Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Immunohistokemisk Visualisering av hippocampus Neuron aktivitet Efter Spatial lärande i en musmodell av nervsystemets sjukdomar

Published: May 12, 2015 doi: 10.3791/52919
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1,2
1Centre for Integrative Biology (CIBIO), University of Trento, 2CNR Neuroscience Institute, Pisa, Italy

Summary

Vi beskriver en immunohistokemi protokoll för att studera profil hippocampus neuron aktivering efter exponering för en rumslig lärande uppgift i en musmodell som kännetecknas av kognitiva brister i nerv ursprung. Detta protokoll kan tillämpas på både genetiska eller farmakologiska musmodeller som kännetecknas av kognitiva brister.

Abstract

Induktion av fosforylerad extracellulärt reglerad kinas (Perk) är en pålitlig molekyl avläsning av lärande beroende neuronal aktivering. Här beskriver vi en Perk immunohistokemi protokoll för att studera profilen hippocampus neuron aktivering efter exponering för en spatial inlärningsuppgift i en musmodell som kännetecknas av kognitiva brister av neuroursprung. Specifikt använde vi Perk immun att studera neuronal aktivering efter Morris vattenlabyrint (MWM, en klassisk hippocampus beroende inlärningsuppgift) i engrailed-2 knockout (EN2 - / -) möss, en modell av autismspektrumstörningar (ASD). Jämfört med vild-typ (WT) kontroller, EN2 ​​- / - möss visade betydande rumsliga lärande underskott i MWM. Efter MWM, har betydande skillnader i antalet Perk-positiva neuroner upptäckts i specifika hippocampus delområden av EN2 - / - möss, jämfört med WT djur. Således kan våra protokoll robust upptäcka skillnader iPerk-positiva neuroner associerade till hippocampus beroende lärande försämring i en musmodell av ASD. Mer allmänt kan våra protokoll tillämpas för att undersöka profilen hippocampus neuron aktivering i både genetiska eller farmakologiska musmodeller som kännetecknas av kognitiva brister.

Introduction

Nervsystemets sjukdomar inkluderar en bred och heterogen grupp av sjukdomar som Downs syndrom, Fragil X-syndromet (FXS), Retts syndrom, neurofibromatos, tuberös skleros och ASD, där utveckling och mognad av det centrala nervsystemet (CNS) störs tidigt under prenatal perioden 1. Dessa utvecklings hjärnan dysfunktioner kan orsaka djupgående, livslånga effekter på motorik, språk, inlärning och minne process. En uppsjö av genetiska och miljömässiga faktorer har varit inblandad i patogenesen av nervsystemets sjukdomar under de senaste åren 2,3. Även om de molekylära mekanismer som ligger bakom den kliniska fenotypen är fortfarande okända, har de ovan nämnda slutsatser möjliggjort utvecklingen av flera musmodeller av dessa sjukdomar. Lärande och minne underskott har identifierats i ett antal av dessa musmodeller som TSC1 +/-, TSC2 +/-,NF1 +/- och EN2 - / - möss 2,4-7. En viktig utmaning när det gäller nervsystemets sjukdomar är identifieringen av cellulära och molekylära processer som ligger bakom minne och inlärningsdysfunktion. Valda signaleringsvägar aktiveras under inlärning eller minne kan inducera transkription av specifika gener och i slutändan leda till de novo proteinsyntes. Omedelbara-tidiga gener (IEGS) aktivering och proteinberoende synaptiska ändringar snabbt induceras i hjärnans nervceller som svar på nervaktivitet och beteendeträning 8,9.

Brister i signalvägar som involverar neurofibromin har förknippats med försämrad inlärning i nervsystemets sjukdomar. Neurofibromin är produkten av NF1-genen, vars mutation orsakar neurofibromatos typ 1, en komplex genetisk syndrom som karakteriseras av nervsystemet tumörer, beteendemässiga och motoriska förseningar och kognitiv disaligheter 10. Möss heterozygot för NF1 radering begränsas till hämmande neuroner visar underskott i den tidiga fasen av långsiktig potentiering (LTP), samt nedsatt fysisk lärande i MWM 5,11,12. Intressant, NF1 brist i denna musmodell leder till en överaktivering av Ras-signalering i hämmande intern under inlärning, vilket resulterar i ökad ERK fosforylering och slutligen i en onormal ökning av GABA-frisättning från dessa neuroner 5.

Baserat på dessa upptäckter, visualisering av nervaktivitet efter beteende uppgifter utgör ett sätt att rekonstruera specifika kretsarna involverade i nervsystemets sjukdomar. Den immunohistokemi protokoll som beskrivs här är att bedöma och kvantifiera hippocampus ERK fosforylering nivåer efter MWM i en ASD musmodell med kognitiva brister. MWM används ofta för att undersöka hippocampus beroende spatial inlärning och minne hos gnagare 13,14 15. Dessutom är nödvändigt för erfarenhet beroende plasticitet i utvecklings syncentrum 16 ERK-vägen. Slutligen, möss som saknar en av de två ERK isoformer (ERK2) i CNS showen markerade avvikelser i kognitiva, emotionella och sociala beteenden 17, vilket tyder på att ERK signalering kan spela en avgörande roll i patogenesen för nervsystemets sjukdomar såsom ASD.

Vi använde engrailed 2 knockout (EN2 - / -) möss som en modell för nervsystemets sjukdomar. En2 - / - möss visar anatomiska och beteende "ASD-liknande" funktioner, bland annat förlust av framhjärnan interneuronen 18, minskat uttryck av ASD-relaterade gener 19, minskade sällskaplighet och nedsatt kognitiv flexibilitet 6,7,20. Rumslig learning och minnesdefekter, såsom de som upptäcktes i MWM, är särskilt stark i EN2 - / - möss 6,7 och kan vara relevanta för den kognitiva funktionsnedsättningar som observerats i ASD patienter 21. Dessutom visade vi att nedsatt fysisk lärande i MWM är förknippad med minskad neurofibromin uttryck och ökad Perk nivåer i hilus av EN2 - / - vuxna möss 7. Här presenterar vi detaljerade protokoll för immunhistokemisk karakterisering av Perk efter MWM i ASD musmodell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment genomfördes i enlighet med EG-direktiv 2010/63 / EU och har godkänts av det italienska hälsoministeriet.

1. Djurvård, bostäder och behandling

  1. Utför alla försöksprotokoll som använder möss i enlighet med riktlinjerna i respektive institutionella djurvård.
  2. Behåll djur i en 12 timmar ljus / mörkercykel med mat och vatten tillgängligt ad libitum.
  3. Hus mössen i grupper om 2-4, i standardstorlek polykarbonat mus burar med sågspån och strö byts varje vecka.
  4. Använd ålder och könsmatchade möss, eftersom mottaglighet för sjukdom kan variera med ålder och kön i olika musmodeller av nervsystemets sjukdomar.
  5. Välj ett lämpligt antal djur för att nå statistisk signifikans (minst 10 möss per genotyp för beteendestudie och 4 möss per genotyp för immunohistokemi experiment).

2. Morris Water Maze (MWM)

  1. Använd en cirkulär tank (diameter 100 cm, höjd 50 cm).
    1. Placera några visuella referenser på rumsavdelare runt tanken.
    2. Placera en plattform 10 cm diameter i tanken på en fast plats i centrum av en av fyra imaginära kvadranter. Håll den dolda plattformen i samma kvadrant för alla försök i alla utbildningar.
    3. Fyll poolen med kranvatten tills plattformen är en cm över vattenytan. Jämvikta vattentemperaturen bör vara nära 22 ° C; detta steg kan ta flera timmar. Lägg hett vatten för att förkorta den tid som krävs för att jämvikt vattentemperaturen.
    4. Tillsätt ca 1,5-2 liter vit, giftfri färg för att göra vattnet ogenomskinlig.
  2. Spårningsordningen
    1. Ställ in MWM: s system för spårning med standard CCD-kameror och videoskivor. Välj en video-tracking system för att övervaka och analysera flera variabler såsom banlängd, escape latens, och tid i varje kvadrant.
    2. Dela arenan i fyra kvadranter och justera inställningarna upptäckt att säkerställa optimal kontrast mellan djur och bakgrund för levande tracking.
    3. Ange plattformsregionen.
    4. Ställ in maximal försökstiden som 60 sek.
  3. MWM Testning
    1. Före beteende testning tillåter möss en anpassningsperiod på 20-25 minuter i ett område där de inte kan se poolen eller ledljud.
    2. Träna varje mus för 9 dagar (två försök i rad en dag, med 20-30 minuters intervall mellan dem).
    3. Slå på datorn och kameran och starta systemprogramvaran video-spårning.
    4. Ta musen genom sin svans och placera den i vatten, med huvudet pekade mot sidan av poolen, med utgångspunkt från en av de fyra startpositioner (norr, söder, öster, väster). För varje mus, bör startpositionen vara annorlunda och pseudorandomized i studierna.
    5. Låt musen simma och söka efter Platform för högst 60 sekunder. När djuret når plattformen, låt det stanna på plattformen under 20 sekunder.
    6. Om musen inte hitta plattformen inom denna tid, försiktigt styra musen till plattformen, håller den svansen och låt det stanna där i 20 sekunder. När djuret har genomgått alla två studier, torka bort det med en handduk och lägga tillbaka den i bur.
    7. Varje dag av utbildningstiden, upprepa samma procedur (steg 2.3.4-2.3.6).
    8. Utför sondtest på dag 9 efter den sista tränings leden.
    9. Ta plattformen från poolen.
    10. Låt musen simma och söka efter en plattform för högst 60 sekunder.
    11. Periodvis, kontrollera vattentemperaturen, så att den bör vara densamma (22 ° C) och rensa ut poolen.

3. Beredning av avsnitten från perfuserade Djur

  1. Offra mössen vid slutet av MWM. Fyra möss per genotyp måste bedövas innan euthanization enligt lokala och internationella riktlinjer.
  2. Perfundera djuret transkardiellt (skär rätt auriclewith en sax för att medge blödning och införa en fjäril kanyl i den vänstra ventrikeln för att BEGJUTA) med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under 4-5 min, följt av 4% paraformaldehyd i PBS under 10 till 15 min 22.
  3. Dissekera och post-fix hjärnorna i 4% paraformaldehyd vid 4 ° C under minst 12 timmar.
  4. Placera hjärnan i 50 ml polystyren koniska rör innehållande 15 ml 0,02% natriumazid i 0,1 M PBS och förvara vid 4 ° C tills de skall skiv.
  5. Klipp ut och ta bort lillhjärnan innan vibratome styckning.
  6. Limma hjärnan upprätt med skär plats, med hjälp av superlim, på hållaren platta vibratome.
  7. Skär hjärnan i 20-40 um tjocka koronala sektioner i seriell ordning genom rygg hippocampus, lämplig vibratome.
  8. Samla vibratome skivor med en pensel och överför till en 24 flera brunnar innehållande 1 ml 0,1 M PBS i varje brunn.
  9. Förvara avsnitt för kort sikt PBS eller lång sikt i 0,02% natriumazid i PBS vid 4 ° C (vävnad kan användas i upp till ett år).

4. Immunohistokemi

  1. Överföring 3-5 dorsala hippocampus avsnitt för varje mus, till 24 flerbrunnsplatta innehållande 500 | il av 0,1 M PBS för varje brunn.
  2. Tvätta de avsnitt som ingår i varje brunn med 500 pl av 0,1 M PBS (5 minuter, 3 gånger med försiktig skakning).
  3. Släck endogen peroxidasaktivitet, genom inkubering sektioner i en% H2O 2 i PBS under 20 min med försiktig omrörning.
  4. Tvätta avsnitt i 0,1 M PBS under försiktig omrörning (3 x 5 min).
  5. Permeabilisering av vävnad: inkubera avsnitt för 5 min i 0,2% Triton X-100 i PBS.
  6. Under ovanstående steg (4.4, 4.5), gör tillräckligt blockerande buffert (10% get serum och 0,1% Triton-X100 i PBS) under hela experimentet (number sektioner x 100 ^ x 3 steg).
  7. Obs: Använd serum från samma art, där den sekundära Ab (konjugerad till biotin) gjordes.
  8. Förhindra att icke-specifik bindning av antikroppen, genom att inkubera sektioner i blockeringsbuffert (100 | j, l / sektion) under en timme vid rumstemperatur (RT) under försiktig omrörning.
  9. Inkubera avsnitt i primär Ab (Perk) utspädda i blockeringsbuffert, över natten vid 4 ° C med försiktig omrörning.
  10. Tvätta avsnitt i 0,1 M PBS under försiktig omrörning (3 x 5 min).
  11. Inkubera med den sekundära Ab konjugerad med biotin (1: 250) spädd i blockeringsbuffert (samma som användes i steg 4,6) under 1 h vid RT under försiktig omrörning.
  12. Förbered ABC reagens samtidigt, eftersom avidin och biotin kräver minst 30 minuter vid rumstemperatur till komplexa.
  13. Bered erforderlig volym ABC reagens enligt tillverkarens protokoll.
  14. Tvätta avsnitt i 0,1 M PBS under försiktig omrörning (3 x 5 min).
  15. Incubate sektioner för 45 min vid RT med ABC-reagens.
  16. Tvätta avsnitt i 0,1 M PBS under försiktig omrörning (3 x 5 min).
  17. Bered DAB arbetslösning, måste varje steg som involverar DAB göras i dragskåp som DAB är cancerframkallande och teratogent.
  18. Överför DAB-lösning till en ny platta av plast överföringspipett.
  19. Placera avsnitt i plattan innehåller DAB arbetslösning och sakta snurra plattan för hand, för att möjliggöra maximal exponering avsnitten.
  20. Övervaka DAB reaktion på mikroskop tills adekvat signal utvecklas (2-5 min).
  21. Stoppa reaktionen vid den önskade färgintensiteten genom tvättning av vävnaden i 0,1 M PBS (3 x 5 min).
  22. Använd blekmedel att deaktivera eventuellt kvarvarande DAB substratlösning i dragskåp över natten och kasta den i enlighet med riktlinjer laboratorie.
  23. Mount avsnitt om gelatin belagda diabilder genom att flytande i PBS. Sedan torka dem vid rumstemperatur åtminstone 3-4 timmar.
  24. Dehydratisera sektionerna sekventiellt i 50%, 70%, 95%och 100% etanol under 2 min vardera, och tydlig i 100% xylen under 5 min.
  25. Täck att använda monteringsmedium och lämna i dragskåp för att torka över natten.

5. Cellräkning

  1. Count Perk-positiva celler, bör 04:57 sektioner vid nivån för de dorsala hippocampus analyseras per djur.
  2. Förvärva flera ljusa fält bilder från varje avsnitt i 200 gångers förstoring med hjälp av ett lämpligt mikroskop, och sedan sätta ihop dem med hjälp av en bildbehandlingsprogram.
  3. Utför celltal på tiff-omvandlas mosaik bilder med ImageJ fri programvara.
  4. Count Perk-färgade celler i hilus och granul-cellskikt över 02:58 räknar lådor med 100 x 100 ^ m vardera.
  5. Celltätheter kommer att uttryckas som antalet märkta celler per räkningsfönster (100 x 100 | im).
  6. Utför statistisk analys för att bedöma signifikant skillnad mellan genotyper. Detta kan åstadkommas med Students ttest eller ANOVA följt av lämplig post hoc test med kommersiella programvaror. Ställ statistisk signifikansnivå på p <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet som beskrivs här utformades för att visualisera, genom immunhistokemi, expressionen av en specifik markör för hippocampus neuronaktivitet efter MWM i en musmodell av nervsystemets sjukdomar. Alla experimentella data som visas här togs från vår senaste arbete 7. Manliga och kvinnliga WT och EN2 - / - åldersmatchade vuxna syskon (3-5 månader gamla, vikt = 25-35 g) som erhållits från heterozygota parningar användes. Tjugotvå möss (11 per genotyp) användes för MWM. Åtta möss (fyra per genotyp) avlivades vid slutet av MWM sond försök och användes för immunohistokemi experiment.

Bedömning av rumsliga lärande underskott i EN2 - / - möss

För att särskilt undersöka förekomsten av rumsliga lärande underskott i EN2 - / - möss, använde vi MWM testet, en klassisk hippocampus beroende spatial inlärning uppgift 13,14. På dag 1 av training prövningar, inga skillnader i latens och hastighet simma har upptäckts mellan EN2 - / - och WT möss, vilket tyder på att båda genotyper visar liknande visuell och motorprestanda. Även om alla försöksgrupper visat förmåga att lära sig under de olika spåren, EN2 ​​- / - möss nått målet mindre effektivt än WT möss från och med den 3: e utbildningsdagen 7. På sond rättegång (dag 9), när den dolda plattformen togs bort från poolen, WT möss (Figur 1A) visade en riktad väg-navigering till den förväntade målplats (prickade svart låda), medan EN2 - / - möss (Figur 1B ) simmade mer oregelbundet, visar en vandrande väg till målet kvadranten (prickade svart låda). Dessutom, under sondförsöks WT möss visade närmare närhet till plattformen, jämfört med EN2 - / - mutanter (Figur 1C) (en-vägs ANOVA, följt av Holm-Sidak post-hoc-test, * p = 0,027, ** p = 0,007). Närheten poäng är considered känsligare för detektering av gruppskillnader än traditionella åtgärder (tid spenderas och antalet korsningar i målet kvadranten 23).

Avreglering av hippocampus ERK fosforylering i EN2 - / - möss efter MWM uppgift

För att undersöka ERK fosforylering, sedan genomförde vi en immunhistokemisk färgning i hippocampus delområde för WT och EN2 - / - möss efter MWM (Figur 2A). Antalet Perk positiva CA3 neuroner var signifikant lägre i EN2 - / - möss, jämfört med WT (Students t-test, p = 0,0108, fig 2B - C). Omvänt kan en signifikant högre antal Perk-positiva neuron var närvarande i hilus av EN2 - / - möss, jämfört med WT (Students t-test, p = 0,0012, fig 2B, D). Dessutom har en signifikant högre antal Perk-positiva neuron detekterades också i th e granul cellskikt (GCL) av dentate gyrus av EN2 - / - möss, jämfört med WT kontroller (Students t-test, p = 0,0021; fig 2B, E).

Figur 1
Figur 1:. EN2 - / - möss visar nedsatt spatial inlärning i Morris vattenlabyrint (A - B) Bilderna visar WT vägen-navigering till den förväntade plattformen plats (prickade svart låda) i WT (A) och EN2 - / - (B) möss under sond rättegång. (C) Närhet till plattformen i målet och motsatta kvadranter under sond rättegång. Förkortningar och symboler: T, mål kvadranten; OP, kvadrant motsatt till mål; * P <0,05, ** p <0,01 (envägs ANOVA följt av Holm-Sidak post-hoc-test, n = 11 per genotyp). Modifierad från ref 7.Om / filer / ftp_upload / 52.919 / 52919fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2: Perk färgning i hippocampus hos MWM utbildade WT och EN2 - / - möss (A) Representativa Perk immunostaings på hela dorsala hippocampi.. (B) Uppgifter om Perk immunofärgning i CA3 och dentate gyrus samma möss som i (A). Vita pilspetsar visar exempel på Perk-positiva neuroner. Genotyper är hämtade. Förkortningar: CA3, CA3 pyramidal skikt; GCL, granul cellskikt. Skalstrecken: 300 ^ m (A), 150 | j, m (B). (C - E) Räkningar av Perk-positiva neuron i CA3 (C), hilus (D) och GCL (E) hos MWM utbildade WT och EN2 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här ger vi en Perk immunohistokemi protokoll för att avslöja neuronal aktivering efter MWM i EN2 - / - möss, en musmodell av nervsystemets sjukdomar. Minskade nivåer av Perk detekterades i CA3-underfältet av EN2 - / - mutanter jämfört med WT. Till skillnad från vad som observerats i CA3 delfält beräknas en generell höjning av Perk-positiva neuroner istället detekteras i både hilus och GCL av EN2 - / - möss jämfört med WT. En möjlig förklaring till denna motsatt trend i ERK fosforyleringsnivåer kan lita på delfält specifika mekanismer Perk induktion efter MWM.

Protokollet innehåller flera viktiga steg, såsom utvärderingen av MWM uppgifter, hjärnan fixering, val och kalibrering av antikroppen, tvättförfaranden, signaldetektering, och cellräkning förfarande. Alla dessa kritiska steg bör noggrant genomföras för att säkerställa hög kvalitet och reproducerbara resultat. Till exempel, om hjärnan är not fast ordentligt (steg 3,2 och 3,3), kommer sektionerna lätt sönder under färgningsförfaranden. Dessutom bör sektionerna inte torka ut när som helst under tvättningsstegen för att undvika låg signal i färgning. Slutligen, om en Perk antikropp annorlunda än den som rapporterats här (se Material Lista) används, är det viktigt att kalibrera både antikroppskoncentrationen och inkuberingstiden för att identifiera de mest robusta och lämpliga förhållanden. För att säkerställa en korrekt och opartisk utfallet för immunohistokemi experiment, är det viktigt att både MWM testet och cellräkning kommer att ske genom operatörer blinda till djurets genotyp eller farmakologisk behandling. Perk positiva neuron kan också detekteras med immunofluorescens-färgning med användning av sekundär antikropp konjugerad till en lämplig fluorofor. I detta avseende är det nödvändigt att utelämna släckningen av endogena peroxidaser (steg 4,3) och använda en vattenhaltig montering media för att bevara de fluorescerande färgämnena (Step 4,24).

Hittills har uttryck av omedelbar tidig gen (IEG,) i stor utsträckning använts som en molekylär signatur av uppgiften beroende hippocampus lärande 24. Detta har i huvudsak upp av c-fos mRNA in situ hybridisering eller immunohistokemi. Omvänt, några immunohistokemi studier systematiskt nervaktivitet genom att ta itu ERK fosforylering i musmodeller av nervsystemets sjukdomar. Vår senaste undersökning 7 och tidigare arbete 5 visade som Perk immunfärgning är en tillförlitlig markör för att spåra hippocampus neuronala kretsar som är involverade i inlärning och minne. En begränsning hos denna teknik representeras av flera kritiska steg som skulle kunna öka variationerna mellan resultaten. Trots den experimentella metod som presenteras här ger forskare med en kortfattad, lätt att följa konturerna av hur profilen för hippocampus neuron aktivering i både genetiska eller farmakologiska musmodellerkännetecknas av kognitiva brister. Mer allmänt kan detta protokoll också användas för att undersöka nervaktivitet i kognitiv beteende uppgifter annorlunda än MWM, och att kartlägga neuronal aktivering till andra delar av hjärnan potentiellt involverade i kognitiva funktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut

Acknowledgments

Vi vill tacka den administrativa personalen på CIBIO (University of Trento) och CNR neurovetenskap Institutet för hjälp. Giovanni Provenzano stöds av en post-doc stipendium från Fondazione Veronesi (Milano, Italien). Detta arbete har finansierats av det italienska ministeriet för universitet och forskning (PRIN 2008 bidrag # 200894SYW2_002 och PRIN 2010-2011 bidrags # 2010N8PBAA_002 till YB), University of Trento (CIBIO startbidrag till YB) och Telethon Foundation (bidrags # GGP13034 till YB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EthoVision XT 8 Noldus Information Technology This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market.
Tempera Paint Giotto - Fila Group Company White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.
Vibratome Leica VT1200 Equivalent models from other companies can be used.
24 well plate Sigma CLS3524
100% ethanol Fisher Scientific A406-20 Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.
Xylene VWR 66004-950 Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use. 
Sodium Azide Sigma  S2002
PBS Sigma P3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100 Sigma  T-8787
Hydrogen Peroxide Sigma H1009-100ML
Normal Goat Serum Abcam G9023-10ML
ABC kit Vectastain  Vector Laboratories PK-6100 Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.
DAB peroxidase substrate Vector Laboratories SK-4100 Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.
Name Company Catalog Number Comments
pERK antibody Cell Signaling Technologies  4370 Dilution 1:500
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody Vector Laboratories BA-1000  Dilution 1:250
SuperFrost Slides  Carl Roth 1879
Coverslips Fisher 12-548-B
DPX Sigma 317616 Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.
Microscope  Zeiss  Axio Imager.M2 Equivalent microscope can be used.
Adobe Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA To assemble images.
ImageJ Software National Institute of Health Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0 Systat Software Inc. (USA) Equivalent softwares for statistical analysis can be used.
Prism 6 GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) Equivalent softwares for statistical analysis can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
  2. Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
  3. West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  4. Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
  5. Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
  6. Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914 (2012).
  7. Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
  8. Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
  9. Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
  10. Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
  11. Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
  12. Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
  13. Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
  14. Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
  15. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
  16. Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
  17. Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
  18. Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
  19. Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51 (2013).
  20. Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
  21. Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
  22. Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).
  24. Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).

Tags

Neurovetenskap immunohistokemi Morris vattenlabyrint ERK hippocampus kognition minne autism
Immunohistokemisk Visualisering av hippocampus Neuron aktivitet Efter Spatial lärande i en musmodell av nervsystemets sjukdomar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Provenzano, G., Pangrazzi, L., Poli, … More

Provenzano, G., Pangrazzi, L., Poli, A., Berardi, N., Bozzi, Y. Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (99), e52919, doi:10.3791/52919 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter