Abstract
واحدة من العمليات الأساسية للالتهاب غير تسلل الخلايا المناعية من التجويف من الأوعية الدموية إلى الأنسجة المحيطة بها. يحدث هذا عندما الخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدموية، تصبح لاصقة لتعميم الخلايا المناعية مثل وحيدات. وحتى تم ذلك في المختبر قياس هذا الإلتصاق الآن عن طريق قياس عدد من وحيدات التي تلتزم طبقة بطانة إما العد المباشر أو عن طريق قياس غير مباشر لمضان من حيدات ملتصقة. وفي حين أن هذه القياسات لا تشير إلى متوسط الإلتصاق من السكان الخلايا البطانية، ومرتبك من قبل عدد من العوامل، مثل عدد الخلايا، وعدم الكشف عن نسبة الخلايا البطانية التي هي لاصقة في الواقع. نحن هنا وصف وشرح الطريقة التي تسمح للتعداد خلايا لاصقة داخل الكتلة السكانية اختبار أحادي الطبقة البطانية. تزرع الخلايا البطانية على coverslips الزجاج ويلي المرجوةوتحدى العلاج مع حيدات (التي قد يتم fluorescently المسمى). بعد الحضانة، وإجراء الشطف، التي تنطوي على جولات متعددة من الغمر والصرف الصحي، يتم إصلاح الخلايا. يتم تحديد بسهولة الخلايا البطانية لاصقة، والتي تحيط بها وحيدات وتعداد، وهو ما يعطي مؤشر التصاق أن يكشف عن النسبة الفعلية من الخلايا البطانية في أوساط السكان التي هي لاصقة.
Introduction
تسلل الخلايا المناعية مثل وحيدات عبر طبقة الخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدموية هو خطوة هامة في عملية الالتهاب 1. وهذا يسمح للصاروخ موجه من الخلايا المناعية (immunocytes) إلى موقع الإصابة. في حالات ومواقع أخرى مثل الشريان التاجي والشريان السباتي، يمكن التسلل من وحيدات من خلال طبقة بطانة يؤدي إلى إقامة غير مرغوبة على المدى الطويل من هذه الخلايا في جدار الشريان، مما قد يؤدي إلى تكوين لويحات 2. في جميع حالات تسلل خلية مناعية، فإن الخطوة الأولى تنطوي على تفعيل الخلايا البطانية في منطقة مترجم من الأوعية الدموية. يتم تنشيط الخلايا البطانية التي كتبها السيتوكينات الموالية للالتهابات مثل TNF-α و IL-6 لزيادة التعبير عن بروتينات سطح الخلية مثل VCAM، ICAM وE-selectin التي تسهل التوظيف والحجز على immunocytes على سطح الخلايا البطانية 3- 6.
معشوقة = "jove_content"> في البداية، تم إجراء قياس التصاق الخلايا البطانية بها عد حيدات أن تلتزم البطانية أحادي الطبقة 7. وأدت القيود المفروضة على هذه الطريقة من حيث الدقة في استخدام الخلايا اللمفاوية المسمى الراديو أو الوحيدات، تليها الكمي للمواد المشعة والتي تتطابق مع الخلايا الليمفاوية أو وحيدات التصاق 4. هذه الطريقة حلت محلها في نهاية المطاف من خلال طريقة القائم على مضان، حيث وصفت immunocytes في المصالح مع مضان صبغ وتعرض لنفس الإجراء على النحو الوارد أعلاه مع والفرق بينهما أن مضان بدلا من النشاط الإشعاعي يتم قياس 8. في الوقت الحاضر هذا الأسلوب قد برز بوصفه الأكثر ملاءمة ويباع في شكل مجموعة من قبل العديد من الموردين التجارية. في حين أن هذا الفحص يمكن قياس المستويات النسبية للالإلتصاق بين الضوابط والعينات التجريبية، فإنه لا يكشف ما إذا كان هناك تغيير في مضان يرجع ذلك إلى تغيير موحد في الإلتصاق عبر البريد كاملالسكان الخلية ndothelial أو إذا كان التغيير هو بسبب وجود اختلاف في الإلتصاق بين السكان الفرعي من الخلايا. ومن الواضح أيضا أن التشدد في غسل تمارس تأثير عميق على النتيجة، والأهم من ذلك، فإن توحيد الشطف قبالة حيدات غير منضم بين مختلف الطبقات الوحيدة الخلية البطانية تؤثر بشكل كبير على التقارب في نتائج مكررات واستنساخ النتائج بين العينات . وفي الآونة الأخيرة، تم استخدام عدة أنظمة التي تضخ حيدات في وسائل الإعلام عبر أحادي الطبقة البطانية خلية لمعالجة هذه المشكلة 9. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه النظم تدفق أيضا ألخص تأثير قوة القص على الخلايا البطانية. في حين أن مزايا هذه الأنظمة واضحة وجذابة للغاية، ومن المهم أيضا أن ندرك أنه في حين أن الإلتصاق الخلايا البطانية يمكن زيادتها إلى حد كبير، كما هو الحال في التهاب حاد، بسبب عوامل مثل TNFα، وبعض المنشطات الأخرى، مثل الإشعاع المؤين 10 انتزاع يتغير رلم يتم الكشف عن قبعة بسهولة داخل الإطارات في المختبر الوقت التجريبية من قبل هذه الأنظمة الصارمة جدا. في حين تغييرات في اللحظة هذه من الإلتصاق الخلايا البطانية وغاب بسهولة أو رفضت في المختبر، فإنه ليس بالضرورة حميدة في الجسم الحي، حيث مثل هذه التغييرات الصغيرة في غضون فترة زمنية الحياة، الذي هو سمة من التهاب مزمن، يمكن أن تمارس نتائج كبيرة جدا. وبالتالي وسيلة قوية، ولكن حساسية، ومحددة لكشف وقياس هناك حاجة الإلتصاق الخلايا البطانية.
هنا، ونحن التقرير وسيلة لقياس الإلتصاق من الخلايا البطانية مباشرة. هذه الطريقة لا تعتمد على قياس مضان كمؤشر مركب غير مباشر من الإلتصاق الخلايا البطانية. أنه يكشف ما إذا كانت التغييرات في الإلتصاق ومن المقرر أن التغيير موحد في جميع الخلايا أو تقتصر على سكان الفرعي. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح شارك في تلطيخ الخلايا البطانية مع علامات مثل المرتبطة الشيخوخة بيتا غالاكتوزيداز، بقاء الخلية مارسكير، Calcien AM والأجسام المضادة ضد سطح الخلية والبروتينات داخل الخلايا، مما يتيح للجمعية الخلايا البطانية لاصقة الفردية لبعض الدول خلية أو التعبير عن بروتينات معينة.
Protocol
1. إعداد coverslips الزجاج
- تعقيم 12 ملم coverslips الزجاج قطر التي نقع عليها في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة على الأقل مع الإثارة في بعض الأحيان لضمان التعرض الكلي لجميع coverslips إلى الإيثانول. صب coverslips الزجاج والايثانول في طبق خلية ثقافة عقيمة (إما 6 سم أو 10 سم القطر).
- مع زوج من معقمة غرامة 5B ملقط، والتقاط ووضع كل ساترة الزجاج الفردية في بئر من 24 لوحة العنقودية بشكل جيد. الحرص على ضمان لل coverslips لا تلامس جوانب البئر وما يقرب من في منتصف البئر.
- ترك لوحة المغطاة الامم المتحدة 24 عنقودية بشكل جيد مع coverslips الزجاج لتجف في مجلس الوزراء التدفق. وهذا يستغرق حوالي 10 دقيقة
- خلال هذه الفترة، وإعداد مزيج الطلاء عن طريق تمييع 10 ملغ / مل فبرونيكتين الإنسان في المتوازن محلول الملح هانك (HBSS) إلى 0.1 ملغ / مل.
- عندما تكون لل coverslips الجافة، ماصة 100 ميكرولتر من محلول طلاء على كل الزجاج المشتركverslip ذلك الحل لا يغطي سوى الزجاج دون تجمع نحو الخارج من البئر. وضع لوحة غطت 24 عنقودية جيدا في حاضنة الثقافة خلية لمدة ساعة على الأقل.
- قبل الاستعمال، وإزالة حل طلاء. يمكن نقل الحل طلاء نفسه إلى أنبوب معقم واستخدام ما يصل الى ثلاث مرات مع عدم فقدان مرئية من الفعالية.
2. إعداد البطانية أحادي الطبقة خلية
- خلايا الثقافة الإنسانية الشريان البطانية (EC) في المتوسط عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
- نضح من وسائل الإعلام والثقافة، وشطف EC أحادي الطبقة مع 10 مل HBSS
- نضح قبالة HBSS وإضافة 2 مل 0.5٪ التربسين، 0.2٪ محلول EDTA. في احتضان RT لمدة 5 دقائق تقريبا.
- عندما EC يمكن إقصاؤه من خلال الصنبور إلى جانب القارورة، إضافة 5 مل من فول الصويا مثبط التربسين ومع ماصة بخ سطح القارورة لزيادة إزاحة الخلايا.
- نقل الخلايا في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في أنبوبفي 200 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح من طاف و resuspend بيليه EC في 5 مل من وسائل الإعلام. عد الخلايا مع haemocytometer وضبط تركيز الخلية إلى 50000 EC لكل مل من EC سائل الإعلام.
- الاستغناء 1 مل من تعليق خلية في كل بئر من 24 لوحة جيدا تحتوي على coverslips الزجاج المطلي. احتضان خلايا O / N في ثقافة الخلية الحاضنة عند 37 درجة مئوية بالإضافة إلى 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
- الخلايا جاهزة للاستخدام في التجارب عندما يتم تشكيل أحادي الطبقة متموجة، في غضون 3 أيام.
3. إعداد وحيدات
- نقل HL-60 الخلايا التي يتم تربيتها في RPMI تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين، والثقافة التعليق في أنبوب 15ML. الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة الخلايا وطاف resuspend في 5 مل وسائل الإعلام وضبط تركيز الخلية مع وسائل الإعلام إلى 2 مليون خلية / مل. إذا كان المطلوب وضع العلامات مضان من HL-60، resuspend الخلايا في RPMI دون المصل والعلاقات العامةoceed كما هو موضح في قسم 4.
- إضافة 0.5 مل من HL-60 تعليق خلية في كل بئر من لوحة 24 عنقودية كذلك تحتوي EC أحادي الطبقة واحتضان لوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لفترة محددة من الزمن اختار ما بين 1 و 3 ساعة. ويلاحظ فارق كبير بين 1 ساعة و 3 ساعة الوقت نقطة، حيث بلغ التشبع ملزم.
- التحضير للخلية غسل / حصاد: ملء أنبوب 120 مل مع 100 مل من HBSS. الاستغناء 1 مل من الفورمالين في كل بئر من 24 لوحة جديدة جيدا.
- بعد فترة الحضانة، واستخدام زوج من الملقط حادة والتقاط ساترة الزجاج من البئر وعقد ساترة رأسي والداب حافة ساترة على قطعة من النسيج على مقاعد البدلاء لمدة 3 ثانية، مع الحرص على عدم لمس السطح المغطاة خلية من ساترة مع الأنسجة.
- عقد ساترة بحزم مع زوج من ملقط، دونك ساترة ويخرجون من HBSS خمس مرات.
- بعد دونك الخامسفي HBSS، الداب حافة ساترة على الأنسجة لمدة 3 ثانية.
- تكرار الإجراءات التغميس واللمس هو موضح في 3.6 و 3.7، مما يجعل ما مجموعه ثلاث مجموعات من 5 يغمس تليها لمسة.
- نقل ساترة إلى تحتوي أيضا 10٪ من الفورمالين لإصلاح الخلايا في RT. ساترة جاهزة للتعداد، للتخزين طويل الأجل أو أن تخضع لإجراءات أخرى هو موضح أدناه.
4. وسمها HL-60 الخلايا مع المقتفي الخليوي (اختياري)
- العد ونقل كمية مناسبة من HL-60 الخلايا (على سبيل المثال، 10 مليون دولار) في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. الطرد المركزي HL-60 الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف.
- بيليه الخلية resuspend في تعقب خلية في RPMI وسائل الإعلام دون المصل في تركيز 1 مليون خلية / مل. احتضان الخلايا في خلية ثقافة حاضنة لمدة 1 ساعة.
- خلايا الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. بيليه الخلية resuspend في وسائل الإعلام إلى التركيز من 2000000 جملتعلمي اللغة اإلنكليزية / مل.
- إضافة 0.5 مل من المسمى تعقب خلية HL-60 إلى تحتوي كل منها على جانب الخلايا البطانية التي تزرع على الزجاج ساترة. تواصل في 3.3.
5. تعداد الخلايا البطانية لاصق
- جبل coverslips على شرائح المجهر مع دابي مكافحة وصمة عار لتحديد الخلايا الفردية.
- باستخدام مجهر مقلوب مع الهدف 4X أو 10X، والحصول على صور العديد من المجالات (على سبيل المثال، 5 الحقول) والاعتماد على أعلى عدد من وحيدات التي تجمع على الخلايا البطانية للأمم المتحدة المشع (يجب أن يكون هذا عادة 3-5).
- تعيين مرتين هذا العدد كما عتبة حيدات على خلية البطانية أن أن يعرف بأنه كتلة. إذا لزم الأمر، معيارا مختلفا يمكن استخدامها لتحديد كتلة تبعا لطبيعة التجربة.
- حساب عدد من الكتل وعدد من الخلايا البطانية في هذا المجال. تقسيم الأولى قبل الأخير للحصول على نسبة الخلايا البطانية لاصقة. أحرز هدفاالعديد من المجالات للحصول على انحراف متوسط و المستوى من التهم الموجهة إليه.
6. Counterstaining مع الأجسام المضادة
- بعد أن تم إصلاح مقايسة التصاق والخلايا على ساترة في 10٪ من الفورمالين لمدة 15 دقيقة في RT، تخضع لل coverslips إلى المناعي باستخدام الإجراء العادي 10 و الأجسام المضادة في الاختيار.
- إضافة وإزالة الحلول المختلفة بلطف شديد لتجنب طرد حيدات التي تعلق على الخلايا البطانية.
7. Counterstaining للالمرتبط اليخوخة بيتا غالاكتوزيداز آخر
- بعد أن تم إصلاح مقايسة التصاق والخلايا على ساترة في الفورمالين لمدة 15 دقيقة، وصمة عار للنشاط بيتا غالاكتوزيداز المرتبطة الشيخوخة كما هو موضح في التعليمات التي تصاحب عدة تلطيخ. إضافة وإزالة الحلول المختلفة بلطف شديد لتجنب طرد حيدات التي تعلق على الخلايا البطانية.
Representative Results
هذا الأسلوب يسمح للكشف عن الخلايا البطانية لاصقة الفردية بين السكان. على سبيل المثال، في حين أحادي الطبقة من الخلايا البطانية-المشع الامم المتحدة احتفظت بضع متفرقة HL-60 حيدات التالية الحضانة والغسل، وأحادي الطبقة البطانية في 7 أيام بعد 10Gy التشعيع قبل الحضانة مع حيدات كان لا بد حيدات في مجموعات حول الخلايا البطانية الفردية ( الشكل 1). على الرغم من أن هذه الظاهرة يمكن ملاحظتها بسهولة في إطار المرحلة النقيض المجهر، المجهر مضان يكشف عن صورة أكثر وضوحا من مجموعات الوحيدات.
بعد إجراء الفحص التصاق وصفها، فمن الممكن للشروع في تلطيخ الخلايا لغشاء، حشوية أو الطاقة النووية (الشكل 2) البروتينات باستخدام الأجسام المضادة المناسبة مع أساليب المناعي القياسية. وعلاوة على ذلك، فحص القائم على انزيم مثل المرتبطة الشيخوخة بيتا غالاكتوزيداز (الشكل 3) يمكن أيضا أن تكون المؤسسة العامةrformed.
لأن كل كتلة الوحيدات يتوافق مع خلية البطانية الفردية، وتعداد مجموعات تكشف عن العدد الفعلي للخلايا البطانية لاصقة داخل أحادي الطبقة (الشكل 4)، وبالتالي فإن النسبة المئوية للخلايا البطانية لاصقة داخل السكان (الجدول 1، الشكل 6) . هذه هي الطريقة الوحيدة حتى الآن التي تسمح بمثل هذه الكمي من الإلتصاق الخلايا البطانية. من الجدير بالذكر أن الخلايا البطانية التي استخدمت في التجارب هنا، تحول دون الاتصال ولا تزيد في عدد بعد تحقيق التقاء. هذا يلغي التعقيد المحتمل الذي تشكله زيادة عدد الخلايا البطانية في نقطة زمنية لاحقة. إذا رغبت في ذلك، وحيدات تعلق على الطبقات الوحيدة البطانية يمكن طردت بنسبة 0.5٪ محلول التربسين 0.2٪ EDTA (بدلا من التثبيت في 3.9) ومضان على قياس باستخدام قارئ لوحة، كما هو الحال في الطرق المعاصرة (الشكل 5). 
الشكل 1. التصاق حيدات على أحادي الطبقة من الخلايا البطانية. على الخلايا البطانية للأمم المتحدة المشع، وحيدات التقيد شكل خلايا مستقلة بطريقة متفرقة وعشوائية (لوحات اليسار) وفي مجموعات على الخلايا البطانية الفردية لل7 أيام بعد 10 غراي المشع أحادي الطبقة (لوحات اليمين). لوحات الدنيا هي صور مضان من لوحات العليا، مؤكدا أن خلايا صغيرة ومشرقة كروية مرئية تحت النقيض من المرحلة هي في الواقع حيدات التي وصفت قبل مع الخلية المقتفي الأخضر. وأشار بعض الكتل الوحيدات التي كتبها السهام البيضاء. واتخذت صورة باستخدام الهدف 10X. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تلطيخ الخلايا البطانية للبروتينات بعد التصاق الفحص. بعد الانتهاء من فحص التصاق وصفها، وتعرض الخلايا على coverslips الزجاج لالمناعي للكشف عن (A) بروتين الغشاء (CD44)، ب) بروتين حشوية (تويولين) أو ج) البروتين النووي (γ-H2AX). لوحات اليسار من (A) و (B) (شهدت مع الهدف 20X) عرض حيدات وصفت مسبقا مع تعقب خلية الأخضر وصورة مماثلة على لوحات اليمين تكشف CD44 والأنابيب الدقيقة (أحمر) ونوى دابي الملون (الأزرق). السهام البيضاء في (C) نقطة لالمشع نوى الخلايا البطانية التي كانت ملطخة أجسام مضادة ضد γ-H2AX. وتتميز نواة الوحيدات التي هي ملطخة أكثر إشراقا الأزرق التي كتبها دابي بسهولة من بيضاوية الشكل نوى الخلايا البطانية. وقد أخذت صور مع الهدف 20X. jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. المرتبطة اليخوخة بيتا غالاكتوزيداز تلطيخ الخلايا البطانية بعد التصاق الفحص، وتعرض خلايا coverslips على لتلطيخ للالمرتبط الشيخوخة بيتا غالاكتوزيداز الذي يسبب الجسيمات الحالة خلايا هرمة لتحويل الأزرق، كما هو واضح في الخلية البطانية التي بشكل انتقائي ملزمة من قبل العديد من وحيدات، والتي يتم تحديدها بسهولة نظرا لصغر حجمها وشكلها كروي. الصورة المرئية من خلال الهدف 20X. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
2924 / 52924fig4.jpg "/>
الرقم 4. تعداد مجموعات الوحيدات على الخلايا البطانية الفردية. بعد التصاق الفحص، واتخذت صورة من الخلايا من العديد من المواقف المختلفة ومجموعات الوحيدات التي تم تحديدها ودائري (باللون الأخضر). تم تعريف الكتلة باعتبارها التكتل من 10 أو أكثر من وحيدات الخلية على البطانية. احصي عدد الكتل الوحيدات وعدد 12 أيام الخلايا البطانية بعد المشع (منقط باللون الأحمر) في الصورة ونسبة الخلايا البطانية ملتصقة تحسب كما هو مبين في الجدول 1. الصورة مأخوذة من خلال الهدف 10X. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. الكمي لمضان من حيدات ملتصقة. بعد adhe سيون الفحص، تم trypsinised الخلايا على coverslips الزجاج ومضان من حيدات صفت مسبقا مع CellTracker الخضراء وقد تم قياس، وذلك باستخدام قارئ لوحة مضان، كمؤشر غير مباشر من لزوجة أحادي الطبقة البطانية. وقد تم الحصول على نتائج هذه القياسات في الأيام جاء بعد التشعيع وضفروا على الرسم البياني أعلاه.
الرقم 6. تمثيل عشرات التصاق مقايسة من الجدول 1. وسجل لاصق الخلايا البطانية في خمسة مواقع مختلفة في ثلاث coverslips الزجاج كما هو موضح في الشكل (4) والنتائج جدولة أعلاه يدل على أنه بعد 12 يوما 10 غراي التشعيع، 8-10 في المئة من المشع أصبحت الخلايا البطانية لاصقة.
| 3 "> نسبة من مادة لاصقة | |||
| القرص 1 | القرص 2 | القرص 3 | |
| المجال 1 | 8.65 | 8.29 | 8.21 |
| الميدان (2) | 10.44 | 7.27 | 7.21 |
| الحقل 3 | 9.63 | 9.05 | 8.33 |
| الحقل 4 | 11.11 | 7.09 | 8.41 |
| المجال 5 | 10.55 | 9.4 | 11.61 |
| متوسط | 10.07 | 8.22 | 8.75 |
الجدول 1. التصاق عشرات الفحص. وسجل الخلايا البطانية لاصقة في خمسة مواقع مختلفة في ثلاث coverslips الزجاج كما هو موضح في Figure 4 ونتائج جدولة أعلاه يدل على أنه بعد 12 يوما 10 غراي التشعيع، أصبحت 8 الى 10 في المئة من الخلايا البطانية المشع لاصقة.
Discussion
تم استخدام فحص الوحيدات التصاق المذكورة أعلاه بنجاح في التجارب تهدف إلى دراسة التأثيرات البيولوجية للإشعاع المؤين على الطبقات الوحيدة البطانية 10. على الرغم من أن هذا ليس هو الأسلوب الوحيد المتاح لتقييم الإلتصاق من أحادي الطبقة البطانية، وهو الأسلوب الوحيد الذي يسمح الكمي لنسبة أو نسبة الخلايا البطانية في أحادي الطبقة التي هي لاصقة. هذا تمييز مهم كتغيير الكمي عالميا في التصاق حيدات، كما تم قياسها عن طريق وسائل أخرى يمكن أن تعزى إما إلى الارتفاع العام في الإلتصاق جميع خلايا أحادي الطبقة البطانية أو إلى زيادة الإلتصاق من السكان الفرعي من الخلايا البطانية ضمن أحادي الطبقة، كما هو موضح في المثال أعلاه. ويتمثل قيمة وجود هذه المعلومات من خلال حقيقة أن القدرة لقياس نسبة الخلايا البطانية التي عرضت تعزيز الإلتصاق بعد التشعيع أدى إلى إيناسوكانت النتيجة قادر أن هذا التأثير لا يعود إلى طفرة جينية من الجين على نحو خاص والنسبة المئوية للخلايا التي كانت لاصقة جدا فوق (أكثر من 1000 مرة) ما هو متوقع من طفرة عشوائية من الجينات التي كتبها X-الإشعاع عند هذه الجرعة .
العامل الذي يسمح استنساخ جيدة من النتائج هو نظام الغسيل. كما ينطوي على إجراء الغسيل غمر ساترة الزجاج في غسل العازلة تليها اللمس على الأنسجة، ويتم تجنب التقلبات في الاضطرابات العازلة التي تنشأ حتما من الطريقة القديمة المتمثلة في pipetting لمن غسل العازلة في بئر. في الواقع كان مراقبة التقلبات المفرطة بين مكررات تم الحصول عليها باستخدام أسلوب pipetting لأن أجبرتنا على وضع إجراءات الغسل أن إزالة عنصر التباين من خطوة الغسيل.
باعتراف الجميع، والقيود المفروضة على هذا الاختبار تكمن في الحاجة إلى إجراء العد اليدوي لمجموعات الوحيدات، والتي لا نبعد التمديد يسمح لها أن تتكيف لتحليل إنتاجية عالية. ثانيا، قرار بشأن كيفية تشكل العديد من وحيدات مجموعة أن تحدد شبه تعسفي ويمكن ضبط مستوى عال جدا ويؤدي إلى استبعاد بعض الكتل حقيقية. ويمكن أيضا لعدم وجود قوة القص في هذه الطريقة أن ينظر إليه باعتباره القيد في التجارب التي يسببها الإلتصاق معززة بشكل صارخ من الخلايا البطانية (على سبيل المثال، + TNFα). في حالات أخرى ومع ذلك، فإن عدم وجود قوة القص هي ميزة لأنها تتيح للكشف عن زيادة أقل مبالغ فيه من الإلتصاق. زيادة متواضعة في الوحيدات الإلتصاق يمكن أن تكون ذات أهمية خاصة وذات الصلة. في الجسم الحي، لن (في وقت تجريبي نموذجي) من المتوقع أن نعلق بأعداد كبيرة إلى الخلايا البطانية مع زيادة متواضعة في الإلتصاق، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى قوة القص وحيدات. في الوقت ومع ذلك، بعض وحيدات على الارجح، وهذا هو الأرجح لتمثيل البيئة من التهاب مزمن. كما،غياب قوة القص يمكن أن يكون ميزة، حيث أنه يوفر الفرصة لزيادة طفيفة في الإلتصاق الخلايا البطانية ان يعلن في الأطر الزمنية التجريبية التي عادة ما تكون قصيرة، وربما عابرة جدا للسماح زيادة متواضعة في الإلتصاق التي يتعين مراعاتها تحت إجهاد القص.
القدرة على إخضاع الخلايا بعد هذا الاختبار إلى تحليلات أخرى مثل فحص الشيخوخة والمناعي تلطيخ يزيد من فائدة هذه الطريقة لأنها تتيح للجمعية الإلتصاق من الخلايا البطانية محددة لخاصة البروتينات الخلوية أو الدول الخلوية كما هو موضح أعلاه، وهي الميزة التي غير متوفر مع فحوصات التصاق القديمة.
وقد استخدم هذا الأسلوب مع الخلايا التاجية الإنسان خلد est2 البطانية ونتائج مماثلة تم الحصول عليها أيضا مع الخلايا التاجية الإنسان الأساسية البطانية 10، مما يدل على أنه ليس خاصا فقط خط خلية معينة. أيضا، واللغطption هذه الطريقة من معايرة الإلتصاق من الخلايا البطانية لا يحول دون تعريض الخلايا نفسها لفحص التصاق القياسية التي تقيس مضان من immunocytes المسمى. معا، ويوضح هذا التقرير أن هذه الطريقة هي متعددة وشامل ويوفر المزيد من المعلومات من التصاق الفحص القياسية.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
| Glass coverslips Round 12 mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
| 24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
| Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
| Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
| Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
| Fibronectin | Sigma | F0895 |
References
- Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. Resolution of inflammation: an integrated view. EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).
- Libby, P. Inflammation and cardiovascular disease mechanisms. Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).
- Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion. Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).
- Watson, C., et al. IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes. Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).
- Sans, M., et al. VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis. Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).
- Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal. Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).
- Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium. Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).
- Lowe, D., Raj, K. Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression. Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).
