RAFT kontrollü Polimerizasyon yoluyla Tri-bileşenli Floresan Glycopolymers uyduruk ve Etkin Hazırlık

Abstract

Sentetik glycopolymers çeşitli biyokimyasal ve biyomedikal araştırma alanlarında kullanılan enstrümantal ve çok yönlü araçlardır. Döner ilaveli parçalanma zincir transfer kullanılarak, iyi kontrol edilen floresan istatistik glycopolymers bir basit ve etkin sentezinin bir örneği (RAFT) tabanlı polimerizasyon gösterilmiştir. (2-aminoetil) metakrilamit (AEMA) - sentez lactobionolactone ve N reaksiyonu ile elde edilen β-galaktoz içeren glycomonomer 2-lactobionamidoethyl metakrilamid hazırlanması ile başlar. 2-Gluconamidoethyl metakrilamid (gaema) bir terminal β-galaktoz içermeyen bir yapısal analogu olarak kullanılır. (2-hidroksietil) ara parçası olarak akrilamid, AEMA fazla flüoresan etiketleme için bir hedef olarak ve glycomonomers - N: Aşağıdaki RAFT aracılı kopolimerizasyon reaksiyonu, üç farklı monomer içerir. Sulu sistemlerin Toleranslı, reaksiyonda kullanılan RAFT madde (4-siyano-pentanoik asit) -4-dithiobenzoate olup.Düşük dispersities (≤1.32), tahmin edilebilir bir kopolimer bileşimleri ve polimerizasyon yüksek bir tekrarlanabilirliği ürünleri arasında gözlenmiştir. Floresan polimerler AEMA birincil amin fonksiyonel grupları hedefleyen carboxyfluorescein süksinimidil ester ile glycopolymers değiştirerek elde edilir. Ortaya çıkan glycopolymers lektin bağlayıcı özgüllükler belirli glycoepitope tanıyan lektinlerin kaplanmış gelen agaroz boncuklarla test ederek doğrulanır. Arzu edildiği için sentez kolaylığı, ürün bileşimlerinin sıkı bir kontrol ve reaksiyonun iyi bir tekrarlanabilirlik, bu protokol, özel yapılar ve kompozisyonlar diğer RAFT bazlı glycopolymers hazırlanmasına yönelik tercüme edilebilir.

Introduction

Son yirmi yılda, sentetik glycopolymers ile araştırmalar tanıma lektin ^1-3 süreçleri üzerinde duruluyor araştırma dahil bulaşıcı mekanizmalar incelenmesinde önemli bir potansiyel gösteren, yavaş ama sürekli gelişmeyi uğramıştır. Multivalent şeker kısımlarını sahip sentetik glycopolymers çok daha yüksek lektin bağlayıcı etkinliklerinin sergileyen beri tek değerlikli karbonhidrat kıyasla, onlar Glikobiyoloji alanda ³ büyük talep vardır. Klinik araştırmalarda özellikle ilgi insan solunum hücre yüzeylerinde ve mukoza glikoprotein üzerinde mevcut karbonhidrat bağlanma lektin aracılığıyla bakterilerin karakterize etmek için flüoresan glycopolymers kullanılmasıdır. Erken in vitro çalışmalar bakteriyel bağlama testlerinde ticari olarak temin edilebilen poliakrilamid-bazlı glycopolymers kullanılabilir. Bu prob çeşitli sonuçlar umut verici gösterdi, ancak her ikisi de pol, obtainability ve çok-to-lot sapmaların ilgili endişelerini dileYmer molekül ağırlığı ve glycoepitope içeriği. Ekonomik bir in-laboratuar protokolü yapısı içeriğine, boyut, ve bakteriyel lektinleri hedefleme sentetik glycopolymers saflık tatmin edici bir kontrol sağlayacak geliştirildi.

Glycopolymers uygun bir sentetik yaklaşıma arayışında, nispeten yeni bir polimerizasyon tekniği, tersine çevrilebilir bir ek parçalanma zincir transfer (RAFT) maddeler ⁴ çalışan kontrollü radikal polimerizasyon tipi kullanılarak test edilmiştir. Bu RAFT reaktifler son birkaç glycopolymer preparasyonlar ^5-7 kullanılmıştır. Diğer glycopolymer hazırlanması protokolleri ile karşılaştırıldığında, RAFT aracılı polimerizasyonları, monomer yapı ve reaksiyon koşulları, sulu çözeltiler, potansiyel bir uyumluluk ve arzu edilen polimer ürünleri ^8,9 küçük boyut dispersiteleri çeşitli toleransı da dahil olmak üzere birçok avantaj gösterirler. Önemli ilgi RAFT-ba hazırlanması için protokollerfarklı işlevleri ^10-13 sahip olabilir, her biri farklı monomerlerin bileşimlerinin kontrol etmesine izin veren sed tri-bileşenli glycopolymers. Bununla birlikte, daha önceki araştırma çabaları iki en anomerik askılı karbonhidrat ¹⁰ yoksun ya da kullanılan çoğu kopolimerleridir istatistiki polimerlerin farklı amaçlara hizmet şekilde bağlanmış olan homopolimerler, oluşan tri-blok kopolimerleri elde polimerizasyonlar, adım olan monomer sırası kalıntıları istatistiksel kural ^9-13 izleyin.

Son zamanlarda, thiocarbonylthio RAFT bileşiği kullanılarak (4-siyano-pentanoik asit) sulu bir ortamda -4-dithiobenzoate, bir grubunun hazırlanması, belirli askılı şekerler ve bunların uygulama içeren, doğrusal üç-bileşenli istatistik glycopolymers RAFT tabanlı lektin-aracılı bağlanma, bakteriyel Testler ¹⁴ rapor edildi. görsel bir şekilde sunulmaktadır, bu yöntem, genel amacı, tri-bileşenini hazırlamakRAFT kontrollü kopolimerizasyonu yoluyla istatistiki flüoresan glycopolymers. Çünkü tek aşamalı bir polimerizasyon protokolünün kolaylığı nedeniyle, polimer uzunluğu ve bileşimlerinde ve reaksiyonun, yüksek tekrarlanabilirliği üzerinde tam kontrol, bu protokol hali hazırda arzu edilen yapılara sahip glycopolymers diğer RAFT tabanlı sentezlere uygulanabilir.

Protocol

Glycomonomer 1. sentezi 2-Lactobionamidoethyl metakrilamid

1. Çözelti, sadece bulanık olana kadar damla damla bir tarzda mutlak etanol ilave yavaş susuz metanol içinde 3.0 ml laktobiyonik asit 2 g çözülür ve ardından dönüşlü buharlaştırma yoluyla çözücülerin ayrılması.
2. 3.0 ml susuz metanol içinde ve bir kere daha, sonra yavaş yavaş hemen bulutlanana kadar mutlak etanol ilave dönüşlü buharlaştırma yoluyla çözücü buharlaştırılması, Aşama 1.1, tortu çözülür. Lactobiono-1,5-lakton (1.94 g,% 98 verim) elde etmek için bu adım 3 kez tekrarlayın. Bu ürün, aşağıdaki reaksiyonlarda kullanım için yeterli saflıkta olan.
3. N, metanol içinde 3.0 ml lactobionolactone 1.0 g ekleyin - (2-aminoetil) metakrilamid (AEMA, 0.58 g) ve hidrokinon monometil eter (MEHQ, 1.0 mg), kendi kendine polimerizasyon inhibitörü, 2.0 ml metanol, ardından 1.0 ml trietilamin ile. 48 st için oda sıcaklığında karıştırın.
4. Deiyonize _H2O içinde 20 ml (DH ₂ ekleme
5. MeHQ 1.0 mg ihtiva eden bir alıcı kabın içine ^- (şekilde, 10 mm x 20 mm, OH) dH ₂ O 20 ml, daha sonra bir anyon değiştirici kolon içinden sulu bir çözeltisinin, ilave herhangi bir geri kalan laktobiyonik asit kaldırın.
6. Dönüşlü buharlaştırma yoluyla kuruyana kadar buharlaştınlması suretiyle de, Aşama 1.5 üretilen trietilamin, kaldırın.
7. DH ₂ O 20 ml ilave edilir ve yavaşça reaktif maddeler saptanabilen herhangi bir ninhidrin kadar katyon değişim reçinesi (H ⁺ form) 1 mg alikotları eklenerek reaksiyona girmeyen AEMA çıkarın. Daha sonra etanol çözeltisi içinde% 2 ninhidrin ile plaka, püskürtme, ince-tabaka kromatografisi plakaya uygulanması, her bir reçine ilave edildikten sonra çözelti, 1 ul örnekler alınarak kaldırma izleyin. Bir koyu mavi renk plaka, 1 dakika boyunca 90 ° C'ye kadar ısıtıldığında geliştirmek için bakıldığında, uç nokta ulaşıldı.
8. Daha sonra soğuk anhidre aseton ekleyin, metanol (~ 0.5 mi) içindeki bir minimum miktarda dondurularak kurutulmuş malzeme çözülmesiyle numuneden MeHQ çıkarın (-20 ° C, 15 mi °) ürünü çökeltmek için. Daha sonra grimsi beyaz bir toz (0.94 g,% 68 verim) olarak 2-lactobionamidoethyl metakrilamiddir (LAEMA) elde edilmesi için vakum altında bir desikatör içinde çökelti kuru bir sırlı cam huni kullanılarak filtre ile çökelti toplanır. Bu ürün, aşağıdaki reaksiyonlarda kullanım için yeterli saflıkta olan.

Monomer 2. sentezi 2-Gluconamidoethyl metakrilamid

Not: bir asılı şeker sahip değildir 2-gluconamidoethyl metakrilamid hazırlanması (gaema), yayınlanmış bir metoda ¹⁵ uyarlanmıştır.

1. Çözeltisine 10 ml metanol içinde çözüldü AEMA 2.0 g eklemekarıştırılarak 30 ml metanol içinde D-glukonolakton (1.6 g) ve bir yavaş yavaş 1.6 ml trietilamin ilave edin.
2. 24 saat boyunca oda sıcaklığında reaksiyona karıştırın.
3. Daha sonra kuru aseton, 10 ml ile yıkanır, bir sırlı cam huni kullanılarak çökelmiş ürün filtre edin ve çökelti, 10 ml izopropanol ile üç kez yıkayın. Vakum altında bir desikatör içinde çökeltilmiş ürün kurutulur.

3. RAFT Glycopolymer Sentezi

1. Ticari N Mevcut önleyicisi MeHQ kaldırmak için - (2-hidroksietil) akrilamid (heaa), alüminyum oksit nano-tanecikleri, 0.5 g eklenmesi, ardından 2 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpü için heaa 1 ml ekleyin. 30 saniye boyunca 300 xg'de santrifüj tüpü ve aşağıdaki reaksiyonda üst tabaka heaa kullanın.
2. Dikkatle LAEMA 32.8 mg (70.0 umol), AEMA 1.7 mg (10.5 umol) ve heaa (270 umol) ve 27.5 ul, tüm bu şekilde, iyi temizlenmiş 1 ml'lik bir Schlenk tüpüne, dH ₂ O 0.4 ml içinde çözüldü Bir Monom sahip3: 77, 20 er molar oranı.
3. Paralel bir reaksiyonda, aşama 3.2'de LAEMA kullanılarak yerine herhangi bir askılı şeker sahip olmayan kontrol polimerleri üretmek reaksiyonda gaema 21.4 mg (70.0 umol) yerine amacıyla.
4. Ilgili Schlenk tüpüne (örneğin, 3.2 veya 3.3) için, ardışık olarak DMF, 250 ug ihtiva eden (4-siyano-pentanoik asit) -4-dithiobenzoate (1.9 umol, RAFT maddesi) 0.53 mg, ve DMF ve 50 ul ihtiva eden 50 ul 4,4'-azobis- (4-siyanovalerik asit) (0.9 umol, başlatıcı). Yavaşça parmak vurma karıştırın.
5. Schlenk tüpü içinde yer alan içerikleri bir kuru buz kullanılarak dondurma: etanol banyosu (100 mi etanol içinde 75 g kuru buz), 10-50 mTorr içinde bir vakum uygulanır, daha sonra savurma valfin kapatılması yavaş yavaş oda sıcaklığına kadar eritilir çözeltisi izin . Iki kez daha bu donma-çözülme döngüsü boşaltın-tekrarlayın. Tüm reaktifler son çözülme sonra çözülür emin olun.
6. Bir yapışmalı plastik ba içine savurma tüp yerleştiring, torba havayı tahliye ve sonra kapatın. 70 ° C'de önceden ısıtılmış bir su banyosuna Schlenk tüpü ihtiva eden bir çanta aktarın ve 24 saat daha inkübe edilir.
7. Dikkatli bir şekilde hazırlanmış, diyaliz torbası (= 3,500 MWCO) için Schlenk tüpüne çözelti transferi ve ilk 8 saat dH ₂ O saatte değişen 24 saat dH ₂ O (10 x 2 L) karşı diyaliz. Diyalizden sonra, bir test tüpüne Diyaliz tüpünden alınan örnek aktarmak -80 ° C'de örnek dondurma, ve daha sonra liyofilize edilir.

Not: Elde edilen istatistiki poli-metakrilamid / akrilamid (PMA) pandantif veya (Kademe 3,3), D-glukanamid (Kademe 3.2) 4 O -β-D-galaktopiranosil-D-glukanamid (laktobiyonamid) içeren kopolimerler, sırasıyla, elde edilmiştir. Tartışmanın kolaylık sağlamak için, bu iki glycopolymers sırasıyla PMA-LAEMA ve PMA-gaema olarak kısaltılmıştır.

Fluorophores Glycopolymers 4. sonrası modifikasyonu

Sırasıyla fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, 0.1 M sodyum fosfat, 0.15 M NaCl, pH 7.5) içinde 0.9 ml birincil amin fonksiyonel grupların ~ 0.9 μmole içeren glycopolymer PMA-LAEMA veya PMA-gaema 5.0 mg çözülür.

Yavaş yavaş hızlı karıştırma ile çözümlere DMF 100 ul carboxyfluorescein süksinimidil ester, 0.6 mg ekleyin. Yavaşça oda sıcaklığında karanlıkta 16 saat tepkileri karıştırın.

Işıktan koruyarak da, hazırlanmış bir diyaliz tübü (MWCO = 3.500) olarak örnek yüklemek ve ilk 8 saat boyunca diyaliz solüsyonu her saat değişen 16 saat dH ₂ O (2 L) karşı diyaliz. Diyalizden sonra, bir test tüpüne Diyaliz tüpünden alınan örnek aktarmak -80 ° C'de örnek dondurma, ve daha sonra liyofilize edilir.

Not: liyofilizasyonundan sonra, floresan glycopolymers PMA-LAEMA-Floresein ve PMA-gaema-floresan, sırası ile, elde edilir.

Giy 5. Karakterizasyonukopolimerler

1. Ortalama moleküler ağırlık (Mn), ağırlık ortalamalı molekül ağırlığı (Mw) ve jel geçirgenlik kromatografisi (GPC) yazılımı, GPC ile donatılmış bir ticari bir HPLC sistemi üzerinde glycopolymers dağıtma özelliği (Mw / Mn) belirlemek 0.6 ml / dak ¹⁴ bir akış oranında, elüan olarak 0.1 M Tris / 0.1 M sodyum klorür tamponu (pH 7) ile ilgilenilen moleküler ağırlığı ve bir kırılma endeksi detektörü için müsait kolonu. (: 200-1,200,000 g / mol Mw) moleküler ağırlık standartları gibi polietilen glikol standartları kullanarak.
2. Glycopolymers ¹⁶ içinde primer amin fonksiyonel grupların, gerçek konsantrasyonunu ölçmek. Yayınlanmış bir metoda göre sentezlenen ¹⁷ glycopolymers toplam karbonhidrat içeriği analiz edin.
3. , Gaema ve glycopolymers PMA-LAEMA PMA-gaema NMR spektroskopisi ¹⁴ ile D ₂ O yapısal kompozisyon ve glycomonomers LAEMA saflık testleri.

Sentetik Glycopolymers 6. Bağlama Testleri agaroz taneleri lektin kaplanmış

1. 1 dakika boyunca 300 xg'de Erythrina krista-galli lektin (ECL) kaplı agaroz boncuklarının süspansiyondan, santrifüj 50 ul PBS içinde 1.5 ml ilave edilir, ve dikkatli bir şekilde çıkarın ve süpernatant atın. Iki kez bu adımı yineleyin ve sonra PBS 0.5 ml boncuk tekrar süspansiyon.
2. 1 saat boyunca oda sıcaklığında, karanlıkta, ekleme 3 PMA-LAEMA-floresein veya boncuk süspansiyonu PBS 6 ul PMA-gaema-Floresein (negatif kontrol) ug, ve bunların karışımları inkübe edin.
3. PBS içinde 0.2 ml PBS üç kez, ve tekrar süspansiyon boncuk 1.5 ml karışımları yıkayın. (Eksitasyon dalga boyu (Teflon-kaplı) bir imüno-mikroskop lamı üzerine bir kuyuya bir kısım (4 ul), yük kapak kayma ile kapatın ve bir FITC filtresi kullanılarak flüoresan mikroskopi ile dikkat edilmelidir: 467-498 nm, emisyon dalga boyu: 513- 566 nm) ve 10X objektif t bağlanmasını incelemekO boncuk ¹⁴ glycopolymers flüoresan.

Representative Results

Glycomonomer sentezi

Laktobionik asid glycomonomers hazırlanması için örnek olarak, burada kullanıldı. LAEMA ¹¹ sentezi üzerine ilk raporunda yöntemleri kullanarak, yetersiz saflık ile hazırlık çeşitli verimler gözlendi. katyon ve anyon değişim reçineleri kullanılarak tadil edilmiş bir saflaştırma yöntemi, ¹ H ve ^13C NMR spektroskopisi (Şekil 1) ile teyit edilir stabil bir ürün verimi ve yüksek saflıkta sunulan reaksiyona girmemiş başlangıç ​​malzemesinin ayrılması için.

RAFT glycopolymer sentezi ve fluorophores glycopolymers sonrası modifikasyonu

Basamaklı RAFT polimerizasyonlar ile hazırlanan blok glycopolymers aksine, bu tek-aşamalı bir kopolimerizasyon protokolü polimer omurgası boyunca muntazam glycomonomer dağılımını sağlar. Burada gösterilen glycopolymers gl% 20 mol içerenycomonomer, bir ara parçası olarak heaa 77 mol% 'si, ve post-modifikasyon (bakınız Şekil 2). ¹ H ^ve13C-NMR spektroskopisi için bir hedef olarak AEMA bölgesinin% 3 mol PMA-LAEMA ve PMA-gaema yapılarını teyit (Şekil 3 ve 4). Şekil 5'te gösterildiği gibi, RAFT sentezlenmiştir glycopolymer GPC elüsyon profilleri karşı çizilen olduğunda PMA-LAEMA ve PMA-gaema hem RAFT yaklaşımın etkisini kanıtlayan düşük dispersities sahiptir. Beklendiği gibi, PMA-gaema nedeniyle kolye şeker PMA-gaema eksikliği PMA-LAEMA daha n küçük bir M vardır. Karbonhidrat ve RAFT glycopolymers içeriği primer amin fonksiyonel grupların analizi ürünün glycopolymers monomerlerin oranı RAFT aracılı polimerizasyon reaksiyonu (Tablo 1) 'de kullanılan monomerlerin başlangıç ​​stoikiometrik oranı ile tutarlı olduğunu göstermiştir. Bu monomer Compositio sıkı bir denetim anlamınans sentezlenen glycopolymers olarak, tasarlandığı şekilde.

Aktive fluorophores birincil amin fonksiyonel grupların reaksiyonu proteini etiketlemede bir yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu teknik karboksifloresan ile saflaştırılmış glycopolymers etiketlemek için buraya istihdam edildi. Sonrası modifikasyon sonrasında, floresan polimerler (Şekil 6) elde edildi. Reaksiyonunda floresein-işaretli polimerlerin hiçbir bozulma GPC analizi ile tespit edilmiştir (veriler gösterilmemiştir).

Lektin kaplı agaroz boncuklar ile sentetik glycopolymers bağlanma testi

Deneylerde kullanılan sentez glycopolymers lektin bağlama spesifitesi değerlendirmek için, bilinen bir karbohidrat bağlanma spesifikliği olan lektin kaplı agaroz boncuklar kullanıldı. Erythrina krista-galli lektin (ECL), β-D-galaktosid doğru bağlama özgünlüğüne sahiptir. Şekil 7A, açıkça PMA-LAEMA-Fl gösterirBir kolye karbonhidrat olarak β-D-galaktoz içeren uorescein, ECL lektin ile bağlanma güçlü sergiledi. Bunun aksine, bir asılı şeker sahip değildir glycopolymer PMA-gaema-Floresein, bir ECL bağlanmasının negatif Şekil 7B 'de gösterilmiştir. Bu sonuç, sentezlenen flüoresan glycopolymer bağlanma etkinliği ve afinitesi örnek teşkil etmektedir.

Atanan Şekil 1. ^1H (a) ve LAEMA için ^13C-NMR (b) spektrumları (D ₂ O). (Bu rakam Wang modifiye edilmiş ve ark. ¹⁴⁾ , bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız rakam.

<keep-together.within-page = "always">: fo p class = "jove_content"
Şekil 2. kolye şeker gibi β-galaktoz içeren floresan glycopolymer PMA-LAEMA sentezinin şematik gösterimi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

¹ H- (A) ve ^13C-NMR PMA-LAEMA glycopolymer (B) spektrumları (D ₂ O). (Bu şekil Wang modifiye edilmiş ve ark., ¹⁴⁾ atanan Şekil 3. Ricasıse, bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız.

Atanan Şekil 4. ^1H (A) ve ^13C-NMR PMA-gaema için (B) spektrumları (D ₂ O). (Bu rakam Wang modifiye edilmiş ve ark. ¹⁴⁾ büyük halini görmek için tıklayınız Bu rakamın.

RAFT merkezli PMA-gaema ve PMA-LAEMA Şekil 5. Jel geçirgenlik kromatografisi izleri ve RAFT ajanı kullanmadan hazırladı. RAFT ajanı (mavi) olmadan hazırlanan PMA-LAEMA, RAFT- aksine göre PMA-LAEMA (yeşil) (M M n / a) çok daha düşük bir dağıtma özelliği vardır. RAFT merkezli PMA-gaema (kırmızı) ve PMA-LAEMA benzer GPC profilleri var, ama eski nedeniyle herhangi bir kolye şekerlerin yokluğu küçük Mn sahiptir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Önce ve fluorofor ile sonrası modifikasyon sonrasında Şekil 6. PMA-LAEMA. (A), beyaz bir etiketli olmayan glycopolymer (sol boru) ile karşılaştırıldığında, fluoresein etiketli PMA-LAEMA güçlü san bir renk (sağdaki tup) görülmektedir. UV, etiketli olmayan PMA-LAEMA (PBS içinde sol boru, 1 mg / ml) altında (B), fluoresan etiketli PMA-LAEMA ise (PBS içinde doğru tüp, 1 mg / ml), gösterir karanlık ve bir floresan ile sunulur güçlü yeşil floresan.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7. Erythrina krista-galli lektin (ECL) kaplı agaroz boncuklar glycopolymers içeren β-D-galaktoz bağlanan, ve bir asılı şeker sahip olmadığını göstermiştir. (A) PMA-LAEMA-Floresein (3 ug) ECL ciltleme güçlü olduğunu gösterdi herhangi bir askılı β-D-galaktozid artığı sahip (B) PMA-gaema-Floresein, oysa, bir lektin kaplanmış boncuklarla bağlanma gösterdi. Ölçek çubuğu = 100 mikron.

Tablo 1. Hedefleme sentetik parametreleri ve glycopolymers gerçek kompozisyonlar ^bir değerler. A) değerleri Hedefleme değerleri buürünleri arzu edilir; b) DP, Polimerizasyon derecesi; c) NA, mevcut değildir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

	DP b	Dispersitesi	Glycomonomers gerçek içeriği % mol	Primer amin gerçek içeriği % mol
Değerleri Hedefleme	100	<1.3	20	3
PMA-LAEMA	99	1.26	19	3.2
PMA-GAEMA	89	1.32	NA c	2.7

Discussion

Bir basit ve etkili olan ve bir kolye karbonhidrat olmadan RAFT tabanlı tri-bileşenli floresan glycopolymers için protokol ve lektin bağlayıcı testinde kullanımı, bu raporda gösterilmiştir. Protokol glycomonomers LAEMA ve gaema hazırlanması ile başlar. Tek-aşamalı bir RAFT kontrollü kopolimerizasyonu yoluyla yeniden üretilebilir bir verimle, öngörülebilir bir monomer bileşimine ve düşük bir dağılma ile glycopolymers elde edilir. Carboxyfluorescein süksinimidil ester ile glycopolymers sonrası modifikasyon sonrasında, elde edilen ilgili floresan-etiketli glycopolymer bağlanması, lektin bağlama özgüllüğü açısından kolaylıkla test edilebilir.

Daha sonra glycopolymer sentezlerde kullanılan edilecek glycomonomers ilk hazırlayıcı adımda, kolaylıkla temin laktobiyonik asit ve glukonolakton kullanılmıştır. Teorik olarak, kompleks, oligosakaritler monosakkaridden ilgi herhangi bir karbonhidrat, Converte olabilirglikoz C6 birincil hidroksil grubu üzerine hedef şeker konjuge tarafından glycomonomers d. Indirgeme glucose kalıntısının oksidasyonu ve bir lakton olan ek olarak dehidrasyon sonra, ürün daha sonra kolaylıkla olabilir karşılık gelen glycomonomer oluşturulması için AEMA birincil amin ile reaksiyona sokulur. Bu yol daha başka örnekleri arasında, bir son raporunda ¹⁴ görülebilir. Bu, herhangi bir polimerizasyon adımı başlamadan önce, MEHQ, güçlü bir polimerizasyon inhibitörü, kullanımdan hemen önce, bu tüm monomerin ve glycomonomer preparasyonlar çıkarılmalıdır not edilmelidir. Bu hali hazırda MEHQ sonra hemen yüksek verimde inhibitör içermeyen ürünün çökelmesi için -20 ° C'da aseton ile tedavi sahip glycomonomer çözünmesi için minimum miktarda metanol kullanılarak gerçekleştirilir.

Herhangi bir radikal polimerizasyon düzeni Essential, detay ve monomer saflık dikkat vurgulanmıştır. Bir sal polimerizasyon sistemi tipik olarak, bu oluşmaktadırradikal bir kaynak, bir RAFT reaktif, bir monomer ve çözücü. Bu görsel sunum, tek aşamalı bir RAFT polimerizasyonu sistemi, bir sulu çözelti içinde üç farklı monomerler sahip bir reaksiyon karışımından elde edilen istatistiki kopolimerlerin üretimine odaklanmıştır tarif edilmektedir. Iki ayrı RAFT aracılı tepkiler bir kolye sahip olan bir glycomonomer kullanan içinde sunulmuştur, herhangi bir ilişkili karbonhidrat artığı ile bir poliol sahip, karbohidrat terminus (örneğin, β-D-galaktoz), ve diğer non-azaltır. Her iki RAFT aracılı reaksiyonlar için ortak bir ara molekülü olarak hizmet veren tekil bir hidroksil grubuna sahip monomerler, ve başka bir amino reaktif florofor ile sonrası modifikasyonu için bir serbest amin, sahiptirler.

Reaksiyon karışımı, çevre oksijen varlığında yana RAFT aracılı polimerizasyon için zararlı olan, seviyelerini takip etmek durumunda bunun çıkarılması hali hazırda birkaç dondurularak eva ile gerçekleştirilirCuate-çözülme döngüleri yüksek vakum altında savurma tüp reaksiyon kabı korurken.

Bu gerektiği gibi reaksiyonda farklı monomerin molar oranı ayarlanabilir olduğu not edilmelidir. Ayrıca, kullanılan RAFT madde miktarının değiştirilmesiyle, elde edilen polimerlerin uzunluğu ¹⁸ kontrol edilebilir. Ancak, başlatıcı RAFT ajanının buna olan molar oranı, her ürünün düşük dağıtma özelliği temin etmek için iki daha büyük olmalıdır. Bu koşullar altında, kopolimerizasyon evrimi kararlı olduğunu ve reaksiyonun tekrarlanabilirliği çok yüksektir. Yani biri nedeniyle farklı polimerizasyon hızlarına, bir istatistik kopolimer içindeki tüm katılımcı monomerlerin tamamen tekdüze dağılım elde etmesi olası değildir, söyleniyor. Polimerin içinde farklı monomerlerin dağılımı karakterize hala çok zordur.

post-modifikasyon yöntemi, burada sunulan, hem daha basit ve amenabl olduğunuEtiket glycopolymers ^2,11 uygulanan diğer protokollere göre floresan etiketler daha geniş bir seçim kullanımına e. Bunlar, suda çözünebilir amin-reaktif fluorophores birçok kuantum noktalar, biotins ve diğerleri içerir. Sentezlenen etiketli glycopolymers bağlayıcı özgüllükleri kolaylıkla kanıtlanabilir bilinen bağlanma ilgisi ile lektinleri kullanıyor. Hiçbir kolye şeker sahip PMA-gaema uygun bir negatif kontrolüdür. Bu yolla hazırlanan farklı floresan etiketler ile Glycopolymers başarılı bir lektin aracılı bakteriyel ¹⁴ bağlanma incelemelerinde kullanılmıştır. Görüldüğü gibi, istatistiksel olarak flüoresan glycopolymers bu basit ve etkin hazırlanması glycobiological araştırma çeşitli büyük potansiyel sağlamalıdır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Lactobionic acid	Sigma-Aldrich	153516
D-Gluconolactone	Sigma-Aldrich	G2164
N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA)	Sigma-Aldrich	697931
Orange II sodium salt	Sigma-Aldrich	O8126
Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ)	Sigma-Aldrich	54050	Polymerization inhibitor
N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA)	Polysciences, Inc	24833-5
Triethylamine	Fisher Scientific	BP-616
Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh	Sigma-Aldrich	10343-U
Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh	Sigma-Aldrich	217514
Aluminum oxide, ~150 mesh	Sigma-Aldrich	A1522	Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I
Ninhydrin	Sigma-Aldrich	N4876	An ethanol solution of 0.2% ninhydrin was used in the test
4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid	Sigma-Aldrich	722995	RAFT agent
4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid)	Sigma-Aldrich	11588	Polymerization initiator
Carboxyfluorescein succinimidyl ester	Life Technologies	C1157
Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead	Vector Laboratories	AL-1143
Solvent
dH2O			Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm
Isopropanol	Fisher Scientific	A461-4	ACS grade or better
Methanol	Fisher Scientific	A454-4	ACS grade or better
Absolute ethanol	Fisher Scientific	BP2818-100	ACS grade or better
Dimethylformamide	Sigma-Aldrich	22705	ACS grade or better
Acetone	Fisher Scientific	A929-4	ACS grade or better
Equipment
Dialysis membrane (MWCO: 3,500)	Spectrum Labs	132720
Polyethylene glycol analytical standard standard	Sigma-Aldrich	O2393
Schlenk tube, 1 ml	Quark Glass		Customized
TSK-GEL G4000 PWxl	Tosoh Bioscience	8022	Used for GPC analysis of the glycopolymers
Empower 3 with GPC/SEC package	Waters Corporation
Waters Alliance HPLC system	Waters Corporation		Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475)
Avance III 800 MHz NMR Spectrometer	Bruker Corporation
BX43 fluorescence microscope	Olympus Corporation		Used with FITC filter in the glycopolymer binding test
Rotavap / Rotoevaporator	Heidolph
Fritted disc funnel	Fisher Scientific	10-310-109
Lyophilizer	Labconco
Immunofluorescence microscope slide	Polysciences	18357-1
Revco Ultima Plus -80 °C Freezer	Thermo Scientific
Plastic Vacuum Bag and Hand Pump	Ziploc
Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus	Fisher Scientific
Vacuum Gauge	Sargent-Welch