Summary
我々は、神経発達の起源の認知障害によって特徴づけられるマウスモデルにおける空間学習課題への曝露後の海馬ニューロンの活性化のプロファイルを研究するために免疫組織化学プロトコルを記述します。このプロトコルは、認知障害によって特徴付けられる遺伝的または薬理学的両方のマウスモデルに適用することができます。
Abstract
リン酸化され、細胞外調節キナーゼ（のpERK）の誘導は、学習に依存する神経活動の信頼性の分子読み出しです。ここでは、神経発達の起源の認知障害によって特徴づけられるマウスモデルにおける空間学習課題への曝露後の海馬ニューロンの活性化のプロファイルを研究するためのpERK免疫組織化学プロトコルを記述します。マウス、自閉症スペクトラム障害（ASD）のモデル具体的には、エングレイルド-2ノックアウト（ - / -たEn2）におけるモリス水迷路（MWM、古典的海馬依存性学習課題）後の神経の活性化を研究するためのpERK免疫染色を使用していました。野生型（WT）対照と比較して、たEn2 - / -マウスは、MWMにおける重要な空間的学習障害を示しました。 WT動物と比較して、マウス- / - MWM後、pERKの陽性ニューロンの数の有意差は、特定の海馬たEn2のサブフィールドで検出されました。したがって、我々のプロトコルは、ロバストの違いを検出することができますASDのマウスモデルにおいて、海馬依存性学習障害に関連付けられているのpERK陽性ニューロン。より一般的には、我々のプロトコルは、認知障害の両方により特徴づけられる遺伝的または薬理学的なマウスモデルにおいて、海馬ニューロンの活性化のプロファイルを調査するために適用することができます。
Introduction
神経発達障害は、中枢神経系（CNS）の開発および成熟が中に早期に乱されたダウン症候群、脆弱X症候群（FXS）、レット症候群、神経線維腫症、結節性硬化症やASD、などの障害の広い異種基などが挙げられます出生前の期間1。これらの発達脳機能障害は、運動機能、言語、学習と記憶のプロセスに深刻な、生涯影響を引き起こす可能性があります。遺伝的要因と環境要因の過多は、ここ数年の間に2,3神経発達障害の病因に関与しています。臨床表現型の根底にある分子メカニズムは不明のままであっても、上記の知見は、これらの障害のいくつかのマウスモデルの開発を可能にしています。学習および記憶障害には、TSC1 +/-、TSC2 +/-としてこれらのマウスモデルの数が特定されています、NF1 +/-と EN2 - / -マウス2,4-7。神経発達障害の分野における重要な課題は、記憶や学習障害の基礎となる細胞および分子プロセスの同定です。学習または記憶の間に活性化、選択のシグナル伝達経路は、特定の遺伝子の転写を誘導し、最終的にデノボのタンパク質合成につながることができます。即時初期遺伝子（IEGs）の活性化およびタンパク質依存性シナプス修飾は、急速に神経活動と行動訓練8,9に応じて脳の神経細胞に誘導されます。
ニューロフィブロミンを含むシグナル伝達経路の欠損は神経発達障害における学習障害と関連しています。ニューロフィブロミンは、変異神経線維腫症1型の原因となるNF1遺伝子、神経系腫瘍によって特徴付けられる複雑な遺伝性症候群、行動、モータ遅延、および認知DISAの製品ですbilities 10。抑制性ニューロンに制限NF1欠失についてヘテロ接合マウスは、長期増強（LTP）の初期段階だけでなく、MWM 5,11,12、侵入した空間学習の欠損を示します。興味深いことに、このマウスモデルにおけるNF1欠損が増加ERKのリン酸化、最終的にこれらのニューロン5からのGABA放出の異常な増強を生じ、学習の間に介在阻害におけるRASシグナリングの過剰活性化をもたらします。
これらの知見に基づいて、行動タスク後の神経活動の可視化は、神経疾患に関与する特定の回路を再構成する方法を示しています。ここで説明する免疫組織化学プロトコルは、認知障害とASDマウスモデルにおいてMWMを次の海馬ERKリン酸化レベルを評価し、定量化することを目指しています。 MWMは広くげっ歯類13,14に海馬依存空間学習および記憶を調べるために使用され15において重要な役割を有することが示されたため、タスク依存海馬学習の分子読み出しとしてERKリン酸化を使用することを決定しました。また、ERK経路は、開発視覚野16における経験依存的可塑性のために必要です。最後に、CNSショーで2 ERKアイソフォーム（ERK2）のいずれかを欠損したマウスは、ERKシグナルは、ASDなどの神経発達障害の病因に重要な役割を果たしている可能性があることを示し、認知感情的、社会的行動17の異常をマーク。
神経発達障害のモデルとしてマウス（ - / -たEn2）私たちは、エングレイルド2ノックアウトを使用していました。 EN2 - / -マウスは、前脳の介在18の損失を含む解剖学的および行動「ASD様」機能では、ASD関連遺伝子19の発現低下を示し、社交性を減少し、損なわれた認知の柔軟性6,7,20。空間learni- / -マウス6,7および21 ASD患者で観察された認知機能障害に関連する可能性があるようなMWMで検出されたものとしてNGとメモリの欠陥は、たEn2、特に堅牢です。 - / -成体マウス7さらに、我々は、MWMにおける減損空間学習が減少ニューロフィブロミンの発現に関連するとEN2の門でのpERKレベルを増加させることが示されました。ここでは、このASDマウスモデルにおいてMWMを次のpERKの免疫組織化学的特性評価のための詳細なプロトコールを提示します。
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Protocol
全ての実験は、欧州共同体指令63分の2010 / EUに準拠して行われた、健康のイタリアの省によって承認されました。
1.動物実験、住宅と治療
- 各機関動物ケアのガイドラインに従ってマウスを使用して、すべての実験のプロトコルを実行します。
- 食料と水自由摂取させ 、12時間の明/暗サイクルの動物を維持します。
- ハウス2-4の群のマウスには、おがくずや寝具材料と標準サイズのポリカーボネート製マウスケージに毎週変更しました。
- 疾患に対する感受性は神経発達障害の異なるマウスモデルにおいて、年齢や性別に応じて変化することができるので、年齢と性別をマッチさせたマウスを使用してください。
- 統計的有意性（免疫組織化学実験のための行動の研究と遺伝子型ごとに4匹のマウスについての遺伝子型あたり10匹のマウスの最小）に達するまで、動物の適切な数を選択してください。
2.モリス水迷路（MWM）
- 円形タンク（直径100センチメートル、高さ50センチメートル）を使用します。
- タンク周りの部屋のディバイダーにいくつかの視覚的な手がかりを置きます。
- 4架空の象限のうちの一つの中心にある固定位置にタンクに直径10cmのプラットフォームを配置します。すべてのトレーニングセッション全体のすべての試験について同じ象限内に隠されたプラットフォームをしてください。
- プラットフォームは水の表面の上1cmであるまで、水道水でプールを入力します。平衡化する水の温度は22℃に近くなければなりません。このステップは数時間かかることがあります。水の温度を平衡化するために必要な時間を短縮するお湯を加えます。
- 水を不透明にするために白、非毒性塗料の約1.5〜2 Lを追加します。
- トラックの取得手順
- 標準のCCDカメラやビデオボードとMWMの追跡システムを設定します。このようなパスの長さのようないくつかの変数を監視し、分析するために、ビデオ·トラッキング·システムを選択して、ESCAPEの遅延、および時間は、各象限に費やされました。
- 4つの象限にアリーナを分割し、ライブトラッキングのための動物と背景との間の最適なコントラストを確保するために、検出設定を調整します。
- プラットフォーム領域を指定します。
- 60秒、最大試行時間を設定します。
- MWMテスト
- 行動試験の前に、マウスに彼らはプールや空間キューを見ることができない領域で20〜25分間の適応期間を可能にします。
- （それらの間に20〜30分間隔で2回連続の試験日）9日間各マウスを訓練します。
- パソコンとカメラに切り替え、ビデオ追跡システムソフトウェアを起動します。
- その頭は、4つの開始位置（北、南、東、西）のいずれかから開始し、プールの側に指摘して、その尾によってマウスを取り、水の中に配置します。各マウスについて、開始位置は異なり、試験全体でpseudorandomizedでなければなりません。
- マウスが泳いでみようとplatfを検索60秒の最大のためのORM。動物がプラットフォームに到達すると、それは20秒間プラットフォームに滞在することを可能にします。
- マウスがその時間内にプラットフォームを見つけることができなかった場合は、ゆっくりその尾をつかんでプラットフォームにマウスを案内し、それが20秒のためにそこに滞在してみましょう。動物はすべて2つの試験を完了した後、タオルでそれを乾燥させ、ケージに戻します。
- 訓練期間のそれぞれの日は、同じ手順（手順を2.3.4-2.3.6）繰り返します。
- 最後のトレーニングトレイルの後9日目に、プローブテストを実行します。
- プールからプラットフォームを削除します。
- マウスが泳いでみようと60秒の最大のためのプラットフォームを検索します。
- 定期的に、それは同じ（22°C）であるべきであるように、水の温度をチェックし、プールを一掃。
灌流動物からの切片の調製
- MWMの最後にマウスを生け贄に捧げます。遺伝子型あたり4匹のマウスをeuthanizの前に麻酔されなければなりませんローカルおよび国際的なガイドラインに従ってエーション。
- 10-15 PBS中の4％パラホルムアルデヒド、続いて4-5分間、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で（出血を可能にし、灌流するために左心室に蝶のカニューレを導入するシザーauriclewith権利をカット）経動物を灌流22分。
- 解剖し、少なくとも12時間、4℃で4％パラホルムアルデヒドで脳をポスト修正。
- スライスのために必要とされるまで4℃で0.1 M PBSおよびストア内の0.02％アジ化ナトリウムを15 mlを含む50ミリリットルポリスチレンコニカルチューブに脳を置きます。
- ビブラ切断前に小脳をカットし、削除します。
- ビブラのホルダープレート上に、瞬間接着剤を使用して、切断部位で脳を直立接着。
- 適切なビブラトームに、背側海馬を通してシリアルために、20〜40ミクロン厚の冠状切片に脳をカット。
- ペイントブラシでビブラトーム切片を収集し、2に転送各ウェルについて、0.1MのPBS 1 mlを含む4マルチウェルプレート。
- 4ºCで、PBS中の0.02％アジ化ナトリウムで、PBS中の短期または長期のためのショップのセクションでは、（組織には、最大1年間に使用されるかもしれません）。
4.免疫組織化学
- 各ウェルについて、0.1MのPBSを500μlを含む24マルチウェルプレートに転送3-5各マウスについて、背側海馬のセクションでは、。
- 0.1 M PBS（穏やかに振盪しながら5分間、3回）の500μlの各ウェルに含まれるセクションを洗ってください。
- 穏やかに攪拌しながら20分間、PBS中の1％H 2 O 2のセクションをインキュベートすることによって、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチします。
- 穏やかな撹拌（3×5分）で、0.1M PBSでセクションを洗ってください。
- 組織の透過性：PBS中の0.2％トリトンX-100で5分間のセクションをインキュベートします。
- 上記の手順（4.4; 4.5）の間に、（numbe全実験のための十分なブロッキング緩衝液（PBS中10％ヤギ血清および0.1％トリトンX100）を作りますセクションのR×100μL×3段階）。
- 注：（ビオチンに結合）二次抗体が作られたのと同じ種から使用血清を。
- 穏やかに攪拌しながら室温（RT）で1時間バッファー（100μL/セクション）をブロック内のセクションをインキュベートすることによって非特異的抗体の結合を防ぎます。
- 穏やかに撹拌しながら、4℃で一晩、ブロッキング緩衝液中で希釈した一次抗体（のpERK）のセクションをインキュベートします。
- 穏やかな撹拌（3×5分）で、0.1M PBSでセクションを洗ってください。
- 穏やかに攪拌しながら室温で1時間（ステップ4.6で使用したものと同じ）を、ブロッキング緩衝液中に希釈したビオチン（250 1）とコンジュゲート二次抗体でインキュベートします。
- アビジンとビオチン複合体に室温で少なくとも30分を必要とするため、同時にABC試薬を準備します。
- 製造業者のプロトコルに従ってABC試薬の必要量を準備します。
- 穏やかな撹拌（3×5分）で、0.1M PBSでセクションを洗ってください。
- IncubatABC試薬で室温で45分間のEセクション。
- 穏やかな撹拌（3×5分）で、0.1M PBSでセクションを洗ってください。
- DABは発癌性や催奇形性であるとしてDAB作業溶液を調製し、DABを含むすべてのステップは、ドラフト内で行う必要があります。
- プラスチック転送ピペットで新しいプレートにDAB溶液を移します。
- 手でDAB作業溶液にゆっくりと旋回プレートを含むプレートに置いてセクション、セクションの最大エクスポージャーを可能にします。
- 適切な信号が発生するまで、顕微鏡のDAB反応（2-5分）を監視します。
- 0.1 M PBS（3×5分）で組織を洗浄することにより、所望の色の強さで反応を停止します。
- 一晩換気フード内の残りのDAB基質溶液を不活性化し、実験室でのガイドラインに従ってこれを処分する漂白剤を使用してください。
- ゼラチンのマウント切片をPBSに浮遊させることによって、スライドをコーティングしました。次いで、室温で少なくとも3〜4時間でそれらを乾燥させます。
- 50％、70％、95％で連続切片を脱水100％の2分毎エタノール、および5分間、100％キシレン中で明確。
- マウンティング培地を用いてカバースリップし、一晩乾燥さヒュームフードのままにしておきます。
5.セル数
- カウントのpERK陽性細胞は、背側海馬のレベルで三から五の項では、動物ごとに分析する必要があります。
- 適切な顕微鏡を用いて200倍の倍率で各セクションからの複数の明視野画像を取得し、その後、画像処理ソフトウェアを使用して組み立てます。
- ImageJのフリーソフトウェアを使用して、TIFF-変換モザイク画像上の細胞数を実行します。
- 100×100μmの各2〜3カウントボックスの上に門と顆粒細胞層中のpERK染色細胞をカウントします。
- 細胞密度は、ウィンドウをカウント当たりの標識細胞の数（100×100ミクロン）と表現します。
- 遺伝子型の間に有意差を評価するために統計分析を実行します。これは、スチューデントのtを用いて達成することができます試験またはANOVAは、市販のソフトウェアを使用して、適切な事後検定を行いました。 P <0.05で統計的有意性レベルを設定します。
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Representative Results
ここで説明するプロトコルは、免疫組織化学により、可視化するために設計された、神経発達障害のマウスモデルにおいて、MWM後の海馬ニューロン活動の特定のマーカーの発現。ここに示したすべての実験データは、我々の最近の仕事7から採取しました。男性と女性のWTとEN2 - / - （3-5ヶ月齢;重量= 25〜35グラム）年齢をマッチさせた大人の同腹子ヘテロ接合交配から得られたが使用されました。二十個のマウス（遺伝子型当たり11）MWMのために使用しました。 8匹のマウス（遺伝子型あたり4）はMWMプローブ試験の終了時に屠殺し、免疫組織化学実験に使用しました。
たEn2の空間学習障害の評価- / -マウス
- / -特にたEn2の空間学習障害の存在を調べるために、マウスを、我々は、MWM試験、古典的海馬依存性の空間学習課題13,14を使用していました。 traininの1日目G試験、待ち時間と速度水泳に差はたEn2の間で検出されている- / -およびWTマウスは、両方の遺伝子型が同じような視覚と運動性能を示すことを示唆しています。すべての実験群はトレイル中に学習する能力を実証している場合でも、EN2が- / -マウスは、目標低い効率より3 番目のトレーニング7日目から開始してWTマウスに達しました。隠されたプラットフォームは、プールから削除されたプローブ試行（9日目）、で、WTマウス（ 図1A）は 、期待されるターゲット位置（点線でブラックボックス）への有向パスナビゲーションを示したEn2ながら- / -マウス（ 図1B ）ターゲット象限（点線のブラックボックス）へ放浪のパスを表示する、より不規則に泳ぎました。 - / -変異体（ 図1C）（一方向ANOVAホルム-シダック事後テストに続いて、*はp = 0.027、** P =たEn2に比べてさらに、プローブ試行の間にWTマウスは、プラットフォームへの接近を示しました0.007）。近接性スコアが共同で伝統的な措置（時間を過ごし、ターゲット象限23内の交差の数）よりも群差を検出するためのより敏感nsidered。
たEn2における海馬ERKリン酸化の規制緩和- / - MWMタスク後のマウス
- / - MWM後のマウス（ 図2A）ERKリン酸化を調べるために、我々は、その後、WTとEN2の海馬サブフィールドで免疫組織化学染色を行いました。 （; 図2B - Cスチューデントのt検定、p = 0,0108）WTと比較し、 - / -マウスのpERK陽性CA3ニューロンの数たEn2で有意に低かったです。 （; 図2B、Dスチューデントのt検定、p = 0,0012）、WTと比較して、マウス- / -逆に、pERKの陽性ニューロンの有意に高い数がたEn2の門に存在しました。また、pERKの陽性ニューロンの有意に高い数も目に検出されましたたEn2の歯状回の電子顆粒細胞層（GCL） - / -マウスは、WT対照（スチューデントt検定、p = 0,0021; 図2B、E）と比較して。
図1：たEn2 - / -マウスは、モリス水迷路に損なわ空間学習を示す（A - B） - /画像は、WT（A）とEN2で、予想されるプラットフォームの場所（点在ブラックボックス）へのパスナビゲーションWTを示します。 -プローブ試験中（B）マウス。 （C）プローブ試行時の目標と反対の象限におけるプラットフォームに近接。略語や記号：T、ターゲット象限; OP、ターゲットとする象限反対。 * P <0.05、** p <0.01（一元配置ANOVAはホルム - シダック事後検定続いあり; n =遺伝子型ごとに11）。文献7から変更。OM /ファイル/ ftp_upload / 52919 / 52919fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2：MWM訓練されたWTとEN2の海馬でのpERK染色- / -マウス（A）全体の背側海馬の代表のpERKのimmunostaings。 CA3と歯状で（B）のpERK免疫染色の詳細は、（A）のように同じマウスをジャイラス。白矢じりはpERKの陽性ニューロンの例を示しています。示されるように、遺伝子型があります。略語：CA3、CA3錐体層と、 GCL、顆粒細胞層。スケールバー：300μmの（A）、150マイクロメートル（B）。 （C - E）CA3（C）中のpERK陽性ニューロンの数、門部（D）とMWMに訓練されたWTとEN2のGCL（E）
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Discussion
- / -マウス、神経発達障害のマウスモデルここでは、たEn2でMWM後の神経活性化を明らかにするためのpERKの免疫組織化学プロトコルを提供します。 - / - WTと比較して変異体たEn2のCA3サブフィールドで検出されたのpERKのレベルを減少させました。異なるCA3サブフィールド、のpERK陽性ニューロンの一般的な増加で観察されたものからではなく、両方の門で検出されたとEN2のGCL - / -マウスは、WTと比較しました。 ERKのリン酸化レベルでのこの逆の傾向の可能な説明は、MWM、次のpERK誘導のサブフィールド固有のメカニズムに依存している可能性があります。
プロトコルは、MWMデータ、脳の固定、抗体の選択および較正、洗浄手順、信号検出、および細胞計数手順の評価として、いくつかの重要なステップを含んでいます。これらのすべての重要なステップを慎重に高品質で再現性のある結果を保証するために実行する必要があります。例えば、脳は、Nである場合（3.2および3.3ステップ）が正しく固定されたOT、セクションでは、簡単に染色手順の間に裂けます。また、切片を染色で低信号を避けるために、洗浄工程中の任意の時点で完全に乾くべきではありません。ここで報告されたものと異なるのpERK抗体（材料リストを参照）を使用する場合最後に、それは最も強固な、適切な条件を同定するために、抗体濃度およびインキュベーション時間の両方を較正することが重要です。また、免疫組織化学実験のため、正確かつ公平な結果を確保するためには、MWM試験、細胞計数の両方が動物の遺伝子型または薬理学的治療に対するブラインド操作者によって行われることが重要です。 pERKの陽性ニューロンは、適切なフルオロフォアにコンジュゲートした二次抗体を用いた免疫蛍光染色によって検出することができます。この点では、内因性のペルオキシダーゼ（ステップ4.3）の消光を省略し、蛍光色素（STEを維持するためにメディアを装着水溶液を使用することが必要ですP 4.24）。
これまでのところ、前初期遺伝子（IEG）の発現が広範囲にタスク依存海馬学習24の分子署名として使用されています。これは本質的に、in situハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学でのc-fosのmRNAによって対処されてきました。逆に、いくつかの免疫組織化学の研究が系統的に神経発達障害のマウスモデルにおいてERKのリン酸化をアドレス指定することによって神経活動に取り組みました。 pERKの免疫染色として実証我々の最近の研究7と前作5は、学習と記憶に関与する海馬の神経回路をトレースするための信頼できるマーカーです。この技術の一つの限界は、結果のばらつきが大きくなることがあり、いくつかの重要なステップで表されます。それにもかかわらず、ここで紹介する実験的なアプローチは、両方の遺伝的または薬理学的なマウスモデルにおいて海馬神経細胞活性化のプロファイリング方法の簡潔な、わかりやすい概要と研究者を提供します認知障害によって特徴づけられます。より一般的に、このプロトコルは、MWMは異なる認知行動タスクで神経活動を調査するために、及び潜在的に認知機能に関与する他の脳領域の神経活動をマッピングするために使用することができます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません
Acknowledgments
私たちは支援のためCIBIO（トレント大学）とCNR神経科学研究所の管理スタッフに感謝したいと思います。ジョバンニProvenzanoはFondazione Veronesi（ミラノ、イタリア）からのポスドクフェローシップでサポートされています。この作品は、イタリアの大学研究省（PRIN 2008グラント＃YBに200894SYW2_002とPRIN 2010年から2011年のグラント＃2010N8PBAA_002）、トレント大学（YBにCIBIO起動グラント）とテレソン財団（へグラント＃のGGP13034によって賄われていましたYB）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
| Tempera Paint | Giotto - Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
| 24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
| Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
| Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
| Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
| ImageJ Software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |
References
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