Summary
Biz nörogelişimsel kökenli bilişsel bozuklukların ile karakterize bir fare modelinde bir mekansal öğrenme göreve maruz kaldıktan sonra hipokampal nöron aktivasyonu profilini incelemek için bir immünohistokimya protokol açıklar. Bu protokol bilişsel karakterize hem genetik ya da farmakolojik fare modellerine uygulanabilir.
Abstract
Fosforile ekstraselüler regüle kinaz (pERK) uyarılması öğrenme bağımlı nöronal aktivasyon güvenilir bir moleküler okuma olduğunu. Burada, biz nörogelişimsel kökenli bilişsel bozuklukların ile karakterize bir fare modelinde bir mekansal öğrenme göreve maruz kaldıktan sonra hipokampal nöron aktivasyonu profilini incelemek için pERK immünhistokimya protokol açıklar. Fareler, otizm spektrum bozuklukları modeli (ASD) Özellikle, Morris su labirenti Engrailed-2 nakavt (MWM, klasik hipokampus bağımlı öğrenme görev) - (- / En2) aşağıdaki nöronal aktivasyon incelemek için pERK immün kullanılır. Vahşi tip (WT) kontrol ile karşılaştırıldığında, En2 - / - fareler MWM önemli uzamsal öğrenme yetersizlik göstermiştir. WT hayvanlara kıyasla, farelerin - / - MWM sonra, pERK pozitif nöronların sayısında anlamlı bir fark, belirli hipokampal EN2 bölgesinin alt alanlarında tespit edilmiştir. Böylece, bizim protokol sağlam farklılıkları tespit edebilirASD bir fare modelinde hipokampus bağımlı öğrenme bozukluğu ile ilişkili pERK-pozitif nöronlar. Daha genel olarak, protokol bilişsel bozukluklar ile karakterize edici özelliği, her iki genetik ya da farmakolojik fare modellerinde hipokampal nöron aktivasyon profilini araştırmak için uygulanabilir.
Introduction
Nörogelişimsel bozukluklar gibi merkezi sinir sistemi (MSS) gelişmesi ve olgunlaşması sırasında erken rahatsız olduğu Down sendromu, frajil X sendromu (FXS), Rett sendromu, nörofibromatozis, yumrulu skleroz ve ASD gibi hastalıkların geniş ve heterojen bir grup içerir Prenatal dönem 1. Bu gelişimsel beyin işlev bozuklukları motor fonksiyon, dil, öğrenme ve bellek süreci üzerinde derin, yaşam boyu etkilere neden olabilir. Genetik ve çevresel faktörlerin bir bolluk son yıllarda 2,3 sırasında nörogelişimsel bozuklukların patogenezinde suçlanmıştır. Klinik fenotip altında yatan moleküler mekanizmalar halen bilinmemektedir bile, yukarıda belirtilen bulgular, bu hastalıkların birkaç fare modellerinin geliştirilmesi sağladı. Öğrenme ve hafıza noksanlıkları gibi +/- tsc1 +/-, TSC2 olarak, bu fare modellerinde bir dizi tespit edilmiştir,NF1 +/- ve En2 - / - fareler 2,4-7. Nörogelişimsel bozuklukların alanında önemli bir zorluk hücresel ve moleküler süreçler bellek yatan ve disfonksiyonu öğrenme belirlenmesidir. Öğrenme ve bellek sırasında aktive Seçilen sinyal yolları spesifik genlerin transkripsiyonunu neden ve sonuç olarak de novo protein sentezinin yol açabilir. Hemen-Erken genler, (bacakları) aktivasyonu ve protein bağımlı sinaptik değişiklikler hızla nöronal aktivite ve davranışsal eğitim 8,9 yanıt olarak beyin nöronlarının indüklenir.
Nörofibromin içeren sinyal yolları içinde Açıkları nörogelişimsel bozukluklarda bozulmuş öğrenme ile ilişkili bulunmuştur. Nörofibromin olan mutasyon nörofibromatozis tip 1, karmaşık genetik sendrom sinir sistemi tümörleri, davranışsal ve motor gecikme ve bilişsel DISA ile karakterizedir neden olur NF1 geninin ürünüdürhastanın talimatları 10. Önleyici nöronlarla sınırlı NF1 silinmesi için heterozigoz olan fare, MWM 5,11,12 uzun süreli potansiyasyon erken faz (LTP), hem de tehlikeye uzamsal öğrenme eksiklikler göstermektedir. İlginç olarak, bu fare modelinde NF1 eksikliği artan ERK fosforilasyonu ve son olarak bu nöronların 5 GABA serbest anormal bir artışa yol açar, öğrenme sırasında inhibitör Ras sinyallemesinin bir aşırı aktivasyonuna yol açar.
Bu bulgulara dayanarak, davranış görevler sonrasında nöronal aktivitenin görselleştirme nörogelişimsel hastalıklarda rol oynayan spesifik devreleri yeniden bir yol gösterir. Burada açıklanan immünohistokimyası protokolü değerlendirmek ve bilişsel bozukluklar ile ASD fare modelinde MWm aşağıdaki hipokampal ERK fosforilasyon düzeylerini ölçmek hedefliyor. MWM yaygın kemirgenler 13,14 hipokampal bağımlı uzaysal öğrenme ve hafıza araştırmak için kullanılır 15 önemli bir role sahip olduğu gösterilmiştir beri görev bağımlı hipokampal öğrenme moleküler okuma olarak ERK fosforilasyonu kullanmaya karar. Ayrıca, ERK yolu, geliştirme, görsel korteks 16 deneyime bağlı plastisite için gereklidir. Son olarak, MSS gösteride iki ERK izoformu (ERK2) birini eksik fareler ERK sinyal gibi ASD olarak nörogelişimsel bozuklukların patogenezinde kritik bir rol oynayabileceğini belirten, bilişsel, duygusal ve sosyal davranışlar 17 anomalileri kutladı.
Nöro hastalıklar açısından bir model olarak farenin (- / - En2) Biz Engrailed 2 nakavt kullanılır. En2 - / - fareler ön beyin internöronlar 18 kaybı dahil anatomik ve davranışsal "ASD gibi" özellikleri, ASD-ilişkili genlerin 19 azaltılmış ifade göstermek, sosyallik azaldığı ve bozulmuş bilişsel esneklik 6,7,20. Mekansal Learning ve MWM tespit edilenler gibi hafıza kusurları, EN2 özellikle sağlam - / - fareler 6,7 ve ASD hastalarında 21 gözlenen bilişsel bozukluklar ile ilgili olabilir. - / - Yetişkin farelerde 7 Ayrıca, MWM bozulmuş normal süreçlerde indirgenmiş nörofibromin ekspresyonu ile bağlantılı ve EN2 arasında hilusunda pERK düzeylerinde artış olduğunu göstermiştir. İşte biz bu ASD fare modelinde MWm aşağıdaki pERK immunohistokimyasal karakterizasyonu için ayrıntılı bir protokol mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Avrupa Topluluğu Direktifi 2010/63 / AB ile uyumlu yapılmıştır ve İtalyan Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır.
1. Hayvan Bakımı, Konut ve Tedavisi
- İlgili kurum hayvan bakım yönergelerine uygun olarak fareleri kullanarak tüm deneysel protokolleri gerçekleştirin.
- Yiyecek ve su ad libitum ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde hayvanları korumak.
- Ev talaş ve yatak malzemesi ile standart boyutlu polikarbonat fare kafeslerinde 2-4 gruplar, fareler haftada değişti.
- Hastalığa yatkınlık nörogelişimsel bozuklukların farklı fare modellerinde yaş ve cinsiyet ile değişebilir, çünkü yaş ve cinsiyet uyumlu fareler kullanın.
- Istatistiksel olarak anlamlı (davranışsal çalışma için genotip başına 10 fare ve immünohistokimya deney için genotip için 4 farelik bir minimum) ulaşmak için hayvan uygun sayıda seçin.
2. Morris Water Maze (MWM)
- Bir Genelge Tank (çapı 100 cm, yüksekliği 50 cm) kullanın.
- Tankın etrafına oda bölücüler bazı görsel ipuçları yerleştirin.
- Dört hayali kadranın birinin merkezinde sabit bir yerde tankın içine 10 cm çapında bir platform yerleştirin. Tüm eğitim oturumlarında tüm çalışmalar için aynı kadranda gizli platformu tutun.
- Platform su yüzeyinden 1 cm kadar musluk suyu ile havuz doldurun. Dengelenmesi su sıcaklığı 22 ° C'ye yakın olmalıdır; Bu adımı birkaç saat sürebilir. Su sıcaklığını dengeye için gereken süreyi kısaltmak için, sıcak su eklenir.
- Su opak hale getirmek için beyaz, toksik olmayan boya yaklaşık 1.5-2 L ekleyin.
- Parça Toplama İşlemi
- Standart CCD kamera ve video kurulları ile MWm adlı izleme sistemi kurun. Böyle yol uzunluğu gibi çeşitli değişkenler izlemek ve analiz etmek için bir video izleme sistemi seçin escape gecikme ve zaman her kadranda geçirdi.
- Dört kadranda arenada bölün ve canlı izleme hayvanlar ve arka plan arasındaki optimum kontrast sağlamak için algılama ayarlarını.
- Platform bölgeyi belirtin.
- 60 sn maksimum deneme süresini ayarlayın.
- MWM Testi
- Davranış testleri öncesinde, farelere onlar havuz ya da mekansal ipuçları göremiyorum bir alanda 20-25 dakikalık bir adaptasyon dönemi sağlar.
- (Aralarında 20-30 dk aralıklarla, günde iki ardışık denemeler) 9 gün boyunca her fare eğitin.
- Bilgisayar ve fotoğraf makinesini açın ve video izleme sistemi yazılımını başlatmak.
- Kendi kuyruğundan fare atın ve baş dört başlangıç pozisyonları (kuzey, güney, doğu, batı) birinden başlayarak, havuz tarafına doğru işaret ile, suya koyun. Her fare için, başlama pozisyonu ve farklı çalışmalar boyunca pseudorandomized olmalıdır.
- Fare yüzmek edelim ve platf arama60 saniyelik bir süre için biçiminde olabilecektir. Hayvan platformu ulaştığında, 20 saniye platformda kalmak için izin verir.
- Fare bu süre içinde platformu bulmak için başarısız olursa, nazikçe kuyruğunu tutarak, platforma fare rehberlik ve 20 saniye boyunca orada kalmak için izin verin. Hayvan hepsi iki denemeler tamamlandıktan sonra, bir havlu ile kurulayın ve kafes içine geri koymak.
- Eğitim süresinin her gün, aynı prosedürü (adımları 2.3.4-2.3.6) tekrarlayın.
- Geçen eğitim iz gün sonra 9 prob testi yapın.
- Havuzdan platformu çıkarın.
- Fare yüzmek edelim ve 60 saniye maksimum platformu için arayın.
- Periyodik olarak, aynı (22 ° C) olmalıdır, böylece su sıcaklığını kontrol edin ve havuz temizlemek.
Perfüze Animals Bölüm 3. hazırlanması
- MWM sonunda fareler kurban. Genotip başına dört fare euthaniz öncesinde anestezi gerekiryerel ve uluslararası kılavuzlara göre Ation.
- (Kanama izin vermek için bir makas auriclewith doğru kesilir ve serpmek için sol ventrikül içine, bir kelebek kanül tanıtmak) transkardiyal hayvan serpmek 10-15 PBS içinde% 4 paraformaldehid, ardından fosfat tamponlu tuzlu su, 4-5 dakika boyunca (PBS) ile dk 22.
- Inceleyin ve en az 12 saat süre ile 4 ° C 'de% 4 paraformaldehid içinde beyinleri sonrası sabitleyin.
- Dilimleme için gerekli olana değin 4 ° C'de 15 0.1 M PBS,% 0.02 sodyum azid ilave edildi ve deposu ihtiva eden 50 ml polistiren konik tüplerde beyinleri yerleştirin.
- Kes ve vibratome kesme önce beyincik çıkarın.
- Vibratome sahibi plaka üzerine, yapıştırıcı kullanarak, kesme site beyin dik Tutkal.
- Uygun vibratome üzerine, dorsal hipokampusun boyunca seri sırayla, 20-40 mikron kalınlığında koronal bölüme beyin kesin.
- Bir boya fırçası ile vibratome dilim toplayın ve 2 aktarmakHer bir kuyu için 0.1 M PBS içinde 1 ml ihtiva eden 4, çok-yuvalı plaka.
- 4 ºC PBS içinde% 0.02 Sodyum Azid içinde PBS içinde kısa vadede veya uzun vadede mağaza bölümleri (doku kadar bir yıl süreyle kullanılmış olabilir).
4. İmmünhistokimya
- Aktarım her bir kuyu için, 0.1 M 500 ul PBS içeren 24 çok oyuklu bir plakaya her bir fare için 3-5 dorsal hipokamp bölümleri.
- 0.1 M PBS içinde 500 ul (5 dakika, hafifçe çalkalanarak 3 kez) ile her yuva içinde yer alan bölümleri yıkayın.
- Hafifçe çalkalama ile 20 dakika boyunca PBS içinde% 1 H2 O 2 bölümleri inkübe edilerek, bir endojen peroksidaz etkinliğini Quench.
- Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın.
- Doku geçirgenliği: PBS içinde% 0.2 Triton X-100, 5 dakika için bölümler inkübe edin.
- Yukarıdaki adımlarda (4.4; 4.5) içinde, (numbe tüm deney için yeterli engelleme tamponu (PBS içinde% 10 keçi serumu ve% 0.1 Triton-X100) yapmakbölümlerin R x 100 ul x 3 adım).
- Not: (biyotine konjüge edilmiştir), ikincil antikor yapıldığı aynı türden kullanımlar serumu.
- Hafifçe çalkalama ile oda sıcaklığında (RT) 1 saat süre ile tampon (100 ul / bölümü) engelleme bölümleri inkübe edilerek spesifik olmayan antikorun bağlanmasını önler.
- Hafifçe çalkalama ile, gece boyunca 4 ° C 'de, bloke edici tampon içinde seyreltilmiş primer Ab (pERK) bölümleri inkübe edin.
- Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın.
- Hafifçe çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat için (adım 4.6 de kullanılan aynı) blokaj tamponunda seyreltilmiş: biyotin (250 1) ile konjüge edilmiş sekonder Ab kuluçkalayın.
- Avidin ve biyotin kompleksi, oda sıcaklığında en az 30 dakika gerektirir, çünkü, aynı zamanda, ABC reaktifi hazırlayın.
- Üreticilerin protokole göre ABC reaktifi gerekli hacmi hazırlayın.
- Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın.
- IncubatABC reaktifi ile oda sıcaklığında 45 dakika boyunca E bölümleri.
- Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın.
- DAB çözümü çalışma hazırlayın DAB karsinojenik ve teratojenik olduğu gibi, DAB içeren her adımda davlumbaz yapılmalıdır.
- Plastik bir transfer pipet yeni bir plaka DAB çözüm aktarın.
- Elle çözüm ve yavaş yavaş girdap plaka çalışma DAB içeren plaka yerleştirin bölümleri, bölümlere maksimum etkiyi sağlamak için.
- Yeterli sinyal gelişene kadar mikroskop DAB reaksiyonu (2-5 dk) izleyin.
- 0.1 M PBS (3 x 5 dk) doku yıkanarak istenen renk yoğunluğuna reaksiyonu durdurun.
- Gecede davlumbaz kalan DAB substrat solüsyonu devre dışı bırakmak ve laboratuvar kurallarına göre onu imha etmek için çamaşır suyu kullanın.
- Jelatin Mount bölümler PBS yüzen slaytlar kaplı. Sonra oda sıcaklığı en az 3-4 saat sonra kurutun.
- % 50 kısımları, kurutmak,% 70,% 95% 100 2 dakika her biri için etanol ve 5 dakika için% 100 ksilen açık ve.
- Montaj orta kullanarak lamel ve gece boyunca kurumaya davlumbaz bırakın.
5. Hücre Sayısı
- Sayım pERK-pozitif hücreler, dorsal hipokamp seviyesinde 3-5 bölümler hayvan başına analiz edilmelidir.
- Uygun bir mikroskop kullanılarak 200X büyütmede her bölüm birden fazla parlak alan görüntüler elde, ve daha sonra bir görüntü işleme yazılımı kullanarak bunları bir araya.
- ImageJ özgür yazılım kullanarak tiff-dönüştürülmüş mozaik görüntülerde hücre sayımı gerçekleştirin.
- 100 × 100 um her 2-3 sayma kutuları üzerinde hilus ve granül hücre tabakasında pERK lekeli hücreleri saymak.
- Hücre yoğunlukları sayma penceresi (100 x 100 um) ortalama işaretli hücrelerin sayısı olarak ifade edilecektir.
- Genotipleri arasında anlamlı farklılık değerlendirmek için istatistiksel analiz gerçekleştirin. Bu Öğrenci t yapılabilirTest veya ANOVA ticari yazılımları kullanarak uygun post hoc testi ile izledi. P <0.05 Set istatistiksel anlamlılık düzeyi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan protokol imünohistokimya ile, görselleştirmek için tasarlanmıştır, nöro bozuklukların bir fare modelinde MWM sonra hipokampal nöron aktivitesi belirli bir markör ifade. Burada gösterilen tüm deneysel veriler bizim son işten 7 alınmıştır. Erkek ve kadın WT ve En2 - / - (3-5 aylık; ağırlık = 25-35 gr) yaştaki erişkin litermatlarının heterozigot çiftleşmelerin elde kullanılmıştır. Yirmi iki fareleri (genotip için 11) MWM kullanılmıştır. Sekiz fareleri (genotip başına 4) MWM sonda deneme sonunda kurban ve immunohistokimyasal deneyleri için kullanılmıştır.
EN2 mekansal öğrenme eksikliklerinin değerlendirilmesi - / - fareler
- / - Özellikle EN2 uzamsal öğrenmeyi kusurların varlığını incelemek için farelerde biz MWM testi, klasik bir hipokampusa bağlı normal süreçlerde görev 13,14 kullanılır. Eğitim etk 1. günündeg denemeleri, gecikme ve hız yüzmek farklılık en2 arasında tespit edilmiştir - / - ve WT fareler, her iki genotip benzer görsel ve motor performansı göstermek düşündürmektedir. Tüm deney grupları yollar boyunca öğrenme yeteneğini göstermiştir bile, En2 - / - fareler golü az verimli daha 3. antrenman günden itibaren 7 WT fareler ulaştı. Gizli bir platform havuzdan çıkarıldı prob deneme (gün 9), günü, WT fareler (Şekil 1A), beklenen hedef konuma (noktalı siyah kutu) bir yönlendirilmiş yol-navigasyon gösterdi En2 ise - / - fareler (Şekil 1B ) hedef kadranda bir dolaşıp yolu (noktalı siyah kutu) görüntüleme, daha düzensiz yüzdü. / - - Mutantlar (Şekil 1C) (tek yönlü ANOVA Holm-Sidak post-hoc testi ile takip * p = 0.027, ** p = en2 kıyasla Ayrıca, sonda duruşma sırasında WT fareler, platforma yakın yakınlığı gösterdi 0.007). yakınlık puanı eşGeleneksel tedbirler (zaman geçirdim ve hedef kadranda 23 geçişleri sayısı) daha grup farklılıklarını tespit etmek için daha duyarlı nsidered.
EN2 hipokampal ERK fosforilasyon deregülasyon - / - MWM görev sonra fareler
ERK fosforilasyonunu incelemek için, biz sonra WT ve en2 hipokampal subfield bir immünohistokimyasal boyanma gerçekleştirilen - / - MWM (Şekil 2A) sonra fareler. (Şekil 2B - C Student t testi, p = 0,0108) WT ile karşılaştırıldığında, fareler - / - pERK-pozitif CA3 nöron sayısı en2 anlamlı olarak düşüktü. WT (Şekil 2B, D Student t testi, p = 0,0012) ile karşılaştırıldığında, fareler - / - Tersine, pERK pozitif nöronların önemli ölçüde daha fazla sayıda EN2 bir hilus mevcuttu. Buna ek olarak, pERK pozitif nöronların önemli ölçüde daha çok sayıda, aynı zamanda inci saptandı WT kontrol (Şekil 2B, E Student t testi, p = 0,0021) ile karşılaştırıldığında fare, - / - EN2 dentat girusun tanecik hücre katmanlarında E (GCL).
Şekil 1:. En2 - / - fareler Morris su labirentinde bozulmuş uzamsal öğrenmeyi göstermek (A - B) Resimler WT beklenen bir platform konumuna yolu navigasyon (noktalı siyah kutu) göstermek, WT (A) ve en2 içinde - / - prob deneme sırasında (B) fareler. (C) Yakınlık sensörü duruşma sırasında hedef ve zıt kadranda platforma. Kısaltmalar ve semboller: T, hedef kadranda; OP, kadran tersi hedef; * P <0.05, ** p <0.01 (tek yönlü ANOVA Holm-Sidak post-hoc testi ile takip n = 11 genotip başına). Ref 7 modifiye.om / files / ftp_upload / 52919 / 52919fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: MWM eğitimli WT ve en2 hipokampus pERK boyama - / - farelerde (A) bütün dorsal Hipokampuslardan Temsilcisi pERK immunostaings.. PERK (B) Ayrıntılar CA3 immün ve dentat (A) 'daki ile aynı fareleri gyrus. Beyaz ok uçları pERK pozitif nöronlarının örnekleri göstermektedir. Genotip olarak belirtilmiştir. Kısaltmalar: CA3, CA3 piramidal tabakası; GCL, granül hücre tabakası. Ölçek çubukları: 300 um (A), 150 um (B). (Cı - E) MWM eğitimli WT ve EN2 CA3 (C), hilus (D) GCL (E) pERK pozitif nöronlarının sayılması,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
/ - - Fareler, nörogelişimsel bozuklukların fare modelini Burada, biz nöronal en2 içinde MWm aşağıdaki aktivasyon ifşa ettiği için bir pERK immünhistokimya protokol sağlar. / - - PERK düzeylerinin azalması en2 CA3 subfield tespit edilmiştir mutantlar WT ile karşılaştırıldığında. Farklı CA3 alt alanına, pERK pozitif nöronlarının genel bir artış gözlenen ne yerine iki hilus saptanmış ve EN2 bölgesinin GCL - / - fareler WT ile karşılaştırıldığında. ERK fosforilasyon düzeylerindeki bu tam tersi bir eğilim muhtemel bir açıklaması, aşağıdaki MWM pERK indüksiyon alt alan spesifik mekanizmalar kullanan olabilir.
protokol, MWM verilerine beyin sabitleme, seçim ve antikorun kalibrasyonu, yıkama işlemleri, sinyal tespiti ve hücre sayım prosedürünün değerlendirmesine gibi birçok kritik adımlar içerir. Tüm bu kritik adımlar dikkatle yüksek kalite ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için yapılmalıdır. Örneğin, beyin n ise,(3.2 ve 3.3 adımları) düzgün bir şekilde monte ot, bölümler kolayca boyama işlemleri sırasında gözyaşı olacak. Ayrıca, bölümler boyama düşük sinyal önlemek için yıkama adımları sırasında herhangi bir noktada kurumasına olmamalıdır. Burada bildirilen daha pERK antikor eğer farklıysa Son olarak, en sağlam ve uygun koşulları belirlemek amacıyla antikor konsantrasyonunu ve inkübasyon süresi hem kalibre etmek önemlidir, kullanılan (Malzeme listesi bakınız). Ayrıca, immünhistokimya deneyleri için doğru ve tarafsız bir sonuç sağlamak için, bu MWM testi ve hücre sayımı hem hayvanın genotipi ya da farmakolojik tedaviye kör operatörleri tarafından yapılacaktır kritik öneme sahiptir. pERK pozitif nöron ayrıca uygun bir florofora konjüge edilmiş ikincil antikor ile immünofloresan boyama ile saptanabilir. Bu bağlamda, endojen peroksidazların (adım 4.3) ve söndürme atlayarak (ste floresan boyalar korumak için montaj medya bir sulu kullanım için gerekli olanp 4.24).
Şimdiye kadar, hemen erken gen (IEG) sentezlenmesi yaygın olarak görev bağımlı hipokampal 24 öğrenme bir molekül imza olarak kullanılmıştır. Bu esas olarak, in situ hibridizasyon ve immünohistokimya, c-fos mRNA tarafından ele alınmıştır. Tersine, birkaç immünohistokimyasal çalışmalar sistematik olarak nörogelişimsel bozuklukların fare modellerinde ERK fosforilasyonu ele alarak nöronal aktivitenin hitap etti. PERK immün olarak gösterilen son çalışması 7 ve önceki çalışması 5 öğrenme ve hafıza katılan hipokampal nöronal devreleri izlemek için güvenilir bir göstergedir. Bu tekniğin bir sınırlama olarak sonuçlar değişeceğinden artırabilecek bir çok önemli aşamalar ile temsil edilmektedir. Bununla birlikte, burada sunulan deneysel yaklaşım, genetik ya da farmakolojik fare modelleri hem hipokampal nöron aktivasyon profil nasıl bir özlü, kolay takip anahat araştırmacılara sağlarbilişsel bozukluklar ile karakterize edilir. Daha genel olarak, bu protokol de MWM farklı bilişsel davranışçı görevlerde nöronal aktivitenin araştırılması ve potansiyel bilişsel işlevler yer alan diğer beyin bölgelerine nöronal aktivasyon eşleştirmek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok
Acknowledgments
Biz yardım için CIBIO (Trento Üniversitesi) ve CNR Nörobilim Enstitüsü idari personeline teşekkür etmek istiyorum. Giovanni Veronesi Provenzano Fondazione (Milan, İtalya) doktora sonrası bursu ile desteklenmektedir. Bu eser İtalyan Üniversitesi Bakanlığı ve Araştırma (PRIN 2008 hibe # YB ile 200894SYW2_002 ve PRIN 2010-2011 hibe # 2010N8PBAA_002), Trento Üniversitesi (YB için CIBIO start-up hibe) ve Telefon Kurumu (hibe # GGP13034 tarafından finanse edildi YB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
| Tempera Paint | Giotto - Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
| 24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
| Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
| Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
| Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
| ImageJ Software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |
References
- Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
- Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
- West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
- Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
- Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914 (2012).
- Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
- Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
- Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
- Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
- Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
- Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
- Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
- Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
- Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
- Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51 (2013).
- Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
- Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
- Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).
- Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).
