Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ויזואליזציה immunohistochemical של היפוקמפוס Neuron פעילות לאחר מרחבי למידה במודל עכבר של הפרעות נוירו-התפתחותי

Published: May 12, 2015 doi: 10.3791/52919
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1,2
1Centre for Integrative Biology (CIBIO), University of Trento, 2CNR Neuroscience Institute, Pisa, Italy

Summary

אנו מתארים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה ללמוד את הפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בעקבות חשיפה למשימה למידה מרחבית במודל של עכברים מתאפיינים בליקויים קוגניטיביים ממוצא התפתחות נוירולוגית. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על שני המודלים של העכברים גנטיים או תרופתיים המאופיין בליקויים קוגניטיביים.

Abstract

אינדוקציה של קינאז phosphorylated מוסדר תאי (הטבה) היא קריאת נתונים מולקולריות אמינה של הפעלה עצבית למידה תלויה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה הטבה ללמוד את הפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בעקבות חשיפה למשימה למידה מרחבית במודל של עכברים מתאפיינים בליקויים קוגניטיביים ממוצא התפתחות נוירולוגית. באופן ספציפי, אנחנו משמשים immunostaining ההטבה ללמוד הפעלה עצבית הבאות מבוך המים מוריס (MWM, משימת למידה בהיפוקמפוס תלוי קלסית) בEngrailed-2 נוקאאוט (En2 - / -) עכברים, מודל של הפרעות ספקטרום האוטיסטי (ASD). בהשוואה לפרא-סוג פקדים (WT), En2 - / - עכברים הראו גירעונות למידה מרחבית משמעותיים בMWM. לאחר MWM, הבדלים משמעותיים במספר תאי עצב הטבה חיובי אותרו בתת תחומים ספציפיים בהיפוקמפוס של En2 - / - עכברים, בהשוואה לבעלי החיים WT. כך, הפרוטוקול שלנו יכול וחסונה לזהות הבדלים בנוירונים הטבה חיוביים הקשורים לירידת ערך למידה בהיפוקמפוס תלוי במודל עכבר של ASD. באופן כללי יותר, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם לחקור את הפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בשני המודלים של העכברים גנטיים או תרופתיים המאופיין בליקויים קוגניטיביים.

Introduction

הפרעות התפתחותיות כוללות קבוצה רחבה והטרוגני של הפרעות כגון תסמונת דאון, תסמונת X השביר (FXS), תסמונת רט, נוירופיברומטוזיס, טרשת גבשושית וASD, שבפיתוח וההבשלה של מערכת העצבים המרכזית (CNS) מופרעת מוקדם במהלך התקופה טרום לידה 1. תפקוד המוח התפתחותית אלה יכול לגרום לתופעות עמוקות, לכל החיים על תפקוד מוטורי, שפה, למידה ותהליך הזיכרון. שפע של גורמים גנטיים וסביבתיים היה מעורב בפתוגנזה של הפרעות התפתחותיות במהלך השנים האחרונות 2,3. גם אם המנגנונים המולקולריים שבבסיס הפנוטיפ הקליני אינו ידועים, הממצאים הנ"ל אפשרו הפיתוח של מספר מודלים עכבר של הפרעות אלה. גירעונות למידה וזיכרון זוהו במספר המודלים האלה עכבר כגון Tsc1 +/-, Tsc2 +/-,NF1 +/- וEn2 - / - עכברים 2,4-7. אתגר חשוב בתחום של הפרעות התפתחותיות הוא זיהוי של תהליכים תאיים ומולקולריים שבבסיס זיכרון ולמידת תפקוד לקוי. מסלולי איתות נבחרים הופעלו במהלך למידה או זיכרון יכולים לגרום לשעתוק של גנים ספציפיים וסופו של דבר להוביל לדה נובו סינתזת חלבון. שינויים סינפטיים גנים מיידיים-מוקדם הפעלה (IEGs) וחלבון תלוי מושרים במהירות בתאי עצב במוח בתגובה לפעילות עצבית ואימון התנהגותי 8,9.

גירעונות במסלולי איתות מעורבים neurofibromin נקשרו עם למידה לקויה בהפרעות התפתחותיות. Neurofibromin הוא התוצר של גן NF1, מוטציה שגורם לסוג 1 נוירופיברומטוזיס, תסמונת גנטית מורכבת מאופיינת בגידולים של מערכת עצבים, עיכובים התנהגותיים ומוטוריים, וDisa קוגניטיביתbilities 10. הטרוזיגוטיים עכברים למחיקת NF1 המוגבלים לנוירונים מעכבים להראות גירעונות בשלב המוקדם של הגברה לטווח ארוך (LTP), כמו גם למידה מרחבית נפגעה בMWM 5,11,12. מעניין לציין, חוסר NF1 במודל עכבר זה מוביל להפעלת יתר של איתות ראס בinterneurons המעכבת במהלך למידה, וכתוצאה מכך זירחון ERK גדל ולבסוף בשיפור חריג של שחרור GABA מהנוירונים האלה 5.

בהתבסס על ממצאים אלה, להדמיה של פעילות עצבית לאחר משימות התנהגותיות מייצגת דרך לשחזר מעגלים ספציפיים מעורבים במחלות נוירו-התפתחותי. פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה המתואר כאן מטרה להעריך ולכמת רמות זירחון ERK היפוקמפוס הבאות MWM במודל עכבר ASD עם ליקויים קוגניטיביים. MWM נעשה שימוש נרחב לחקור למידה בהיפוקמפוס תלויה במרחב ובזיכרון במכרסמים 13,14 15. יתר על כן, מסלול ERK הוא הכרחי לפלסטיות ניסיון תלוי בפיתוח החזותית 16 הקליפה. לבסוף, עכברים חסרי אחד משני ERK isoforms (ERK2) בתכנית של מערכת העצבים המרכזית מסומנים חריגות בהתנהגות קוגניטיבית, רגשית וחברתית 17, מצביעים על כך שאיתות ERK עשויה לשחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של הפרעות התפתחותיות כגון אוטיזם.

השתמשנו Engrailed 2 נוקאאוט (En2 - / -) עכברים כמודל של הפרעות התפתחותיות. En2 - / - עכברים להראות תכונות אנטומיים והתנהגות "כמו-ASD", לרבות אובדן interneurons המוח הקדמי 18, ביטוי מופחת של גנים הקשורים-ASD 19, ירד חברותיות, וגמישות מחשבתית לקויה 6,7,20. learni מרחביng ופגמי זיכרון, כמו אלה שהתגלו בMWM, הם חזקים במיוחד בEn2 - / - עכברי 6,7 ועשוי להיות רלוונטי לליקויים קוגניטיביים שנצפו בחולי ASD 21. יתר על כן, הראתה שהלמידה מרחבית לקויה בMWM קשורה ביטוי neurofibromin מופחת ורמות גבוהות הטבה בhilus של En2 - / - עכברים בוגרים 7. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול מפורט לאפיון immunohistochemical של ההטבה הבאה MWM במודל עכבר ASD זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם להוראה האירופית קהילת 2010/63 / האיחוד האירופי ואושרו על ידי משרד בריאות האיטלקי.

1. טיפול בבעלי חיים, שיכון וטיפול

  1. לבצע את כל פרוטוקולי הניסוי באמצעות עכברים בהתאם להנחיות של הטיפול בבעלי החיים המוסדי בהתאמה.
  2. לשמור על בעלי חיים בשעתי אור 12 / מחזור כהה עם אוכל וכרצונך מודעה זמין מים.
  3. בית העכברים בקבוצות של 2-4, בכלובי עכבר פוליקרבונט בגודל סטנדרטי עם נסורת וחומר מצעים מוחלפים מדי שבוע.
  4. השתמש גיל ועכברים בהתאמה מין, בגלל רגישות למחלה יכולה להשתנות עם גיל ומין במודלים של עכברים שונים של הפרעות התפתחותיות.
  5. בחר מספר מתאים של בעלי חיים הגיע למשמעות סטטיסטית (מינימום של 10 עכברים לכל גנוטיפ לחקר ההתנהגות ו4 עכברים לכל גנוטיפ לניסוי אימונוהיסטוכימיה).

2. מבוך מוריס מים (MWM)

  1. השתמש טנק חוזר (100 סנטימטרים קוטר, גובה 50 סנטימטרים).
    1. מניחים כמה רמזים חזותיים בחדר מחוגה סביב הטנק.
    2. מניחים פלטפורמת קוטר 10 סנטימטרים לתוך הטנק במיקום קבוע במרכזו של אחד מארבעה רביעים דמיוניים. שמור את הפלטפורמה מוסתרת באותו רביע לכל ניסויים בכל האימונים.
    3. מלא את הבריכה במים ברז עד לפלטפורמה היא 1 סנטימטר מעל פני מים. טמפרטורת מים לאזן צריכה להיות קרובה ל 22 מעלות צלזיוס; צעד זה עשוי להימשך מספר שעות. מוסיף מים חמים כדי לקצר את הזמן הנדרש כדי לאזן את טמפרטורת מים.
    4. להוסיף כ 1.5-2 ליטר של צבע לבן, שאינו רעיל כדי להפוך את המים אטומים.
  2. מסלול רכישת נוהל
    1. הגדר את מערכת המעקב של MWM עם מצלמות CCD סטנדרטיים ולוחות וידאו. בחר מערכת וידאו-מעקב למעקב וניתוח מספר משתנה כגון אורך דרך, escaחביון PE, ואת המשך זמן בכל רבע.
    2. מחלקים את הזירה בארבעה רביעים ולהתאים את הגדרות זיהוי כדי להבטיח ניגוד אופטימלי בין בעלי חיים ורקע למעקב בשידור חי.
    3. ציין את אזור הפלטפורמה.
    4. קבע את זמן משפט המרבי 60 שניות.
  3. MWM בדיקה
    1. לפני בדיקת התנהגות, תאפשר עכברי תקופת הסתגלות של 20-25 דקות באזור שבו הם לא יכולים לראות את הבריכה או רמזים מרחביים.
    2. לאמן את כל עכבר ל9 ימים (שני משפטים רצופים ביום, עם 20-30 דקות מרווח ביניהם).
    3. הפעל את המחשב ואת המצלמה ולהפעיל את תוכנת מערכת מעקב וידאו.
    4. קח את העכבר בזנבו ולמקם אותו לתוך מים, עם הראש שלה הצביע לעבר הצד של בריכה, החל מאחד מארבעת מיקומי ההתחלה (צפון, דרום, מזרח, מערב). לכל עכבר, את מיקום ההתחלה צריך להיות שונה וpseudorandomized פני ניסויים.
    5. בואו לשחות העכבר ולחפש platfORM למקסימום של 60 שניות. ברגע שבעלי החיים מגיעים לפלטפורמה, לאפשר לו להישאר על הפלטפורמה במשך 20 שניות.
    6. אם עכבר לא הצליח לאתר את הפלטפורמה בפרק זמן זה, בעדינות להנחות את העכבר לפלטפורמה, מחזיק אותו בזנבו ולתת לו להישאר שם במשך 20 שניות. ברגע שבעלי החיים השלים כל שני ניסויים, לייבש אותו במגבת והחזרת אותו לכלוב.
    7. כל יום בתקופת ההכשרה, לחזור על אותה הפרוצדורה (צעדי 2.3.4-2.3.6).
    8. בצע את בדיקת הבדיקה ביום 9 אחרי השביל האימונים האחרון.
    9. הסר את הפלטפורמה מהברכה.
    10. בואו לשחות העכבר ולחפש את הפלטפורמה למקסימום של 60 שניות.
    11. מעת לעת, לבדוק את טמפרטורת המים, כך שהוא צריך להיות זהה (22 מעלות צלזיוס) ולנקות את הבריכה.

3. הכנת סעיפים מבעלי חיים perfused

  1. להקריב את העכברים בסוף MWM. ארבעה עכברים לכל גנוטיפ חייבים להיות מורדמים לפני euthanizני על פי הנחיות בינלאומיות ומקומיות.
  2. Perfuse בעלי החיים transcardially (לחתוך את זכות auriclewith מספריים כדי לאפשר דימום ולהציג את צינורית פרפר לתוך החדר השמאלי לינקבו) עם מי מלח פוספט (PBS) במשך 4-5 דקות, ואחריו paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS במשך 10-15 22 דקות.
  3. לנתח ופוסט-לתקן את המוח paraformaldehyde 4% ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 12.
  4. מניחים את המוח בצינורות 50 מיליליטר חרוטי קלקר המכילים 15 מיליליטר של 0.02% נתרן יזיד 0.1 M PBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד דרוש לחיתוך.
  5. לחתוך ולהסיר את המוח הקטן לפני vibratome חיתוך.
  6. מדביקים את המוח זקוף עם אתר החיתוך, באמצעות דבק מגע, על צלחת בעל vibratome.
  7. חותך את המוח ל20-40 מיקרומטר סעיפי עטרה עבה, כדי סידורי ברחבי ההיפוקמפוס הגב, על vibratome המתאים.
  8. לאסוף vibratome פרוסות עם מברשת צבע ולהעביר ל24 צלחת רב גם מכילה 1 מיליליטר של 0.1 מ 'PBS לכל אחד.
  9. חלקי חנות לטווח קצר בPBS או ארוך טווח ב0.02% נתרן יזיד PBS ב 4 מעלות צלזיוס (רקמה עשויות לשמש לעד שנה).

4. אימונוהיסטוכימיה

  1. העברה 3-5 חלקים הגבי בהיפוקמפוס לכל עכבר, ל -24 צלחת רב גם מכילה 500 μl של 0.1 מ 'PBS לכל אחד.
  2. שטוף את החלקים כלולים בכל טוב עם 500 μl של 0.1 מ 'PBS (5 דקות, 3 פעמים עם רעד עדין).
  3. להרוות פעילות peroxidase אנדוגני, על ידי דוגרים סעיפים ב 1% H 2 O 2 ב PBS במשך 20 דקות עם תסיסה עדינה.
  4. לשטוף חלקים ב 0.1 M PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות).
  5. Permeabilization של רקמה: דגירה סעיפים 5 דקות ב0.2% Triton X-100 ב PBS.
  6. במהלך השלבים לעיל (4.4; 4.5), לעשות מספיק חיץ חסימה (10% עיזים סרום ושל 0.1% Triton-X100 בPBS) לניסוי כולו (number סעיפים x 100 x μl 3 שלבים).
  7. הערה: השתמש בסרום מאותו המין שבי Ab המשני (מצומדת לביוטין) נעשה.
  8. למנוע שאינו ספציפי מחייב של הנוגדנים, על ידי דוגרים סעיפי חסימת חיץ (100 μl / סעיף) לשעה 1 בטמפרטורת חדר (RT) עם תסיסה עדינה.
  9. סעיפי דגירה בAb העיקרי (הטבה) בדילול בחסימת מאגר, הלילה ב 4 מעלות צלזיוס, עם תסיסה עדינה.
  10. לשטוף חלקים ב 0.1 M PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות).
  11. דגירה עם Ab המשני מצומדות עם ביוטין (1: 250) בדילול בחסימת מאגר (זהה לשימוש בשלב 4.6) במשך שעה 1 ב RT עם תסיסה עדינה.
  12. הכן מגיב ABC באותו הזמן, כי avidin וביוטין דורשים לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר למתחם.
  13. הכן את הנפח הנדרש של מגיב ABC על פי הפרוטוקול של יצרנים.
  14. לשטוף חלקים ב 0.1 M PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות).
  15. Incubatסעיפי דואר במשך 45 דקות ב RT עם ABC מגיב.
  16. לשטוף חלקים ב 0.1 M PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות).
  17. הכן DAB עובד פתרון, כל צעד הכרוך בDAB חייב להיעשות במנדף כמו DAB הוא מסרטנת וטרטוגניות.
  18. העבר את פתרון DAB לצלחת חדשה על ידי פיפטה העברה פלסטיק.
  19. סעיפי מקום בצלחת המכילה DAB עובד פתרון וצלחת מערבולת לאט ביד, על מנת לאפשר חשיפה המרבית לחלקים.
  20. צג תגובת DAB במיקרוסקופ עד אות מספקת מתפתחת (2-5 דקות).
  21. לעצור את התגובה בעוצמת הצבע הרצויה על ידי שטיפה ברקמת 0.1 M PBS (3 x 5 דקות).
  22. להשתמש באקונומיקה כדי לבטל כל פתרון מצע DAB שנותר במנדף לילה ולהיפטר ממנו על פי הנחיות מעבדה.
  23. חלקי הר על ג'לטין מצופים שקופיות על ידי צף בPBS. לאחר מכן לייבש אותם בטמפרטורת חדר שעות לפחות 3-4.
  24. מייבש את רצף הקטעים ב -50%, 70%, 95%ואתנול 100% עבור 2 דקות כל אחד, וברור בקסילן 100% במשך 5 דקות.
  25. Coverslip באמצעות הרכבה בינונית ולהשאיר במנדף לייבוש למשך הלילה.

רוזן 5. סלולארי

  1. ספירת תאי הטבה חיובית, 04:57 חלקים ברמה של ההיפוקמפוס הגב צריכים להיות מנותחים לכל בעלי חיים.
  2. לרכוש תמונות בהירה שדה מרובים מכל חלק בהגדלה 200X באמצעות מיקרוסקופ מתאים, ולאחר מכן להרכיב אותם באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.
  3. לבצע ספירת תאים בתמונות פסיפס-יומר TIFF באמצעות התוכנה חופשית ImageJ.
  4. ספירת תאים צבעוניים הטבה בשכבת תאי hilus וגרגיר מעל 02:58 תיבות ספירה של 100 × 100 מיקרומטר כל אחד.
  5. צפיפות התא תבוא לידי ביטוי כמספר התאים שכותרתו לחלון ספירה (100 × 100 מיקרומטר).
  6. ביצוע ניתוחים סטטיסטיים כדי להעריך הבדל משמעותי בין גנוטיפים. זה יכול להיות מושלם עם לא של הסטודנטיםבדיקה או ניתוח השונה ואחריו מבחן הפוסט הוק המתאים באמצעות תוכנות מסחריות. רמה שנקבעה סטטיסטית משמעות בp <0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר כאן נועד להמחיש, על ידי אימונוהיסטוכימיה, הביטוי של סמן ספציפי של פעילות הנוירון היפוקמפוס לאחר MWM במודל עכבר של הפרעות התפתחותיות. כל נתוני הניסוי הראו זאת נלקחו מהעבודה האחרונה שלנו 7. WT זכר והנקבה וEn2 - / - המלטה באותו הגיל מבוגר (בן 3-5 חודשים; משקל = 25-35 ז) שהתקבלה מהזדווגויות הטרוזיגוטיים היו בשימוש. עשרים ושניים עכברים (11 לכל גנוטיפ) שמשו לMWM. שמונה עכברים (4 לכל גנוטיפ) הוקרבו בסוף משפט הבדיקה MWM ומשמשים לניסויי אימונוהיסטוכימיה.

הערכה של גירעונות למידה מרחבית בEn2 - / - עכברים

במיוחד כדי לבחון את הנוכחות של גירעונות למידה מרחבית בEn2 - / - עכברים, השתמשנו במבחן MWM, משימת למידה מרחבית קלסית בהיפוקמפוס תלוי 13,14. ביום 1 של טרייניןניסויים גרם, לא נמצא הבדלים בחביון ולשחות במהירות זוהו בין En2 - / - והעכברים WT, המצביעים על כך שני גנוטיפים להראות ביצועים חזותיים ומוטוריים דומים. גם אם כל קבוצות הניסוי הוכיחו את היכולת ללמוד במסלולים, En2 - / - עכברים הגיעו למטרה בצורה פחות יעיל מאשר עכברי WT החל מיום האימונים -3 7. במשפט בדיקה (יום 9), כאשר הפלטפורמה הנסתרת הוסרה מהמאגר, עכברי WT (איור 1 א) הראו נתיב ניווט מופנה למיקום הצפוי היעד (קופסא שחורה מנוקדת), ואילו En2 - / - עכברים (איור 1 ) שחו יותר סדיר, בו מוצגות נתיב נדודים לרבע היעד (קופסא שחורה מנוקדת). יתר על כן, במהלך משפט הבדיקה עכברי WT הראו קרבה קרובה יותר לפלטפורמה, בהשוואה לEn2 - / - מוטציות (איור 1 ג) (בכיוון אחד ANOVA ואחריו מבחן פוסט-הוק הולם-Sidak, p = 0.027 *, ** p = 0.007). הציון הקרבה הוא שיתוףnsidered רגיש יותר לזיהוי הבדלים בין קבוצות מאשר אמצעים מסורתיים (המשך זמן ומספר המעברים ברבע היעד 23).

הסרת הפיקוח של זירחון ERK בהיפוקמפוס בEn2 - / - עכברים לאחר משימת MWM

כדי לבחון זירחון ERK, אז אנחנו ביצענו מכתים immunohistochemical בתת-תחום בהיפוקמפוס של WT וEn2 - / - עכברים לאחר MWM (איור 2 א). מספר הנוירונים CA3 ההטבה החיוביים היה נמוך באופן משמעותי בEn2 - / - עכברים, לעומת WT (מבחן t של סטודנט, p = 0,0108; איור 2 - C). לעומת זאת, מספר גבוה באופן משמעותי של תאי עצב הטבה חיוביים היה נוכח בhilus של En2 - / - עכברים, לעומת WT (מבחן t של סטודנט, p = 0,0012; איור 2, ד). בנוסף, מספר גבוה משמעותי של תאי עצב ההטבה חיוביים היה גם זוהה בה שכבת דואר תא גרגיר (GCL) של הרכס המשונן של En2 - / - עכברים, בהשוואה לקבוצת ביקורת WT (מבחן t של סטודנט, p = 0,0021; איור 2, E).

איור 1
איור 1:. En2 - / - עכברים להראות למידה מרחבית לקויה במבוך המים של מוריס - תמונות (B) מראות WT הדרך-הניווט למיקום הפלטפורמה הצפוי (הקופסה שחורה מנוקדת), בWT () וEn2 - / - עכברים (ב) במהלך משפט בדיקה. (ג) קירבה לפלטפורמה ביעד ורביעים מול במהלך משפט בדיקה. קיצורים וסימנים: T, הרבע היעד; OP, מול רבע למקד; * P <0.05, ** p <0.01 (בכיוון אחד ANOVA ואחריו מבחן פוסט-הוק הולם-Sidak; n = 11 לכל גנוטיפ). שונה מנ"צ 7.אום קבצים / ftp_upload / 52,919 52919fig1large.jpg "target =" / / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: צביעת הטבה בהיפוקמפוס של WT המאומן MWM וEn2 - / - עכברים () immunostaings הטבה נציג בhippocampi הגב כולו.. פרטים (ב) להטבת immunostaining בCA3 ומשונן gyrus אותו עכברים כמו ב(). ראשי חץ לבנים מצביעים על דוגמאות של נוירונים הטבה חיוביים. גנוטיפים כפי שצוינו. קיצורים: CA3, שכבת הפירמידה CA3; GCL, שכבת תאי גרגיר. ברים סולם: 300 מיקרומטר (), 150 מיקרומטר (ב '). (C - E) ספירה של תאי עצב ההטבה חיוביים בCA3 (C), hilus (D) וGCL (ה) של WT המאומן MWM וEn2 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מספקים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה הטבה לחשיפת הפעלה עצבית הבאה MWM בEn2 - / - עכברים, מודל עכבר של הפרעות התפתחותיות. רמות ירידה של ההטבה אותרו בתת-תחום CA3 של En2 - / - מוטציות לעומת WT. באופן שונה ממה שנצפה בתת-תחום CA3, עלייה כללית של נוירונים הטבה חיוביים זוהה במקום בשני hilus וGCL של En2 - / - עכברים בהשוואה לWT. הסבר אפשרי של מגמה הפוכה זה ברמות זירחון ERK עשוי להסתמך על מנגנונים תת-תחום ספציפי של אינדוקציה ההטבה הבאה MWM.

הפרוטוקול מכיל מספר שלבים קריטיים, כגון ההערכה של נתונים MWM, קיבעון במוח, בחירה וכיול של הנוגדן, נהלי כביסה, זיהוי אות, והליך ספירת תאים. יש לבצע את כל שלבים הקריטיים אלה בזהירות על מנת להבטיח איכות גבוהה ותוצאות לשחזור. לדוגמא, אם המוח הוא not הקבוע כראוי (שלבים 3.2 ו -3.3), החלקים יהיו בקלות לקרוע במהלך ההליכים מכתים. יתר על כן, סעיפים לא צריכים להתייבש בכל נקודה במהלך שלבי הכביסה כדי למנוע אות נמוכה בצביעה. לבסוף, אם נוגדן הטבה שונה מזה שדווח כאן (ראה חומרי רשימה) משמש, חשוב לכייל שני ריכוז הנוגדנים וזמן דגירה על מנת לזהות את התנאים חזקים והמתאימים ביותר. יתר על כן, על מנת להבטיח תוצאה מדויקת ובלתי משוחדת לניסויי אימונוהיסטוכימיה, זה קריטי, כי גם מבחן MWM וספירה תאים ייעשו על ידי מפעילים עיוורים לגנוטיפ של בעלי החיים או טיפול תרופתי. נוירונים חיוביים הטבה ניתן גם זוהה על ידי מכתים immunofluorescence באמצעות נוגדנים משני מצומדת לfluorophore מתאים. בהקשר זה, יש צורך להשמיט את מרווה של peroxidases אנדוגני (שלב 4.3) ולהשתמש מימיים הרכבה תקשורת כדי לשמור על צבעי הניאון (STEעמ '4.24).

עד כה, ביטוי של גן מוקדם מיידי (IEG,) כבר בשימוש נרחב כחתימה מולקולרית של המשימה תלויה בהיפוקמפוס לומדת 24. זה כבר התייחס בעצם על ידי ה- mRNA C-FOS הכלאה באתר או אימונוהיסטוכימיה. לעומת זאת, מחקרי אימונוהיסטוכימיה כמה שיטתי התייחסו פעילות עצבית על ידי טיפול זירחון ERK במודלים של עכברים של הפרעות התפתחותיות. העבודה שלנו מחקר שנערך לאחרונה 7 וקודמים 5 הפגינה כimmunostaining הטבה היא סמן אמין לאתר מעגלים עצביים בהיפוקמפוס מעורבת בלמידה וזיכרון. מגבלה אחת של טכניקה זו מיוצגת על ידי מספר צעדים הקריטיים שעשויים להגדיל את השונות של התוצאות. עם זאת, הגישה הניסויית המוצגת כאן מספקת לחוקרים עם מתווה תמציתית, קל למעקב של איך לפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בשני מודלים של עכברים גנטיים או תרופתייםמאופיין בליקויים קוגניטיביים. באופן כללי יותר, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור פעילות עצבית במשימות קוגניטיבי-התנהגות שונות מMWM, ולמפות הפעלה עצבית לאזורים אחרים במוח שעלול להיות מעורבים בתפקודים קוגניטיביים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף

Acknowledgments

אנו מבקשים להודות לצוות הניהולי של CIBIO (אוניברסיטת טרנטו) וCNR Neuroscience מכון לסיוע. ג'ובאני פרובנצאנו נתמך על ידי פוסט דוקטורט מFondazione Veronesi (מילאנו, איטליה). עבודה זו מומנה על ידי המשרד האיטלקי של אוניברסיטות ומחקר (PRIN 2008 מענק # 200894SYW2_002 וprin 2,010-2,011 מענק # 2010N8PBAA_002 לYB), אוניברסיטת טרנטו (מענק CIBIO הזנק לYB) וקרן Telethon (GGP13034 # מענק ל YB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EthoVision XT 8 Noldus Information Technology This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market.
Tempera Paint Giotto - Fila Group Company White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.
Vibratome Leica VT1200 Equivalent models from other companies can be used.
24 well plate Sigma CLS3524
100% ethanol Fisher Scientific A406-20 Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.
Xylene VWR 66004-950 Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use. 
Sodium Azide Sigma  S2002
PBS Sigma P3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100 Sigma  T-8787
Hydrogen Peroxide Sigma H1009-100ML
Normal Goat Serum Abcam G9023-10ML
ABC kit Vectastain  Vector Laboratories PK-6100 Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.
DAB peroxidase substrate Vector Laboratories SK-4100 Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.
Name Company Catalog Number Comments
pERK antibody Cell Signaling Technologies  4370 Dilution 1:500
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody Vector Laboratories BA-1000  Dilution 1:250
SuperFrost Slides  Carl Roth 1879
Coverslips Fisher 12-548-B
DPX Sigma 317616 Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.
Microscope  Zeiss  Axio Imager.M2 Equivalent microscope can be used.
Adobe Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA To assemble images.
ImageJ Software National Institute of Health Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0 Systat Software Inc. (USA) Equivalent softwares for statistical analysis can be used.
Prism 6 GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) Equivalent softwares for statistical analysis can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
  2. Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
  3. West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  4. Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
  5. Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
  6. Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914 (2012).
  7. Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
  8. Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
  9. Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
  10. Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
  11. Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
  12. Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
  13. Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
  14. Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
  15. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
  16. Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
  17. Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
  18. Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
  19. Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51 (2013).
  20. Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
  21. Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
  22. Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).
  24. Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).

Tags

Neuroscience גיליון 99 אימונוהיסטוכימיה מבוך מים של מוריס ERK ההיפוקמפוס קוגניציה זיכרון אוטיזם
ויזואליזציה immunohistochemical של היפוקמפוס Neuron פעילות לאחר מרחבי למידה במודל עכבר של הפרעות נוירו-התפתחותי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Provenzano, G., Pangrazzi, L., Poli, … More

Provenzano, G., Pangrazzi, L., Poli, A., Berardi, N., Bozzi, Y. Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (99), e52919, doi:10.3791/52919 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter