Summary
Мы опишем протокол иммуногистохимии для изучения профиля активации гиппокампа нейронов после воздействия пространственной учебной задачи в модели мыши характеризуется когнитивных дефицитов развития нервной системы координат. Этот протокол может быть применен к обеих генетических или фармакологических моделей мышей, характеризующихся когнитивных нарушений.
Abstract
Индукционная фосфорилированного внеклеточной регулируемой киназы-(Перк) является надежным молекулярным считывания обучения зависит от нейронов активации. Здесь мы опишем протокол Перк иммуногистохимии для изучения профиля активации гиппокампа нейронов после воздействия пространственной учебной задачи в модели мыши характеризуется когнитивных дефицитов развития нервной системы координат. В частности, мы использовали Перк иммуноокрашивания изучать нейронов активации следующее Моррис водном лабиринте (MWM, классическая гиппокампа-зависимой задача обучения) в Engrailed-2 нокаутом (EN2 - / -) мышей, модель расстройств аутистического спектра (ASD). По сравнению с дикого типа (WT) управления, en2 - / - мышей показали значительные дефициты пространственное обучение в MWM. После MWM, значительных различий в количестве одной особенностью-позитивных нейронов были обнаружены в конкретных гиппокампа подполей EN2 - / - мышей, по сравнению с WT животных. Таким образом, наш протокол может решительно обнаружить различия вПерк-позитивных нейронов гиппокампа, связанные с зависит от обучения обесценения в мышиной модели ASD. В целом, наш протокол может быть применен для исследования профиля активации нейронов гиппокампа в обоих генетических или фармакологических моделей мышей, характеризующихся когнитивных нарушений.
Introduction
Неврологические расстройства включают широкий и гетерогенную группу расстройств, таких как синдром Дауна, синдром ломкой Х (FXS), синдром Ретта, нейрофиброматоз, клубневые склероз и ASD, в которых развитие и созревание центральной нервной системы (ЦНС) нарушается во время раннего внутриутробный период 1. Эти развития дисфункций мозга может вызвать глубокие, всю жизнь воздействуют на моторные функции, языка, обучения и процесса памяти. Множество генетических и экологических факторов были вовлечены в патогенез расстройств нервной системы в течение последних нескольких лет 2,3. Даже если молекулярные механизмы, лежащие в основе клинического фенотипа неизвестны, упомянутые выше результаты позволили развитие нескольких мышиных моделях этих нарушений. Обучения и памяти дефицита были определены в ряде этих мышиных моделей, таких как TSC1 +/- +/-, TSC2,НФ1 +/- и en2 - / - мышей 2,4-7. Важной задачей в области развития нервной расстройств идентификации клеточных и молекулярных процессов, лежащих в основе памяти и обучения дисфункции. Отдельные сигнальные пути активированные при обучении или памяти можно индуцировать транскрипцию специфических генов и в конечном счете приведет к нового синтеза белка. Непосредственные-ранних генов (IEGs) активации и белка зависит от синаптических изменений быстро индуцируется в нейронах головного мозга в ответ на активность нейронов и поведенческих обучения 8,9.
Дефицит пути с участием Нейрофибромин сигнализации были связаны с нарушениями нервной системы обучения в расстройств. Нейрофибромин является продуктом гена NF1, чьи мутации вызывает нейрофиброматоз типа 1, комплекс генетический синдром, характеризующийся опухолей нервной системы, поведенческих и моторных задержек и познавательной DISAностей 10. Мыши, гетерозиготные по Nf1 удаления ограничения, чтобы тормозных нейронов показать дефицит в ранней фазе долгосрочного потенцирования (LTP), а также угрозу пространственного обучения в MWM 5,11,12. Интересно, что дефицит НФ1 в этой модели мыши приводит к более-активации сигнализации Рас в тормозных интернейронов в процессе обучения, что приводит к увеличению ЭРК фосфорилирования и, наконец, в ненормальном повышения высвобождение ГАМК из этих нейронов 5.
Основываясь на этих выводах, визуализация нейронной активности после поведенческих задач представляет собой способ реконструкции конкретных схем, участвующих в нервной заболеваний. Протокол иммуногистохимии, описанный здесь направлен на оценку и количественно гиппокампа уровни ЭРК фосфорилирования следующие MWM в модели ASD мыши с когнитивными нарушениями. МВМ широко используется для изучения гиппокампа в зависимости пространственное обучение и память у грызунов 13,14 15. Кроме того, ЭРК путь необходим для опыта зависит от пластичности в развивающихся зрительной коры 16. Наконец, мыши, лишенные одного из двух изоформ (ERK) ERK2 в шоу ЦНС отмечены аномалии в познавательных, эмоциональных и социальное поведение 17, указывая, что ERK сигнализации может играть решающую роль в патогенезе нервной расстройств, таких как ASD.
Мы использовали Engrailed 2 нокаутом (EN2 - / -) мышей в качестве модели развития нервной расстройств. En2 - / - мыши обнаруживают анатомические и поведенческие "АСД-как" функции, в том числе потери переднего мозга интернейронов 18, снижение экспрессии АСД-родственных генов 19, снижение общительности, и нарушение когнитивной гибкости 6,7,20. Пространственное learniнг и дефекты памяти, такие как те, обнаружены в MWM, особенно надежный в en2 - / - мышей 6,7 и может иметь отношение к когнитивных нарушений, наблюдаемых у пациентов 21 ASD. Кроме того, мы показали, что нарушение пространственного обучения в MWM связана со снижением экспрессии Нейрофибромин и увеличение Перк уровней в воротах в en2 - / - мышей взрослых 7. Здесь мы представляем подробный протокол для иммуногистохимического характеристики Перк следующей MWM в этой модели ASD мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты были проведены в соответствии с директивы Европейского сообщества 2010/63 / ЕС и были утверждены Министерством здравоохранения Италии.
1. Уход за животными, дома и лечение
- Выполните все экспериментальные протоколы, используя мышей в соответствии с руководящими принципами соответствующей институциональной уходу за животными.
- Поддержание животных в 12 ч циклом свет / темнота с пищей и водой, доступными по желанию.
- Дом мышей в группах 2-4, в стандартного размера клеток поликарбонат мыши с опилками и подстилки меняется еженедельно.
- Используйте возраста и пола соответствием мышей, поскольку восприимчивость к болезни может варьироваться в зависимости от возраста и пола в различных мышиных моделях нервной расстройств.
- Выберите соответствующее количество животных достигло статистической значимости (минимум 10 мышей на генотип для поведенческого исследования и 4 мышей на генотип для эксперимента иммуногистохимии).
2. Водный лабиринт Морриса (MWM)
- Используйте Circular танк (диаметр 100 см, высота 50 см).
- Поместите некоторые визуальные подсказки на разделителей пространства вокруг бака.
- Поставьте диаметром 10 см платформу в бак в фиксированном месте в центре одного из четырех воображаемых квадранта. Держите скрытой платформы в том же квадранте для всех испытаний во всех учебных занятий.
- Заполните бассейн с водопроводной водой до платформа 1 см над поверхностью воды. Температура воды Равновесие должно быть близко к 22 ° C; этот шаг может занять несколько часов. Добавьте горячую воду, чтобы сократить время, необходимое, чтобы уравновесить температуру воды.
- Добавьте примерно 1,5-2 л белого, нетоксичного краски, чтобы сделать воду непрозрачной.
- Трек Порядок приобретения
- Настройка системы отслеживания MWM с стандартными ПЗС-камер и видео плат. Выберите систему видео-слежения, чтобы отслеживать и анализировать несколько переменных, таких как длина пути, ЭСХАЗадержка ре, и время, проведенное в каждом квадранте.
- Разделите арену в четырех квадрантах и настроить параметры обнаружения для обеспечения оптимального контраста между животными и фона для живого слежения.
- Укажите регион платформы.
- Установите максимальное время судебного разбирательства, 60 сек.
- МВМ Тестирование
- Перед тестированием поведения, позволяют мышам адаптационный период 20-25 мин в районе, где они не могут увидеть на бассейн или пространственными аллюзиями.
- Поезд каждой мыши в течение 9 дней (два последовательных испытаний день, с 20-30 минутного интервала между ними).
- Включите компьютер и фотоаппарат и начать системное программное обеспечение видео-слежения.
- Возьмите мышь за хвост и поместите его в воду, с его головы указал в сторону бассейна, начиная от одного из четырех стартовых позиций (север, юг, восток, запад). Для каждой мыши, стартовая позиция должна отличаться и по pseudorandomized испытаний.
- Пусть поплавать мыши и искать Макс.высотаОРМ в течение максимум 60 секунд. После того, как животное достигает платформы, позволяют ему оставаться на платформе в течение 20 сек.
- Если мышь не удалось найти платформу в течение этого времени, мягко наведите мышью на платформу, держа его за хвост, и пусть он остаться там в течение 20 сек. После того, как животное завершила все испытания два, высушить его с полотенцем и поставить его обратно в клетку.
- Каждый день учебного периода, повторите ту же процедуру (шаги 2.3.4-2.3.6).
- Выполните проверку датчика на 9-й день после последнего учебного след.
- Снимите платформу от бассейна.
- Пусть поплавать мыши и искать платформы для максимум 60 сек.
- Периодически проверяйте температуру воды, так что это должно быть то же самое (22 ° С) и очистить бассейн.
3. Подготовка секций из перфузируемые Животные
- Пожертвовать мышей в конце MWM. Четыре мышей в генотипе должны быть под наркозом до euthanizвания в соответствии с местными и международными стандартами.
- Заливать животное транскардиальную (сократить права auriclewith ножницами, чтобы позволить ввести кровотечение и бабочки канюлю в левый желудочек, чтобы заливать) фосфатным буферным раствором (PBS) в течение 4-5 мин, а затем 4% параформальдегидом в PBS в течение 10-15 мин 22.
- Проанализируйте и пост-исправить мозги в 4% параформальдегида при 4 ° С в течение не менее 12 часов.
- Поместите мозги в 50 мл конические пробирки полистирола, содержащих 15 мл 0,02% азида натрия в 0,1 М PBS и хранить при температуре 4 ° С до тех пор, пока требуется для нарезки.
- Отрежьте мозжечка, прежде чем vibratome резки.
- Клей мозг вертикально с режущим сайте, используя суперклей, на держателя пластины vibratome.
- Разрежьте мозг в 20-40 мкм толщиной корональных секций, в последовательном порядке в течение дорсального гиппокампа, на соответствующем vibratome.
- Соберите vibratome ломтики с кистью и передать 24 мульти-луночный планшет, содержащий 1 мл 0,1 М PBS для каждой лунки.
- Храните секции для краткосрочной перспективе в PBS или долгосрочной перспективе в 0,02% азида натрия в PBS при 4 ° С (ткань может быть использована в течение одного года).
4. Иммуногистохимия
- Передача 3-5 спинных гиппокампа разделы для каждой мыши, в 24 мульти-луночного планшета, содержащую 500 мкл 0,1 М PBS для каждой скважины.
- Промыть секции, содержащиеся в каждую лунку по 500 мкл 0,1 М PBS (5 мин 3 раза при осторожном встряхивании).
- Гасят активности эндогенной пероксидазы, путем инкубации секции в 1% H 2 O 2 в PBS в течение 20 мин при осторожном перемешивании.
- Промыть секции в 0,1 М PBS при осторожном перемешивании (3 х 5 мин).
- Проницаемости ткани: инкубировать секций в течение 5 мин в 0,2% Triton X-100 в PBS.
- Во время этих действий (4,4; 4,5), сделать достаточно блокирующий буфер (10% козьего сыворотки и 0,1% Тритон-Х100 в PBS) в течение всего эксперимента (количесг секций х 100 мкл х 3 ступени).
- Примечание: Используйте сыворотку от тех же видов, у которых был сделан вторичный AB (конъюгированный с биотином).
- Предотвращение неспецифическое связывание антитела, путем инкубации секции в блокирующем буфере (100 мкл / раздел) в течение 1 ч при комнатной температуре (RT) при легком помешивании.
- Инкубируйте разделы в первичных Ab (Perk) разводили в блокирующем буфере, в течение ночи при 4 ° С, при осторожном перемешивании.
- Промыть секции в 0,1 М PBS при осторожном перемешивании (3 х 5 мин).
- Инкубируйте с вторичным Ab конъюгированного с биотином (1: 250), разведенного в блокирующем буфере (то же, используемый на стадии 4.6) в течение 1 ч при комнатной температуре и осторожном встряхивании.
- Подготовьте ABC реагента в то же время, из-за авидин и биотин требуют по крайней мере 30 мин при комнатной температуре к комплексу.
- Подготовьте необходимый объем реагента ABC в соответствии с протоколом производителей.
- Промыть секции в 0,1 М PBS при осторожном перемешивании (3 х 5 мин).
- Incubatе участки в течение 45 мин при комнатной температуре с ABC реагента.
- Промыть секции в 0,1 М PBS при осторожном перемешивании (3 х 5 мин).
- Подготовка DAB рабочего раствора, каждый шаг с участием DAB должно быть сделано в вытяжном шкафу, как DAB является канцерогеном и тератогенным.
- Передача раствора DAB к новой плите с помощью пластиковой пипетки.
- Место участки в пластине, содержащей DAB рабочего раствора и медленно вихрем пластину вручную, чтобы максимальный размер разделов.
- Монитор DAB реакцию на микроскопом, пока не развивается адекватный сигнал (2-5 мин).
- Остановка реакции при требуемой интенсивности цвета путем промывки ткани в 0,1 М PBS (3 х 5 мин).
- Используйте отбеливатель для отключения оставшуюся DAB раствора субстрата в вытяжном шкафу в течение ночи и распоряжаться им в соответствии с лабораторными рекомендациями.
- Mount разделы по желатин покрытием слайды, плавающие в PBS. Затем высушите их при комнатной температуре, по крайней мере 3-4 часов.
- Обезвоживают последовательно разделы в 50%, 70%, 95%и 100% этаноле в течение 2 мин каждого, и ясно, в 100% ксилола в течение 5 мин.
- Покровное использованием монтажной среды и оставить в вытяжном шкафу для просушки на ночь.
5. Сотовый граф
- Кол Перк-позитивные клетки от трех до пяти разделов на уровне дорсального гиппокампа должны быть проанализированы на животное.
- Приобретать несколько изображений светлого поля от каждой секции на 200X увеличении, используя подходящий микроскоп, а затем собрать их с помощью программного обеспечения для обработки изображений.
- Выполните количество клеток на TIFF преобразуются мозаичных изображений с использованием свободного программного обеспечения ImageJ.
- Граф Перк-окрашенных клеток в воротах и гранул слоя клеток на 2:58 считая коробки 100 × 100 мкм каждый.
- Плотность клеток будут выражены как число меченых клеток в счетной окне (100 × 100 мкм).
- Выполнить статистический анализ, чтобы оценить существенное различие между генотипами. Это может быть достигнуто с СтьюдентаТест ANOVA или последующим соответствующего испытания постфактум, используя коммерческие программного обеспечения. Установите статистический уровень значимости при р <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, описанный здесь, был разработан, чтобы визуализировать, с помощью иммуногистохимии, экспрессия специфического маркера активности нейронов гиппокампа после MWM в мышиной модели нервной расстройств. Все экспериментальные данные, приведенные здесь, были взяты из нашей недавней работе 7. Были использованы полученные от гетерозиготных вязки; соответствующего возраста взрослых помета (вес = 25-35 г 3-5 месяцев) - мужская и женская WT и en2 - /. Двадцать два мышей (11 на генотип) были использованы для MWM. Восемь мышей (4), на генотип умерщвляли в конце зонда проб MWM и используется для иммуногистохимических экспериментов.
Оценка дефицита пространственного обучения в en2 - / - мышей
Специально изучить наличие дефицита пространственного обучения в en2 - / - мышей, мы использовали тест MWM, классический гиппокампа-зависимой пространственное учебной задачи 13,14. На 1-й день Трайнинг испытания, никаких различий в латентности и скорости плавания были обнаружены между en2 - / - мышей и WT, предполагая, что оба генотипы показать подобный визуальный и двигателя производительность. Даже если все экспериментальные группы продемонстрировали способность к обучению в течение трасс, en2 - / - мышей достиг цели менее эффективно, чем WT мышей, начиная с 3-го учебного 7 день. На суде зонда (9 день), когда скрытая платформа была удалена из пула, WT мышей (рис 1а) показало, направленный путь-навигацию к ожидаемой целевой месте (пунктир черного ящика), в то время как en2 - / - мышей (рис 1B ) плавали более беспорядочно, демонстрируя блуждающий путь к целевой квадранте (пунктир черного ящика). Кроме того, в ходе судебного разбирательства зонда мышей WT показали ближе расположен к платформе, по сравнению с en2 - / - мутантов (рис 1С) (в одну сторону ANOVA с последующим Холм-Сидак после специальной тест, * р = 0,027, р = ** 0,007). Оценка близость соnsidered более чувствительны для обнаружения различий, чем групповые традиционных мер (потраченного времени и количества переходов в целевой квадранте 23).
Дерегулирования гиппокампа ЭРК фосфорилирования в en2 - / - мышей после задачи MWM
Чтобы изучить ERK фосфорилирования, мы тогда провели иммуногистохимическое окрашивание в подполе гиппокампа WT и en2 - / - мышей после MWM (рис 2А). Количество Перк-положительных нейронов СА3 была значительно ниже в en2 - / - мышей, по сравнению с WT (критерий Стьюдента, р = 0,0108; рис 2B - С). Наоборот, значительно большее количество Перк-положительных нейронов присутствует в воротах в en2 - / - мышей, по сравнению с WT (критерий Стьюдента, р = 0,0012; рис 2B, D). Кроме того, значительное большее количество Perk-позитивных нейронов был также обнаружен в й е слой ЗК (ГКЛ) в зубчатой извилине en2 - / - мышей, по сравнению с WT управления (критерий Стьюдента, р = 0,0021; рис 2B, Е).
Рисунок 1:. En2 - / - мыши обнаруживают нарушение пространственное обучение в водном лабиринте Морриса (- B) Снимки показывают WT-путь навигации к ожидаемому расположения платформы (пунктир черного ящика), в WT () и en2 - / - (В) мышей в ходе судебного разбирательства зонда. (С) Близость к платформе в выходные и противоположных квадрантах в ходе судебного разбирательства зонда. Сокращения и символы: T, целевая квадрант; ОП, квадрант напротив мишени; * Р <0,05, ** р <0,01 (односторонний ANOVA с последующим Холм-Сидак после специальной испытания; п = 11 в генотипе). Модифицированный из работы 7.ом / файлы / ftp_upload / 52919 / 52919fig1large.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Перк окрашивание в гиппокампе МВМ-обученного WT и en2 - / - мышей (A) Представитель Перк immunostaings на целых спинных гиппокампе.. (B) Информация о Perk иммунного окрашивания в СА3 и зубчатой извилине тех же мышей, как в (A). Белые стрелки показывают примеры Перк-положительных нейронов. Генотипы, как указано. Сокращения: CA3, CA3 пирамидальной слой; ВКТ, гранулы слой клеток. Масштабной линейки: 300 мкм (а), 150 мкм (б). (С - Е) Графы Перк-положительных нейронов в СА3 (C), воротах (D) и ВКТ (Е) МВМ-обученного WT и en2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы предоставляем Перк протокол иммуногистохимии для выявления нейронов активации следующей MWM в en2 - / - мышей, модель мыши нервной расстройств. Пониженные уровни одной особенностью были обнаружены в СА3 подполе EN2 - / - мутанты сравнению с WT. В отличие от того, что наблюдается в СА3 подполе, общим ростом Перк-положительных нейронов, а не обнаружен в обоих воротах и ВКТ из en2 - / - мышей по сравнению с WT. Возможное объяснение этого противоположной тенденции в уровнях фосфорилирования ERK может рассчитывать на подполей конкретных механизмов индукции Перк следующих MWM.
Протокол содержит несколько важных шагов, таких как оценка данных MWM, фиксации мозга, выбора и калибровки антитела, процедур мытья, обнаружения сигнала и процедуры подсчета клеток. Все эти критические шаги должны быть тщательно выполнены, чтобы обеспечить высокое качество и воспроизводимость результатов. Например, если мозг нOT закреплен (шаги 3.2 и 3.3), секции легко оторвать во время процедур окрашивания. Кроме того, участки не должны высыхать в любой момент во время промывки для того, чтобы избежать низкий сигнал в окрашивании. Наконец, если Перк антитела отличается, чем сообщалось здесь (см список материалов) используется, важно калибровать как концентрацию антител и времени инкубации для того, чтобы определить наиболее надежные и соответствующие условия. Кроме того, для обеспечения точного и объективного результата для иммуногистохимических экспериментов, важно, что оба теста МВМ и подсчет клеток будет сделано операторами слепых генотипом животного или фармакологического лечения. Perk позитивных нейронов может быть также обнаружен с помощью вторичного антитела, конъюгированного с соответствующим флуорофора от иммунофлуоресцентного. В этой связи, необходимо, чтобы пропустить тушение эндогенных пероксидаз (шаг 4.3) и использовать водный монтажа средств массовой информации для сохранения флуоресцентных красителей (Steр 4,24).
Пока выражение непосредственной начале гена (МЭР,) широко используется в качестве молекулярного подписью задача зависит от гиппокампа обучения 24. Это было по существу рассмотрены с-ФОС мРНК в гибридизация или иммуногистохимии. Наоборот, несколько иммуногистохимия исследования систематически рассматриваться нейронную активность в решении ERK фосфорилирования в мышиных моделях нервной расстройств. Наше недавнее исследование 7 и предыдущая работа 5 показали, как Перк иммунным является надежным маркером проследить гиппокампа нейронов, участвующих в цепи обучения и памяти. Одним из ограничений этого метода представлена несколькими важных шагов, которые могут привести к увеличению изменчивости результатов. Тем не менее, экспериментальный подход, представленный здесь дает исследователям краткой, простой в последующей чертах о том, как профиль активации гиппокампа нейронов в обоих генетических или фармакологических мышиных моделяххарактеризуется когнитивного дефицита. В целом, этот протокол также может быть использован для исследования нейронной активности в познавательной поведенческой задач, отличных от MWM и карту нейронов активации для других областей мозга, участвующих в потенциально когнитивных функций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать
Acknowledgments
Мы хотим поблагодарить административный состав CIBIO (университет Тренто) и CNR Neuroscience института помощи. Джованни Провенцано поддерживается пост-докторской стипендии от Fondazione Veronesi (Милан, Италия). Эта работа финансировалась итальянским Министерством университетов и исследований (PRIN 2008 грант № 200894SYW2_002 и прин 2010-2011 грант # 2010N8PBAA_002 для YB), Университет Тренто (CIBIO запуска грантовой YB) и Телемарафон фонда (грант # GGP13034 к Ю.Б.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
| Tempera Paint | Giotto - Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
| 24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
| Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
| Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
| Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
| ImageJ Software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |
References
- Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
- Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
- West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
- Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
- Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914 (2012).
- Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
- Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
- Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
- Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
- Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
- Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
- Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
- Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
- Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
- Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51 (2013).
- Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
- Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
- Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).
- Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).
