Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Immunohistokjemisk Visualisering av hippocampus Neuron aktivitet Etter Spatial læring i en musemodell for nevrologiske lidelser

Published: May 12, 2015 doi: 10.3791/52919

Summary

Vi beskriver en protokoll immunhistokjemi for å studere profilen til hippocampus neuron aktivering etter eksponering for et romlig læring oppgave i en musemodell, karakterisert ved kognitiv svikt av nevrologisk opprinnelse. Denne protokollen kan brukes på både genetiske eller farmakologiske musemodeller kjennetegnes av kognitiv svikt.

Abstract

Induksjon av fosforylert ekstracellulære regulert kinase (perk) er en pålitelig molekylær avlesning av læring avhengig neuronal aktivering. Her beskriver vi en ekstra fordel immunhistokjemi protokollen for å studere profilen til hippocampus nevron aktivering etter eksponering for en romfølelse oppgave i en musemodell preget av kognitiv svikt av neurodevelopmental opprinnelse. Spesielt har vi brukt Perk immunofarging å studere nerveaktivering følgende Morris vannet labyrint (MWM, en klassisk hippocampus-avhengig læring oppgave) i Engrailed-to knockout (en2 - / -) mus, en modell av autismespekterforstyrrelser (ASD). Som sammenlignet med villtype (wt) kontroller, EN2 ​​- / - mus viste signifikant romlig læring underskudd i MWM. Etter MWM, var signifikante forskjeller i antall perk-positive nevroner oppdaget i bestemte hippocampus subfields av en2 - / - mus, sammenlignet med WT dyr. Således kan vår robust protokoll oppdage forskjeller iPerk-positive nevroner knyttet til hippocampus-avhengig læring verdifall i en musemodell for ASD. Mer generelt kan vår protokoll anvendes for å undersøke profilen til hippocampus neuron aktivering i både genetiske og farmakologiske musemodeller karakterisert ved kognitiv svikt.

Introduction

Nevrologiske lidelser omfatter en bred og heterogen gruppe av lidelser som Downs syndrom, skjøre X syndrom (FXS), Retts syndrom, nevrofibromatose, rotknoller sklerose og ASD, hvor utviklingen og modningen av sentralnervesystemet (CNS) er forstyrret tidlig i løpet prenatal perioden 1.. Disse utviklingshjerneforstyrrelser kan føre til dyptgripende, livslang effekt på motorisk funksjon, språk, læring og hukommelse prosessen. En overflod av genetiske og miljømessige faktorer har vært implisert i patogenesen av nevrologiske lidelser i løpet av de siste årene 2,3. Selv om de molekylære mekanismer som ligger under den kliniske fenotype er ukjent, har de ovennevnte resultatene er tillatt utviklingen av flere musemodeller for disse lidelsene. Lærings- og hukommelsessvikt har blitt identifisert i en rekke av disse musemodeller som TSC1 +/-, TSC2 +/-,NF1 +/- og en2 - / - mus 2,4-7. En viktig utfordring i feltet av nevrologiske lidelser er identifisering av cellulære og molekylære prosesser som ligger til grunn hukommelse og læring dysfunksjon. Utvalgte signalveier aktiveres under læring eller hukommelse kan indusere transkripsjon av spesifikke gener og til slutt føre til de novo proteinsyntesen. Umiddelbare-tidlig gener (IEGs) aktivering og protein-avhengige synaptiske endringer raskt indusert i hjernens nerveceller i respons til neuronal aktivitet og atferdstrening 8,9.

Underskudd i signalveier som involverer neurofibromin har vært forbundet med svekket læring i nevrologiske lidelser. Neurofibromin er produktet av NF1 genet, mutasjon som forårsaker nevrofibromatose type 1, en kompleks genetisk syndrom karakterisert ved nervesystemet tumorer, atferdsmessige og motor forsinkelser, og kognitiv disahetene 10. Mus heterozygot for NF1 sletting begrenset til hemmende nerveceller viser underskudd i den tidlige fasen av langsiktig (LTP), samt svekket romfølelse i MWM 5,11,12. Interessant, NF1 mangel i denne musemodell fører til en over-aktivering av Ras-signal i hemmende interneuroner under læring, noe som resulterer i økt ERK-fosforylering og til slutt i en unormal økning av GABA-frigjøring fra disse neuroner 5.

Basert på disse funnene, visualisering av neuronal aktivitet etter atferds oppgaver representerer en måte å rekonstruere spesifikke kretser involvert i nevrologiske sykdommer. Den immunhistokjemi protokollen beskrevet her tar sikte på å vurdere og kvantifisere hippocampus ERK fosforyleringsseter nivåer etter MWM i en ASD musemodell med kognitiv svikt. MWM er mye brukt til å undersøke hippocampus avhengig romlig læring og hukommelse hos gnagere 13,14 15. Videre er ERK-reaksjonsveien er nødvendig for erfaring avhengig plastisitet i u visuelle cortex 16. Endelig mus som mangler en av de to ERK-isoformene (ERK2) i CNS viser markerte uregelmessigheter i kognitive, emosjonelle og sosial oppførsel 17, noe som indikerer at ERK signale kan spille en avgjørende rolle i patogenesen av nevrologiske forstyrrelser slik som ASD.

Vi brukte Engrailed to knockout (en2 - / -) mus som en modell for nevrologiske lidelser. En2 - / - mus viser anatomiske og atferds "ASD-lignende" funksjoner, inkludert tap av forhjerne interneuroner 18, redusert uttrykk for ASD-relaterte gener 19, redusert omgjengelighet, og svekket kognitiv fleksibilitet 6,7,20. Spatial learning og minne defekter, slik som de oppdages i MWM, er spesielt robust i en2 - / - mus 6,7 og kan være relevant for kognitive svekkelser observert i ASD pasienter 21. Videre viste vi at nedsatt romfølelse i MWM er assosiert med redusert neurofibromin uttrykk og økt Perk nivåer i hilus av en2 - / - voksen mus 7. Her presenterer vi detaljert protokoll for immunhistokjemisk karakterisering av Perk følgende MWM i denne ASD musemodell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøkene ble utført i samsvar med EU-direktiv 2010/63 / EU og ble godkjent av det italienske helsedepartementet.

1. Animal Care, Bolig og behandling

  1. Utføre alle eksperimentelle protokoller som bruker mus i samsvar med retningslinjene i de respektive institusjonelle dyr omsorg.
  2. Opprettholde dyrene i en 12 timers lys / mørke syklus med mat og vann tilgjengelig ad libitum.
  3. Huset musene i grupper på 2-4, i standard størrelse polykarbonat mus bur med sagflis og strø skiftes ukentlig.
  4. Bruk alder og kjønn-matchet mus, fordi mottakelighet for sykdom kan variere med alder og kjønn i ulike musemodeller av nevrologiske lidelser.
  5. Velg et passende antall dyr for å nå statistisk signifikans (minimum 10 mus per genotype for atferdsstudie og fire mus per genotype for immunhistokjemi eksperimentet).

2. Morris Water Maze (MWM)

  1. Bruk en sirkulær tank (diameter 100 cm, høyde 50 cm).
    1. Plassere noen visuelle signaler på romdeler rundt tanken.
    2. Plasser en 10 cm diameter plattformen inn i tanken på et fast sted i sentrum av en av fire imaginære kvadranter. Hold gjemt plattform i samme kvadrant for alle forsøk på tvers av alle treningsøktene.
    3. Fylle bassenget med vann fra springen til plattformen står 1 cm over vannflaten. Stabilisere vanntemperaturen bør være nær 22 ° C; dette trinnet kan ta flere timer. Legg varmt vann for å forkorte tiden som kreves for å stabilisere temperaturen på vannet.
    4. Tilsett ca 1,5-2 L av hvite, ikke-toksisk maling for å gjøre vannet ugjennomsiktig.
  2. Track Acquisition Prosedyre
    1. Sett opp MWM tracking system med standard CCD-kameraer og videoplater. Velg en video-tracking system for å overvåke og analysere flere variabler som banelengde, Escape ventetid, og tid brukt i hver kvadrant.
    2. Dele arenaen i fire kvadranter og justere innstillinger gjenkjenning for å sikre optimal kontrast mellom dyr og bakgrunnen for live sporing.
    3. Spesifiser plattformen regionen.
    4. Angi maksimal rettssaken tid som 60 sek.
  3. MWM Testing
    1. Før atferd testing, la mus en prøveperiode på 20-25 minutter i et område hvor de ikke kan se bassenget eller romlig.
    2. Trene hver mus i 9 dager (to påfølgende forsøk en dag, med 20-30 min intervall mellom dem).
    3. Slå på datamaskinen og kameraet og starte video-system for sporing programvare.
    4. Ta musen ved halen og legg den i vann, med hodet pekte mot siden av bassenget, fra en av de fire startposisjoner (nord, sør, øst, vest). For hver mus, skal startposisjonen være forskjellig og pseudorandomized tvers forsøk.
    5. La musa svømme og søk etter Platform i maksimalt 60 sekunder. Når dyret når plattformen, tillate det å holde seg på plattformen i 20 sekunder.
    6. Hvis musen ikke klarte å lokalisere plattformen innen den tid, forsiktig veilede musen til plattformen, holder det med halen og la den bli der i 20 sek. Når dyret har fullført alle to forsøk, tørk den av med et håndkle og legg den tilbake i buret.
    7. Hver dag i opplæringsperioden, gjentar samme prosedyre (trinn 2.3.4-2.3.6).
    8. Utfør sonden test på dag 9 etter den siste treningen stien.
    9. Fjern plattformen fra bassenget.
    10. La musa svømme og søke etter plattformen for maksimalt 60 sek.
    11. Med jevne mellomrom sjekke temperaturen i vannet slik at det skal være det samme (22 ° C) og rense ut av bassenget.

3. Utarbeidelse av §§ fra perfusert Dyr

  1. Ofre musene på slutten av MWM. Fire mus per genotype må bedøves før euthanizasjon i henhold til lokale og internasjonale retningslinjer.
  2. Perfuse dyret tran (klippe rett auriclewith en saks for å tillate blødning og innføre en sommerfugl kanyle inn i den venstre ventrikkel for å perfuse) med fosfatbufret saltvann (PBS) i 4-5 min, etterfulgt av 4% paraformaldehyd i PBS i 10-15 min 22.
  3. Dissekere og post-fikse hjernen i 4% paraformaldehyde ved 4 ° C i minst 12 timer.
  4. Plasser hjernen i 50 ml polystyren koniske rør som inneholder 15 ml 0,02% natriumazid i 0,1 M PBS og oppbevar ved 4 ° C inntil nødvendig for kutting.
  5. Kutt og fjern cerebellum før vibratome skjæring.
  6. Lim hjernen oppreist med skjære nettstedet, bruker superlim, på holderen plate vibratome.
  7. Skjær hjernen til 20-40 mikrometer tykke koronalsnitt, i serie for hele rygg hippocampus, egnet vibratome.
  8. Samle vibratome skiver med en pensel og overføre til en 24 multi-brønnsplate inneholdende 1 ml av 0,1 M PBS i hver brønn.
  9. Oppbevar seksjoner for kort sikt i PBS eller lang sikt i 0,02% natriumazid i PBS ved 4 ºC (vev kan brukes i inntil ett år).

4. Immunohistochemistry

  1. Overføring 3-5 dorsal hippocampus seksjoner for hver mus, inn i 24 multi-brønnsplate inneholdende 500 ul 0,1 M PBS i hver brønn.
  2. Vask de delene som inngår i hver brønn med 500 ul 0,1 M PBS (5 min, 3 ganger med forsiktig risting).
  3. Quench endogen peroksidase-aktivitet, ved å inkubere de delene 1% H 2 O 2 i PBS i 20 min med forsiktig omrøring.
  4. Vask seksjoner i 0,1 M PBS med forsiktig omrøring (3 x 5 min).
  5. Permeabilization av vev: inkuberes seksjoner i 5 minutter i 0,2% Triton X-100 i PBS.
  6. I løpet av de ovennevnte trinnene (4,4; 4,5), gjør nok blokkeringsbuffer (10% geiteserum og 0,1% Triton-X100 i PBS) for hele forsøket (number av seksjonene x 100 mL x 3 trinn).
  7. Merk: Bruk serum fra samme art som den sekundære (Ab konjugert til biotin) ble gjort.
  8. Forhindre ikke-spesifikk binding av antistoffet, ved å inkubere seksjoner i blokkeringsbuffer (100 ul / seksjon) i 1 time ved romtemperatur (RT) med forsiktig omrøring.
  9. Inkuber seksjoner i grunnskolen Ab (perk) utvannet i blokkering buffer, over natten ved 4 ° C, med forsiktig omrøring.
  10. Vask seksjoner i 0,1 M PBS med forsiktig omrøring (3 x 5 min).
  11. Inkuber med den sekundære Ab konjugert med biotin (1: 250) fortynnet i blokkeringsbuffer (samme som ble anvendt i trinn 4.6) i 1 time ved romtemperatur med forsiktig omrøring.
  12. Forbered ABC-reagens på samme tid, fordi avidin og biotin kreve minst 30 minutter ved romtemperatur for å kompleks.
  13. Forberede nødvendige volumet av ABC reagens ifølge produsentenes protokollen.
  14. Vask seksjoner i 0,1 M PBS med forsiktig omrøring (3 x 5 min).
  15. Incubate seksjoner i 45 minutter ved RT med ABC-reagens.
  16. Vask seksjoner i 0,1 M PBS med forsiktig omrøring (3 x 5 min).
  17. Forbered DAB arbeidsløsning, må hvert trinn som involverer DAB gjøres i avtrekksskap som DAB er kreftfremkallende og teratogent.
  18. Overfør DAB oppløsningen til en ny plate av plast overføring pipette.
  19. Plasser delene i den plate som inneholder DAB arbeidsløsning og sakte virvelplate for hånd, for å tillate maksimal eksponering for seksjoner.
  20. Overvåke DAB reaksjon på mikroskop inntil tilstrekkelig signal utvikler (2-5 min).
  21. Stopp reaksjonen ved den ønskede fargeintensitet ved vasking av vevet i 0,1 M PBS (3 x 5 min).
  22. Bruk blekemiddel for å deaktivere eventuelle gjenværende DAB substratoppløsning i avtrekksskap over natten, og kast den i henhold til retningslinjer laboratorium.
  23. Mount seksjoner på gelatin belagt lysbilder av flytende i PBS. Deretter tørke dem ved omgivelsestemperatur i minst 3-4 timer.
  24. Dehydratisere seksjoner sekvensielt i 50%, 70%, 95%og 100% etanol i 2 minutter hver, og tydelig i 100% xylen i 5 min.
  25. Dekkglass ved hjelp av montering medium og la i avtrekk til tørk over natten.

5. Cell Count

  1. Count Perk-positive celler, bør 3-5 seksjoner på nivået av dorsal hippocampus analysert per dyr.
  2. Erverve flere lyse-feltet bilder fra hver seksjon på 200X forstørrelse ved hjelp av en passende mikroskop, og deretter sette dem sammen ved hjelp av et bildebehandlingsprogram.
  3. Utfør celletall på tiff-konvertert mosaikk bilder ved hjelp av ImageJ fri programvare.
  4. Telle Perk-fargede celler i hilus og granule celle lag over 02:58 teller esker med 100 × 100 mikrometer hver.
  5. Celletettheter vil bli uttrykt som antall merkede celler pr tellevinduet (100 x 100 um).
  6. Utføre statistisk analyse for å vurdere signifikant forskjell mellom genotyper. Dette kan gjøres med Student ttest eller ANOVA fulgt av passende post hoc test med kommersielle programvare. Sett statistisk signifikans-nivå på p <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen er beskrevet her er designet for å visualisere, ved immunhistokjemi, ekspresjon av en spesifikk markør for neuron hippocampus aktivitet etter MWM i en musemodell av nevrologiske lidelser. Alle de eksperimentelle data er vist her ble tatt fra vår siste strikk 7. Mann og kvinne WT og en2 - / - alderstilpassede voksne søsken (3-5 måneder gammel, vekt = 25-35 g) hentet fra heterozygot parringer ble brukt. Tjueto mus (11 per genotype) ble anvendt for MWM. Åtte mus (fire pr genotype) ble avlivet ved slutten av MWM sonden prøving og brukt til immunhistokjemi eksperimenter.

Vurdering av romlige lærings underskudd i en2 - / - mus

Å spesifikt undersøke tilstedeværelsen av romlige lærings underskudd i en2 - / - mus, vi brukte MWM test, en klassisk hippocampus-avhengig romfølelse oppgave 13,14. På dag 1 av training forsøk, ingen forskjeller i ventetid og hastighet svømmetur er påvist mellom en2 - / - og WT mus, noe som tyder på at begge genotyper viser lignende visuell og motorytelse. Selv om alle eksperimentelle grupper vist evne til å lære i løpet av stier, en2 - / - mus nådd målet mindre effektivt enn WT mus med start fra 3. treningsdag 7. På probe studie (dag 9), når den skjulte plattformen ble fjernet fra bassenget, WT mus (figur 1A) viste en rettet bane-navigasjon til den forventede målplasseringen (stiplet svart boks), mens en2 - / - mus (Figur 1B ) svømte mer uregelmessig, viser en vandrende vei til målet kvadranten (stiplet svart boks). Videre under sondeprøve WT mus viste tettere nærhet til plattformen, i forhold til en2 - / - mutanter (figur 1C) (enveis ANOVA etterfulgt av Holm-Sidak post-hoc test, * p = 0,027, ** p = 0,007). Nærheten score er considered mer sensitiv for påvisning gruppeforskjeller enn tradisjonelle tiltak (tidsbruk og antall kryss i målet kvadrant 23).

Deregulering av hippocampus ERK-fosforylering i en2 - / - mus etter MWM oppgave

For å undersøke ERK-fosforylering, vi så utført en immunhistokjemisk farging i hippocampus delfelt av WT og en2 - / - mus etter MWM (Figur 2A). Antallet Perk-positive CA3 nevroner var betydelig lavere i en2 - / - mus, sammenlignet med WT (Student t test, p = 0,0108, figur 2B - C). Motsatt vil en vesentlig høyere antall ekstra fordel-positive neuroner var til stede i hilus av EN2 - / - mus, sammenlignet med WT (Student t test, p = 0,0012; figur 2B, d). I tillegg ble et betydelig høyere antall perk-positive nevroner også påvist i th e granule cellelag (GCL) fra dentate gyrus av EN2 - / - mus, sammenlignet med WT kontroller (Students t-test, p = 0,0021; figur 2B, E).

Figur 1
Figur 1:. En2 - / - mus viser nedsatt romfølelse i Morris vannet labyrint (A - B) Bildene viser WT bane-navigasjon til den forventede plattform plassering (stiplet svart boks), i WT (A) og en2 - / - (B) mus under probe rettssaken. (C) Nærhet til plattformen i målet og motsatte kvadranter under probe rettssaken. Forkortelser og symboler: T, target kvadranten; OP, kvadrant overfor målrette; * P <0.05, ** p <0,01 (enveis ANOVA etterfulgt av Holm-Sidak post-hoc test; n = 11 per genotype). Modifisert fra ref 7.om / filer / ftp_upload / 52919 / 52919fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Perk flekker i hippocampus av MWM trente WT og en2 - / - mus (A) Representative Perk immunostaings på hele rygg hippocampi.. (B) Detaljer om Perk farging i CA3 og dentate gyrus samme mus som i (A). Hvit pilspisser indikerer eksempler på Perk-positive nevroner. Genotyper som angitt. Forkortelser: CA3, CA3 pyramide laget; GCL, granule celle laget. Skala barer: 300 mikrometer (A), 150 mikrometer (b). (C - E) grevene av Perk-positive nevroner i CA3 (C), hilus (D) og GCL (E) av MWM trente WT og en2 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her gir vi en ekstra fordel immunhistokjemi protokoll for å avsløre neuronal aktivering følgende MWM i en2 - / - mus, en musemodell for nevrologiske lidelser. Redusert nivå av Perk ble oppdaget i CA3 delfelt av en2 - / - mutanter sammenlignet med WT. Annerledes enn hva observert i CA3 delfelt, en generell økning av Perk-positive nevroner ble i stedet påvist i både hilus og GCL av en2 - / - mus sammenlignet med WT. En mulig forklaring på denne trenden motsatt i ERK fosforyleringsseter nivåer kan stole på delfelt spesifikke mekanismer Perk induksjon følgende MWM.

Protokollen inneholder flere kritiske trinn, slik som evaluering av MWM data, hjerne fiksering, valg og kalibrering av antistoffet, vaskeprosedyrer, signaldeteksjon, og celletelling prosedyre. Alle disse kritiske trinnene bør utføres nøye for å sikre høy kvalitet og reproduserbare resultater. For eksempel, dersom hjernen er not løst riktig (trinn 3.2 og 3.3), vil seksjonene lett rive under fargingsprosedyrer. Videre bør seksjoner ikke tørke ut på noe tidspunkt under vasketrinnene for å unngå lavt signal i farging. Til slutt, hvis en ekstra fordel antistoff forskjellig fra det som rapporteres her (se Materialer List) anvendes, er det viktig å kalibrere både antistoffkonsentrasjonen, og inkubasjonstiden for å identifisere de mest robuste og egnede forhold. Videre, for å sikre en nøyaktig og objektiv utfallet for immunhistokjemi eksperimenter, er det avgjørende at både MWM test og celletelling vil bli gjort av operatører blinde til dyrets genotype eller farmakologisk behandling. Perk positive nevroner kan også påvises ved immunfluorescens farging hjelp sekundært antistoff konjugert til en passende fluorophore. I denne forbindelse er det nødvendig å utelate bråkjøling av endogene peroksidaser (trinn 4.3) og bruke en vandig monterings media for å bevare de fluorescerende fargestoffer (step 4,24).

Så langt har uttrykk for umiddelbar tidlig genet (IEG,) vært mye brukt som en molekylær signatur av oppgaven avhengig hippocampus læring 24. Dette har blitt vesentlig adressert av c-fos mRNA in situ hybridisering eller immunhistokjemi. Omvendt, noen immunhistokjemi studier systematisk adressert neuronal aktivitet ved å ta ERK-fosforylering i musemodeller av nevrologiske lidelser. Vår fersk studie 7 og tidligere arbeid 5 demonstrert som perk farging er en pålitelig markør for å spore hippocampus nevrale kretser som er involvert i læring og hukommelse. En begrensning ved denne teknikk er representert ved en rekke kritiske trinn som kan øke variasjonen av resultatene. Likevel, den eksperimentelle tilnærming som presenteres her gir forskere med en konsis, lett-å-følge utkast til hvordan å profilere av hippocampus nevron aktivering i både genetiske eller farmakologiske musemodellerpreget av kognitiv svikt. Mer generelt kan denne protokollen også brukes til å undersøke neuronal aktivitet i kognitive adferdsoppgaver forskjellige enn MWM, og å kartlegge neuronal aktivering med andre hjerneregioner potensielt er involvert i kognitive funksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre

Acknowledgments

Vi ønsker å takke den administrative staben av CIBIO (Universitetet i Trento) og CNR Neuroscience Institute for assistanse. Giovanni Provenzano er støttet av en post-doc fra Fondazione Veronesi (Milan, Italia). Dette arbeidet ble finansiert av det italienske departementet for universitet og forskningsdepartementet (PRIN 2008 stipend # 200894SYW2_002 og PRIN 2010-2011 stipend # 2010N8PBAA_002 til YB), Universitetet i Trento (CIBIO oppstart stipend til YB) og TV-aksjonen Foundation (tilskuddet # GGP13034 til YB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EthoVision XT 8 Noldus Information Technology This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market.
Tempera Paint Giotto - Fila Group Company White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.
Vibratome Leica VT1200 Equivalent models from other companies can be used.
24 well plate Sigma CLS3524
100% ethanol Fisher Scientific A406-20 Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.
Xylene VWR 66004-950 Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use. 
Sodium Azide Sigma  S2002
PBS Sigma P3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100 Sigma  T-8787
Hydrogen Peroxide Sigma H1009-100ML
Normal Goat Serum Abcam G9023-10ML
ABC kit Vectastain  Vector Laboratories PK-6100 Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.
DAB peroxidase substrate Vector Laboratories SK-4100 Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.
Name Company Catalog Number Comments
pERK antibody Cell Signaling Technologies  4370 Dilution 1:500
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody Vector Laboratories BA-1000  Dilution 1:250
SuperFrost Slides  Carl Roth 1879
Coverslips Fisher 12-548-B
DPX Sigma 317616 Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.
Microscope  Zeiss  Axio Imager.M2 Equivalent microscope can be used.
Adobe Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA To assemble images.
ImageJ Software National Institute of Health Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0 Systat Software Inc. (USA) Equivalent softwares for statistical analysis can be used.
Prism 6 GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) Equivalent softwares for statistical analysis can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
  2. Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
  3. West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  4. Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
  5. Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
  6. Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914 (2012).
  7. Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
  8. Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
  9. Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
  10. Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
  11. Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
  12. Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
  13. Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
  14. Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
  15. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
  16. Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
  17. Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
  18. Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
  19. Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51 (2013).
  20. Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
  21. Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
  22. Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).
  24. Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).

Tags

Neuroscience Immunhistokjemi Morris vannet labyrint ERK hippocampus kognisjon hukommelse autisme
Immunohistokjemisk Visualisering av hippocampus Neuron aktivitet Etter Spatial læring i en musemodell for nevrologiske lidelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Provenzano, G., Pangrazzi, L., Poli, More

Provenzano, G., Pangrazzi, L., Poli, A., Berardi, N., Bozzi, Y. Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (99), e52919, doi:10.3791/52919 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter