygd i agarose forenkler håndtering under farging. Fjern forsiktig agarose for påfølgende harpiks infiltrasjon.
  4. Skyll prøver tre ganger, 5 min hver gang, i 0,1 M kakodylatbuffer og deretter flekken med OSO4 / K Ferrocyanide løsning i 2 timer ved 4 ° C.
  5. Skyll i ultrarent vann tre ganger, 5 min hver, og flekken med TCH i 30 minutter ved 60 ° C.
  6. Skyll i ultrarent vann tre ganger, 5 min hver og flekken med 2% OsO 4 (ingen K Ferrocyanide) i 60 minutter ved RT. Skyll igjen i ultrarent vann tre ganger, 5 min hver.
  7. Flekken med 1% uranylacetat O / N ved 4 ° C. Skyll i ultrarent vann tre ganger, 5 min hver.
  8. Flekken med bly aspartat i 30 minutter ved 60 ° C. Skyll i ultrarent vann tre ganger, 5 min hver.
  9. Dehydrere vev ved å skylle i løsning;ns med økende konsentrasjoner av etanol. Skyll 2 ganger, 5 minutter hver, med 50%, 75%, 85%, 95% og 100% absolutt etanol. På slutten, skyll seksjoner med propylenoksyd to ganger, 10 minutter hver.

7. infiltrere og innebygging vevsdelene i Resin

  1. Infiltrere blokkene med harpiks bruke kommersielt avaialble kit. Embed vev i harpiks ved hjelp av en EPON embedding kit. Forbered en harpiks blanding av 48% Epoxy, 20% ml DDSA, 30% ml NMA, og 2% DMP30. Agitere harpiksblandingen kraftig i 5 minutter og deretter plassere blandingen i vakuum i 30 min slik at luftboblene som kommer til overflaten.
  2. Blande harpiks med propylenoksyd i forholdet 1: 1 og rist kraftig. Ta den siste dehydrering skylling fra vev, og legge harpiks blandet med propylen oksid. Plasser hetteglasset med prøver i en rotator O / N og la flasken stå uten kork. Neste dag, legger ferske EPON harpiks og bland i 90 min i rotator.
  3. Embed blokker i harpiks som flate som mulig ved å klemme dem imellom glassplater som er blitt helbredet ved flytende slippmiddel for å hindre dem fra å holde seg til hverandre 15.
  4. Når blokkene er innleiret flat, herde blokkene for et tillegg 48 t ved 60 ° C.
  5. Trekk lysbilder fra hverandre for å slippe blokker.

8. Montering og Trimming av Tissue Block for Imaging

  1. Under en dissekere omfang, samsvarer med orienteringen av vevsblokker innleiret i harpiks enn det de konfokale mikrografer for å lette identifisering av områder som inneholder celler av interesse før trimming blokken.
  2. Trim resin innebygde blokk manuelt ned til en ~ 500 x 500 mikrometer blokk-ansikt.
  3. Monterer blokken flatt på en tapp som inneholder ledende epoksy og tørke i 30 min. Deretter, la blokken på et flatt underlag og tørr O / N ved 60 ° C.
  4. Coat blokken med kolloidalt sølv væske. Opprettholde vevssnitt flate for å sikre kutting av blokken i rett vinkel for å lette correlating serie blokk-ansikt og konfokale mikrografer.

9. SBEM

  1. Bilde blokken ved hjelp av et elektronmikroskop utstyrt med et SBEM system (e .g., 3View).
  2. Satt opprinnelig tykkelse delen på ~ 2 mikrometer intervaller og kutte inntil ansiktet av vev kommer fra blokken.
  3. Erverve en surver bilde av hele blokken ansiktet.
  4. Ved hjelp av Fiji programvare, ta målinger av både serie blokk-ansikt og konfokale mikrografier å generere en fellesnevner og konto for prøve fordreining under fiksering og farging 16.
  5. Lokalinteresseområdet på blokken ansiktet ved å multiplisere nevneren til koordinatene i konfokale bilder. Bruke også andre strukturelle trekk, slik som posisjonen til mikrovilli, slimceller, eller lamina propria, som en referanse.
  6. Bilde regionen av interesse på en 2,25 kV og 7 nm / pixel (eller 15,147X forstørrelse) i høy vakuum modus. Slice trinn bør settespå 70 nm eller mindre.
  7. Samle SBEM data i rå 16-bit .dm3 format.

10. Optimalisering SBEM Images for Surface Segmentering

  1. Konvertere SBEM bilder fra rå .dm3 format til 8-bits TIFF.
  2. Filter TIFF bilder ved hjelp av en 0,8 Gaussian Blur filteret i Fiji.
  3. Skalere ned datasettet til 25% av opprinnelig størrelse og lagre det som en TIFF bunken for å minimere mengden RAM minne er nødvendig for å håndtere settet.
  4. Juster bunken SBEM bilder med Fiji plugin "lineær stabelen innretting med SIFT" i oversettelse modus og beskjæres bruke "crop 3D" plugin. Merk: Beskjæring bidrar til ytterligere redusert mengden RAM minne er nødvendig for å segmentere og volumgjengivelse.

Data Rendering i 3D

11. Konfokalmikroskopi

  1. Rekonstruere z-stabler ved hjelp av automatisk overgå modus av "flatene" -verktøyet. Figur 1D, viser en reconstruksjon av hver kanal med den glatte alternativet på, overflater området detalj på 0,126 mikrometer, og terskelverdier som absolutt intensitet.

12. Serial Block-ansikt SEM

Merk: Manuell data segmentering er en svært tidkrevende prosedyre og avhengig av funksjonene som skal gjengis prosedyren kan ta flere uker. Segmentering for videoer og tallene som presenteres i Bohórquez et al. 2014 8 ble gjort manuelt og tok ca 500 timer på arbeidskraft. Det anbefales å prioritere de viktige funksjonene som trenger gjengivelse før du begynner segmentering prosessen. Prosedyren er som følger:

  1. Bruk "flater" verktøy i trekningen modus og "contour" alternativet på tegnemodus på 50 millisekunder å segmentere manuelt og volumgjengitt cellen av interesse.
  2. Spore konturene på hver skive av cellen for jevnere gjengivelse eller hver 5 stykker for raskere gjengivelse.
  3. Export endelige imaldre ved hjelp av "snapshot" -verktøyet med en oppløsning på 300 dpi eller mer.

Representative Results

Metoden som presenteres her ble anvendt for å studere ultrastructure av en bestemt celle i et lag av epitel. Den celle av interesse i dette tilfellet er den unnvikende enteroendocrine cellen. Deres identifikasjon in situ har vært mulig bare i de siste årene med utvikling av cellespesifikke fluorescens reporter mus. I 2011 utviklet vi en mus der arrangøren av hormonet PYY driver uttrykk av grønt fluorescerende protein 17. I denne PyyGFP mus, er enteroendocrine celler av den distale del av tynntarmen og tykktarmen lett preges under UV-lys. Denne musen modellen var et grunnlag for å identifisere en vev blokk som inneholder en enteroendocrine celle og behandle den for SBEM. Korrelasjonen Metoden omtales her som cocem3D og ble bygget på tidligere publiserte protokoller 10,11.

Optimalisering av dimensjonene av vevet blokken er kritisk for korrelasjon. I preliminære eksperimenter,Det ble fastslått at i en vev blokk 300 um lang x 50 um tykt antall SBEM bilder som er redusert til et minimum, samtidig som dekker hele kroppen av cellen er av interesse. Figur 1A viser en overse disseksjon ved hjelp av et vibrerende blad i microtrome innhente vevsblokk med riktige dimensjoner. Minst 100 blokker er innhentet før sortering gjennom dem for å plukke de med intakte celler av interesse. Valgte blokker blir avbildet ved konfokal mikroskopi og bilde z-stabler er optisk adskilt hver 1 um (figur 1 B og C). Figur 1D viser et volumgjengitt riss av en enteroendocrine celle i ileum av musen. Sin fremtredende neuropod strekker under epitelceller for ~ 60 mikrometer.

Cellen av interesse er funnet ved å korrelere de konfokale z-stabler med SBEM bilde av hele blokken ansiktet. Et eksempel er presentert her av en blokk fra den distale colon av en PyyGFPmusen. Etter å ha fått konfokale z-stabler (figur 2A), blir blokken innleiret i et tynt sjikt av lavtsmeltende agarose (figur 2B). Dette er nødvendig for etterfølgende manipulering av blokken. Det er viktig å opprettholde orienteringen av blokken så flate som mulig å matche de optiske skivene med SBEM skiver. I figur 2C, er et representativt bilde som vises på hele flaten av vev blokken. Deler av dette tallet ble tidligere publisert i Bohorquez et al., 2014 8. Dette ble senere korrelert med konfokalt bildet ved å ta hensyn til vev landemerker og dimensjoner. Figur 2D viser en overlapping av confocal og SBEM bilde av blokken, avslører presis lokalisering av vår celle av interesse.

Når cellen er blitt identifisert, blir SBEM avbildning utført med en oppløsning med høy nok til å identifisere sekretoriske vesikler og andre celleorganeller. Datasettet presenterte hanre ble fotografert på 7 nm per piksel som bilder av blokken ble tatt hver 70 nm. De data som er inneholdt 643 bilder som spenner over 45 mikrometer av vevet dybde. Noen få mikrometer barbert under den første avbildning av hele blokkflate ved lav forstørrelse. Den rå SBEM datasettet ble kjøpt i .dm3 format og forvandlet til TIFF for videre bearbeiding. Den SBEM stack ble beskåret med Fiji programvare plugin "crop (3D)" block å inneholde kun regionen av interesse. Dette reduserer mengden RAM minne som trengs for volumgjengivelse. Cellen ble identifisert ved sin posisjon og sekretoriske vesikler, og segmentert ved hjelp av Imaris programvare. Figur 3 inneholder en gjengivelse i 3D for enteroendocrine cellen.

Figur 1

Figur 1:. Korrelative konfokalmikroskopi (A) Arbeidsflyt å dissekere et stykketarmvevet inn i en vev blokkerer 300 x 50 mikrometer tykt. (B) En representant vevsblokk av de riktige dimensjoner. Legg merke til at en vev blokk med disse dimensjonene fra musen tynntarmen strekker seg over omtrent tre villi eller, i tilfelle av kolon ca 8 krypter. (C) En villus i tynntarmen som inneholder en celle av interesse. (D) En confocal z-stack gjengitt i 3D ved hjelp Imaris programvare viser en enteroendocrine celle med en fremtredende neuropod kjører under tarmepitelet. Blå = DAPI atom flekken. Barer = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Serial blokk-ansikt-scanning elektronmikroskopi (A) Confocal bilde av en sele.cted vevsblokk fra tykktarmen inneholder PyyGFP enteroendocrine celler (grønt) av interesse. (B) Når blokken avbildes ved konfokal mikroskopi, er det da innleiret flatt i lavtsmeltende agarose ved hjelp av glassplater. Inkludering vevet blokken i agarose forenkler påfølgende manipulasjon, og hakket på venstre hjørnet bidrar til å montere blokken innenfor SBEM i riktig retning. (C) SBEM bilde av forsiden av blokken. (D) Korrelasjonen av konfokale data med SBEM å identifisere celle av interesse (hvit pil). Bilder i c og d av dette tallet er endret fra Bohorquez et al., 2014 8. Blå = DAPI atom flekken. Barer = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3:. Datarendering i 3D (A) Volum gjengivelse av enteroendocrine cellen ved hjelp Imaris programvare. Cellen inneholder en neuropod pakket med sekretoriske vesikler. For en fullstendig beskrivelse av ultrastructure av en enteroendocrine celle, henvises det til Bohórquez et al., 2014 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Gastrointestinal chemosensation fremstår som et spennende nytt felt i biomedisinsk forskning. Dette er i stor del på grunn av oppdagelsen av funksjonelle smaksreseptorer i enteroendocrine celler 18. Senere studier har vist at enteroendocrine celler uttrykker spesifikke reseptorer for næringsstoffer, inkludert karbohydrater, lipider og aminosyrer 5,6,19,20. Den katalytiske faktor for disse funn har vært utviklingen av rapportør mus, hvori enteroendocrine cellene er fluorescensmerket 20. Vi har utviklet en av disse mus, er PyyGFP mus, for å studere enteroendocrine celler av den distale tynntarm og tykktarm 17,21. Disse cellene er av interesse fordi de skiller ut PYY og glukagon-lignende peptid 1, som begge er indusere av metthet 22,23. På den tiden en komplett ultra-strukturelle hensyn til disse cellene var mangler, som vi mente var avgjørende for å forstå deres signalmekanismer.

ontent "> Her har vi beskrevet et visuelt en metode for å bygge bro konfokalmikroskopi med SBEM. Metoden omtales som Cocem3D, som tillot oss å dokumentere hele ultrastructure av enteroendocrine celler. Vi har rapportert at disse cellene har en neuropod som inneholder tre fjerdedeler av alle de sekretoriske vesikler 8. Innenfor neuropod, er det nevrofilamenter og mye som nevrale aksoner, er neuropods oppfostret av ente gliacellene 8. Viktigere er det om disse neuropods at enteroendocrine celler fysisk koble til nevroner innervating tarmen og kolon 9.

En av styrkene til cocem3D er dens enkelhet. Reduksjon av vevsprøve til en blokk som kan avbildes ved konfokal og SBEM letter identifikasjon av en bestemt celle i et vev. Sekretoriske vesikler og andre organeller kan identifiseres med letthet med en oppløsning på 7 nm / pixel. Fordi seksjonene i SBEM ignorert, ytterligere prosesssynge av vev for å identifisere spesifikke proteiner er ikke et alternativ på dette punktet. Imidlertid har utviklingen av metoder som ATUM 24, i hvilke deler fra vevet blokken er bevart, er sannsynlig å muliggjøre identifisering av spesifikke proteiner i cellen. Fastsette den konkrete plasseringen av chemosensory reseptorer på enteroendocrine celler er viktig informasjon for utvikling av medisinsk behandling for fedme, fordi enteroendocrine celler er en sensorisk grensesnitt mellom mat i tarmen og metthetsfølelse i hjernen.

Disclosures

Dr. Satish Medicetty er ansatt i og mottar 100% lønn fra Renovo Neural Inc; Men dette betyr ikke endre forfatterens tilslutning til Jove politikk på deling av data og materialer. Ingen interessekonflikt er erklært for øvrige forfattere.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline Life technologies 10010023
Heparin sodium salt Sigma H4784
Paraformaldehyde  Sigma 158127 4%, freshly made in PBS, final pH 7.4
Glutaraldehyde Sigma G5882
Dental wax Electron Microscopy Sciences 72660
Low-melting agarose Life technologies 16520-100 5%, freshly made in PBS
Standard Tissue-Tek Cryomold Electron Microscopy Sciences 62534-25
DAPI  nuclear stain Life technologies D1306
Postively charged glass slides and coverslips
Fine art paintbrush #1
Cacodylate buffer Electron Microscopy Sciences 11650
Tannic acid Electron Microscopy Sciences 21700
EMbed 812 kit  Electron Microscopy Sciences 14120
Liquid releasing agent  Electron Microscopy Sciences 70880
Liquid silver colloidal    Electron Microscopy Sciences 12630
CircuitWorks conductive epoxy   ITW Chemtronics CW2400
Variable flow peristaltic pump VWR 70730-064
VT1200S Vibrating blade microtome Leica
Zeiss 780i confocal microscope Carl Zeiss 
Sigma VP Scanning Electron Microscope  Carl Zeiss 
3view system Gatan
Renovo Neural Inc (Cleveland, OH) http://www.renovoneural.com Renovo provides 3d EM services
Fiji software Open access software
Computer station with 16 GB of RAM or more
Data visualization software Imaris 7.5  Bitplane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).
  2. Smith, C. L., et al. Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens. Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).
  3. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS biology. 2, e329 (2004).
  4. Engelstoft, M. S., et al. Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells. Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).
  5. Chandra, R., et al. Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion. The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).
  6. Wang, Y., et al. Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).
  7. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).
  8. Bohórquez, D. V., et al. An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy. PloS one. 9, e89881 (2014).
  9. Bohórquez, D. V., et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. The Journal of clinical investigation. (2015).
  10. Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).
  11. Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. University of California. San Diego San Diego, CA. (2010).
  12. Bohórquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).
  13. Nilsson, O., et al. Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon. Endocrinology. 129, 139-148 (1991).
  14. Mizuhira, V., Futaesaku, Y. New fixation method for biological membranes using tannic acids. Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).
  15. Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy. Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  17. Bohórquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).
  18. Jang, H. J., et al. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).
  19. Liou, A. P., et al. The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin. Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).
  20. Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).
  21. Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets. Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).
  22. Batterham, R. L., et al. Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake. Nature. 418, 650-654 (2002).
  23. Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans. The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).
  24. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).
Korrelerende Confocal og 3D Elektronmikroskopi av en bestemt Sensory Cell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bohórquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J. Vis. Exp. (101), e52918, doi:10.3791/52918 (2015).More

Bohórquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J. Vis. Exp. (101), e52918, doi:10.3791/52918 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter