Abstract
सूजन के कार्डिनल प्रक्रियाओं में से एक के आसपास के ऊतकों को रक्त वाहिनियों के लुमेन से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ है। रक्त वाहिकाओं जो लाइन endothelial कोशिकाओं, ऐसे monocytes के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं परिसंचारी के लिए चिपकने वाला बन गया जब यह होता है। इस चिपचिपाहट की इन विट्रो माप अब एक सीधा गिनती के रूप में या तो एक endothelial परत का पालन करना है कि monocytes की कुल संख्या बढ़ाता द्वारा किया गया है जब तक या पक्षपाती monocytes के प्रतिदीप्ति के अप्रत्यक्ष माप के द्वारा। इस तरह के मापन endothelial सेल आबादी की औसत चिपचिपाहट का संकेत करते हैं, वे इस तरह के सेल नंबर के रूप में कारकों की एक संख्या से चकित कर रहे हैं, और वास्तव में चिपकने वाला हैं कि endothelial कोशिकाओं के अनुपात में प्रकट नहीं करते हैं। यहाँ हम वर्णन और endothelial monolayer के एक परीक्षण आबादी के भीतर चिपकने वाला कोशिकाओं की गणन अनुमति देता है एक विधि प्रदर्शित करता है। Endothelial कोशिकाओं कांच coverslips पर हो रहे हैं और इच्छित निम्नउपचार (कि fluorescently लेबल किया जा सकता है) monocytes के साथ चुनौती दी है। विसर्जन और निकासी के कई दौर से जुड़े ऊष्मायन, एक rinsing प्रक्रिया के बाद, कोशिकाओं तय कर रहे हैं। Monocytes से घिरे हैं जो चिपकने वाला endothelial कोशिकाओं, आसानी से पहचान की है और चिपकने वाला हैं कि आबादी के भीतर endothelial कोशिकाओं के वास्तविक अनुपात से पता चलता है कि एक आसंजन सूचकांक दे रही है, प्रगणित कर रहे हैं।
Introduction
जैसे रक्त वाहिकाओं कि लाइन endothelial सेल परत भर monocytes के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ सूजन 1 की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है। इस चोट की एक साइट के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं (immunocytes) के घर वापस आना अनुमति देता है। ऐसे कोरोनरी धमनी और मन्या धमनी के रूप में अन्य उदाहरण और स्थानों में, endothelial परत के माध्यम से monocytes के घुसपैठ संभावित सजीले टुकड़े 2 के गठन के लिए अग्रणी, धमनी की दीवार में इन कोशिकाओं के अवांछनीय लंबी अवधि के निवास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। Immunocyte घुसपैठ के सभी मामलों में, पहला कदम रक्त वाहिनियों की एक स्थानीय क्षेत्र में endothelial कोशिकाओं की सक्रियता से शामिल है। Endothelial कोशिकाओं ऐसे endothelial सेल सतह 3- पर immunocytes की भर्ती और कुर्की की सुविधा है, जो इस तरह के Vcam, ICAM और ई selectin के रूप में कोशिका की सतह प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए TNF-α और आईएल -6 के रूप में समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स द्वारा सक्रिय कर रहे हैं 6।
7 endothelial का पालन किया है कि monocytes गिनती से बाहर किया गया था। परिशुद्धता के संदर्भ में इस विधि की सीमाओं लिम्फोसाइट या monocytes आसंजन 4 से मेल खाती है जो रेडियोधर्मी सामग्री की मात्रा का ठहराव के द्वारा पीछा रेडियो लेबल लिम्फोसाइट या monocyte का उपयोग करते हैं, करने के लिए नेतृत्व किया। इस विधि के अंत में 8 मापा जाता है ब्याज की immunocytes फर्क बजाय रेडियोधर्मिता की है कि प्रतिदीप्ति होने के साथ ऊपर के रूप में एक ही प्रक्रिया के लिए प्रतिदीप्ति डाई के साथ लेबल और किए गए जिससे एक प्रतिदीप्ति आधारित पद्धति, से रह रहा था। वर्तमान में इस पद्धति का सबसे सुविधाजनक रूप में उभरा है और कई वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं द्वारा किट के रूप में बेचा जाता है। इस परख नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों के बीच चिपचिपाहट के रिश्तेदार के स्तर को मापने सकता है, यह प्रतिदीप्ति में एक परिवर्तन पूरे ई भर में चिपचिपाहट में एक समान परिवर्तन की वजह से है कि क्या प्रकट नहीं करता हैndothelial सेल की आबादी या परिवर्तन की वजह से कोशिकाओं के एक उप जनसंख्या के भीतर चिपचिपाहट के एक अंतर करने के लिए है। इसे धोने की तंगी परिणाम पर गहरा प्रभाव डाल रही है, और अधिक महत्वपूर्ण बात, विभिन्न endothelial सेल monolayers के बीच अपार monocytes बंद rinsing की एकरूपता नमूनों के बीच परिणामों की प्रतिकृति से परिणाम की निकटता और reproducibility पर काफी असर होगा कि यह भी स्पष्ट है । अभी हाल ही में एक endothelial सेल monolayer भर के मीडिया में monocytes पंप कि कई प्रणालियों इस समस्या 9 संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इसके अलावा, इन प्रवाह प्रणाली भी endothelial कोशिकाओं पर कतरनी बल के प्रभाव पुनरावृत्ति। ऐसी प्रणालियों का लाभ स्पष्ट और बहुत आकर्षक हैं जबकि तीव्र सूजन में मामला है, यह इस तरह इस तरह के विकिरण के रूप में TNFα, कुछ अन्य activators, जैसे कारकों से, endothelial सेल चिपचिपाहट बहुत संवर्धित किया जा सकता है, जबकि एहसास है कि यह भी महत्वपूर्ण है 10 निकालना टी में परिवर्तनटोपी आसानी से ये बहुत कड़े सिस्टम द्वारा इन विट्रो प्रयोगात्मक समय फ्रेम के भीतर का पता नहीं कर रहे हैं। Endothelial सेल चिपचिपाहट के ऐसे मिनट में परिवर्तन को आसानी से याद है या इन विट्रो में बर्खास्त कर दिया जाता है, यह जीर्ण सूजन की विशेषता है जो एक जीवन समय के भीतर इस तरह के छोटे-मोटे परिवर्तन, बहुत महत्वपूर्ण परिणामों लागू कर सकते हैं जहां विवो में जरूरी सौम्य नहीं है। इसलिए एक मजबूत, अभी तक संवेदनशील है, और विशेष विधि का पता लगाने और endothelial सेल चिपचिपाहट की जरूरत है मापने के लिए।
यहाँ, हम सीधे endothelial कोशिकाओं की चिपचिपाहट को मापने के लिए एक विधि की रिपोर्ट। इस विधि endothelial सेल चिपचिपाहट के एक अप्रत्यक्ष किराए की सूचक के रूप में प्रतिदीप्ति माप पर भरोसा नहीं करता। यह चिपचिपाहट में परिवर्तन के सभी कक्षों में एक समान परिवर्तन के कारण या एक उप-आबादी तक ही सीमित रहे हैं कि क्या पता चलता है। इसके अलावा, यह जीर्णता जुड़े बीटा galactosidase, सेल व्यवहार्यता मार्च के रूप में मार्कर के साथ endothelial कोशिकाओं के सह-धुंधला अनुमति देता हैKER, Calcien AM और निश्चित सेल राज्यों या विशिष्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अलग-अलग चिपकने वाला endothelial कोशिकाओं की एसोसिएशन की इजाजत दी कोशिका की सतह और intracellular प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी,।
Protocol
कांच coverslips के 1. तैयारी
- इथेनॉल के लिए सभी coverslips के कुल निवेश सुनिश्चित करने के लिए कभी कभी आंदोलन के साथ कम से कम 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में भिगोने से कांच coverslips दौर 12 मिमी व्यास जीवाणुरहित। एक बाँझ सेल संस्कृति डिश में कांच coverslips और इथेनॉल डालो (या तो 6 सेमी या 10 सेमी व्यास)।
- बाँझ ठीक 5 ब संदंश की एक जोड़ी के साथ, उठाओ और एक 24 अच्छी तरह से क्लस्टर थाली के एक कुएं में प्रत्येक व्यक्ति के कांच coverslip जगह है। Coverslips के साथ-साथ के पक्ष को छू और अच्छी तरह से बीच में लगभग नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखना।
- प्रवाह कैबिनेट में सूखने के लिए कांच coverslips के साथ संयुक्त राष्ट्र के कवर 24 अच्छी तरह से क्लस्टर थाली छोड़ दें। इस बारे में 10 मिनट लगते हैं
- इस अवधि के दौरान 0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) में 10 मिलीग्राम / एमएल मानव फ़ाइब्रोनेक्टिन गिराए द्वारा कोटिंग मिश्रण तैयार करें।
- Coverslips के सूख रहे हैं, प्रत्येक गिलास सह पर कोटिंग समाधान के पिपेट 100 μlइसलिए verslip समाधान अच्छी तरह के बाहर चारों ओर पूलिंग के बिना ही गिलास को शामिल किया गया। कम से कम एक घंटे के लिए एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में शामिल 24 में अच्छी तरह से क्लस्टर प्लेट रखें।
- बस का उपयोग करने से पहले, कोटिंग समाधान निकालें। एक ही कोटिंग समाधान के लिए एक बाँझ ट्यूब को हस्तांतरित और प्रभावकारिता का कोई स्पष्ट हानि के साथ तीन बार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Endothelial सेल monolayer के 2. तैयारी
- 37 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम और 5% कार्बन डाइऑक्साइड में संस्कृति मानव कोरोनरी धमनी endothelial कोशिकाओं (ईसी)।
- संस्कृति मीडिया से दूर Aspirate और 10 मिलीलीटर HBSS के साथ चुनाव आयोग monolayer कुल्ला
- HBSS के बंद महाप्राण और जोड़ने के 2 मिलीलीटर 0.5% trypsin, 0.2% EDTA समाधान। लगभग 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
- चुनाव आयोग कुप्पी की ओर करने के लिए एक नल से उखाड़ फेंकना जा सकता है, तो सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला के 5 मिलीलीटर जोड़ने और विंदुक के साथ आगे की कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए कुप्पी की सतह धार।
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण5 मिनट के लिए 200 XG पर।
- सतह पर तैरनेवाला बंद महाप्राण और मीडिया के 5 मिलीलीटर में चुनाव आयोग गोली resuspend। एक रुधिरकोशिकामापी के साथ कोशिकाओं की गणना और चुनाव आयोग मीडिया की मिलीलीटर प्रति 50,000 चुनाव आयोग के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें।
- लेपित गिलास coverslips युक्त 24 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर बांटना। 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक 5% कार्बन डाइऑक्साइड में सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में कोशिकाओं हे / एन सेते हैं।
- मिला हुआ monolayer के 3 दिन के भीतर का गठन किया गया है जब कोशिकाओं प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए तैयार हैं।
Monocytes के 3. तैयारी
- RPMI में संवर्धित कर रहे हैं कि हस्तांतरण एच एल-60 कोशिकाओं को एक 15ml ट्यूब में, निलंबन संस्कृति के रूप में, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक। 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
- 5 मिलीलीटर मीडिया में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं को हटाने और 2 मिलियन कोशिकाओं / एमएल करने के लिए मीडिया के साथ सेल एकाग्रता समायोजित करें। एच एल-60 के प्रतिदीप्ति लेबलिंग वांछित है, सीरम और जनसंपर्क के बिना RPMI में कोशिकाओं resuspendधारा 4 में वर्णित के रूप में oceed।
- 1 और 3 के बीच के समय का एक चुना निर्धारित अवधि के लिए चुनाव आयोग की monolayer युक्त 24 अच्छी तरह से क्लस्टर थाली के प्रत्येक कुएं में एच एल-60 सेल निलंबन के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड में एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में थाली सेते घंटा। थोड़ा अंतर बंधन संतृप्ति प्राप्त कर ली है, जहां 1 घंटे और 3 घंटा समय बिंदु के बीच मनाया जाता है।
- सेल धोने / कटाई के लिए तैयार: HBSS के 100 मिलीलीटर के साथ एक 120 मिलीलीटर ट्यूब भरें। एक ताजा 24 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में formalin के 1 मिलीलीटर बांटना।
- छूने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, ऊष्मायन अवधि के बाद, तेज संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें और अच्छी तरह से कांच coverslip उठाओ और ऊर्ध्वाधर coverslip पकड़ और 3 सेकंड के लिए बेंच पर ऊतक के एक टुकड़े पर coverslip के किनारे थपका ऊतक के साथ coverslip के सेल से ढके सतह।
- संदंश की एक जोड़ी के साथ मजबूती से coverslip होल्डिंग, में और HbSS पांच बार के बाहर coverslip डुबो देना।
- पांचवें डुबोना के बादHBSS में, 3 सेकंड के लिए ऊतक पर coverslip के किनारे थपका।
- एक थपका द्वारा पीछा 5 Dunks के तीन सेट की कुल बना, 3.6 और 3.7 में वर्णित dunking और dabbing प्रक्रियाओं को दोहराएँ।
- आरटी पर कोशिकाओं को ठीक करने के लिए एक अच्छी तरह से युक्त 10% formalin में coverslip के स्थानांतरण। coverslip, गणन के लिए तैयार लंबी अवधि के भंडारण के लिए या नीचे वर्णित अन्य प्रक्रियाओं के अधीन किया जा रहा है।
सेल ट्रैकर के साथ एच एल-60 कोशिकाओं के 4. लेबलिंग (वैकल्पिक)
- गणना और एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में एच एल-60 कोशिकाओं (उदाहरण के लिए, 10 लाख) की उचित राशि हस्तांतरण। अपकेंद्रित्र एच एल-60 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
- 1 मिलियन कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में सीरम के बिना RPMI मीडिया में सेल ट्रैकर में Resuspend सेल गोली। 1 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
- 200 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं 5 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 2 लाख सी के एक एकाग्रता के लिए मीडिया में Resuspend सेल गोलीएल / मिली।
- कांच coverslip पर हो प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त endothelial कोशिकाओं में सेल ट्रैकर लेबल एच एल-60 के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। 3.3 पर जारी रखें।
चिपकने वाला endothelial कोशिकाओं की 5. गणन
- माइक्रोस्कोप व्यक्ति की कोशिकाओं की पहचान करने के लिए DAPI के काउंटर दाग के साथ स्लाइड पर माउंट coverslips।
- एक 4X या 10X उद्देश्य के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, कई क्षेत्रों (उदाहरण के लिए, 5 क्षेत्रों) की छवियों के अधिग्रहण और संयुक्त राष्ट्र के विकिरणित endothelial कोशिकाओं पर कुल कि monocytes के उच्चतम संख्या (यह आमतौर पर 3-5) किया जाना चाहिए गिनती।
- एक endothelial सेल पर monocytes की दहलीज के रूप में दो बार इस संख्या सेट करें कि एक क्लस्टर के रूप में परिभाषित किया जाना है। यदि आवश्यक हो, एक अलग मानदंड का प्रयोग की प्रकृति पर निर्भर करता है एक क्लस्टर को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
- समूहों की संख्या और क्षेत्र में endothelial कोशिकाओं की संख्या की गणना। चिपकने वाला endothelial कोशिकाओं का प्रतिशत प्राप्त करने के बाद के द्वारा पूर्व फूट डालो। स्कोरकई क्षेत्रों में गिना जाता है के एक औसत और मानक विचलन प्राप्त करने के लिए।
एंटीबॉडी के साथ 6. counterstaining
- Coverslip पर आसंजन परख और कोशिकाओं आरटी पर 15 मिनट के लिए 10% formalin में तय किया गया है के बाद, मानक प्रक्रिया 10 और पसंद के एंटीबॉडी का उपयोग इम्यूनोफ्लोरेसेंस को coverslips के अधीन है।
- जोड़ें और कोशिकाओं endothelial से जुड़े होते हैं कि monocytes dislodging से बचने के लिए बहुत धीरे से विभिन्न समाधान निकाल दें।
बुढ़ापा जुड़े बीटा galactosidase गतिविधि के लिए 7. counterstaining
- Coverslip पर आसंजन परख और कोशिकाओं वार्धक्य जुड़े बीटा galactosidase गतिविधि के लिए 15 मिनट, दाग के लिए formalin में तय किया गया है के बाद धुंधला किट के साथ कि निर्देशों में वर्णित है। जोड़ें और कोशिकाओं endothelial से जुड़े होते हैं कि monocytes dislodging से बचने के लिए बहुत धीरे से विभिन्न समाधान निकाल दें।
Representative Results
इस विधि आबादी के भीतर अलग-अलग चिपकने वाला endothelial कोशिकाओं का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, संयुक्त राष्ट्र के विकिरणित endothelial कोशिकाओं की एक monolayer (पहले व्यक्ति endothelial कोशिकाओं के चारों ओर समूहों में monocytes से बंधे थे monocytes के साथ ऊष्मायन के लिए 7 दिनों के बाद 10Gy विकिरण पर ऊष्मायन और कपड़े धोने, endothelial monolayer निम्नलिखित कुछ छिटपुट एच एल-60 monocytes बरकरार रखा है, जबकि चित्र 1)। इस घटना चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत आसानी से मानने योग्य है हालांकि, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी monocyte समूहों की एक भी साफ छवि का पता चलता है।
वर्णित आसंजन परख प्रदर्शन के बाद, यह मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस तरीकों के साथ उचित एंटीबॉडी का उपयोग झिल्ली, cytoplasmic या परमाणु (चित्रा 2) के लिए प्रोटीन कोशिकाओं को धुंधला करने के लिए आगे बढ़ने के लिए संभव है। इसके अलावा, इस तरह के वार्धक्य जुड़े बीटा galactosidase (चित्रा 3) के रूप में एंजाइम आधारित परख भी पीई किया जा सकता हैrformed।
प्रत्येक monocyte क्लस्टर एक व्यक्ति endothelial सेल से मेल खाती है के बाद से, समूहों का गणन monolayer के भीतर चिपकने वाला endothelial कोशिकाओं की वास्तविक संख्या खोलेगा (चित्रा 4), और जनसंख्या के भीतर चिपकने वाला endothelial कोशिकाओं की इसलिए प्रतिशत (1 टेबल, चित्रा 6) । इस endothelial सेल चिपचिपाहट की इतनी मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है कि तिथि करने के लिए एकमात्र तरीका है। यह यहां प्रयोगों में इस्तेमाल endothelial कोशिकाओं संपर्क-हिचकते हैं और संगम को प्राप्त करने के बाद संख्या में वृद्धि नहीं करते उल्लेखनीय है कि। यह बाद में समय बिंदुओं पर वृद्धि हुई endothelial सेल नंबर से उत्पन्न संभावित जटिलता समाप्त। अगर वांछित, endothelial monolayers से जुड़ी monocytes (3.9 में के बजाय नियतन) 0.5% ट्रिप्सिन-0.2% EDTA समाधान से उखाड़ फेंकना जा सकता है और समकालीन तरीकों में मामला (चित्रा 5) के रूप में उनके प्रतिदीप्ति, एक प्लेट रीडर का उपयोग मापा जाता है। 
Endothelial कोशिकाओं के monolayer पर monocytes के चित्रा 1. आसंजन। संयुक्त राष्ट्र के विकिरणित endothelial कोशिकाओं पर, monocytes एक छिटपुट और बेतरतीब ढंग से व्यक्ति की कोशिकाओं (पैनल छोड़ दिया है) के रूप में और बाद में 10 Gy के विकिरणित 7 दिनों के व्यक्तिगत endothelial कोशिकाओं पर समूहों में पालन monolayer (सही पैनल)। कम पैनल चरण विपरीत तहत दिखाई छोटे और चमकदार गोलाकार कोशिकाओं वास्तव में सेल ट्रैकर ग्रीन के साथ पूर्व लेबल रहे थे कि monocytes हैं कि इस बात की पुष्टि शीर्ष पैनल के प्रतिदीप्ति छवियों, कर रहे हैं। Monocyte समूहों में से कुछ सफेद तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं। छवियाँ एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर लिया गया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
प्रोटीन के बाद आसंजन परख के लिए endothelial कोशिकाओं की चित्रा 2. धुंधला हो जाना। वर्णित आसंजन परख प्रदर्शन के बाद, कांच coverslips पर कोशिकाओं (ए) झिल्ली प्रोटीन का पता लगाने (CD44) के लिए immunofluorescence के अधीन थे, ख) cytoplasmic प्रोटीन (ट्यूबिलिन) या ग) परमाणु प्रोटीन (γ-H2AX)। (ए) और शो monocytes सेल ट्रैकर ग्रीन और सही पैनल पर भी इसी छवि के साथ पूर्व लेबल (20x उद्देश्य के साथ देखा) (बी) के वाम पैनल CD44 और सूक्ष्मनलिकाएं (लाल) और DAPI से सना हुआ नाभिक (नीला) प्रकट करते हैं। Γ-H2AX के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे कि विकिरणित endothelial सेल नाभिक के लिए (सी) बिंदु में व्हाइट तीर। DAPI के द्वारा एक उज्जवल नीला दाग रहे हैं जो Monocyte नाभिक आसानी से endothelial कोशिकाओं की अंडाकार आकार का नाभिक से प्रतिष्ठित हैं। छवियाँ 20X उद्देश्य से ले जाया गया। jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Endothelial सेल में स्पष्ट है के रूप में endothelial कोशिकाओं की चित्रा 3. बुढ़ापा जुड़े बीटा galactosidase धुंधला। आसंजन परख के बाद, coverslips पर कोशिकाओं, वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के लाइसोसोम नीले रंग की बारी का कारण बनता है जो वार्धक्य जुड़े बीटा galactosidase के लिए धुंधला किए थे कि चुनिंदा कारण उनके छोटे आकार और गोलाकार आकृति को आसानी से पहचान कर रहे हैं जो कई monocytes, से बाध्य है। 20X उद्देश्य के माध्यम से देखा छवि। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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व्यक्तिगत endothelial कोशिकाओं पर monocyte समूहों की चित्रा 4. गणन। आसंजन परख के बाद, कोशिकाओं की छवियों की पहचान की कई अलग अलग स्थानों और monocyte समूहों से लिया गया था और (हरे रंग में) की परिक्रमा की। एक क्लस्टर एक endothelial सेल पर 10 या उससे अधिक monocytes के एक ढेर के रूप में परिभाषित किया गया था। छवि में monocyte समूहों और 12 दिनों के बाद विकिरणित endothelial कोशिकाओं की संख्या की संख्या (लाल रंग में बिंदीदार) गिना रहे थे और गणना की पक्षपाती endothelial कोशिकाओं का प्रतिशत 10X उद्देश्य के माध्यम से लिया तालिका 1। छवि में दिखाया गया है। एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण।
चित्रा पक्षपाती monocytes के प्रतिदीप्ति 5. मात्रा। बाद adhe सायन परख, कांच coverslips पर कक्षों trypsinised गया और monocytes के प्रतिदीप्ति एन्दोथेलिअल monolayer के चिपचिपाहट के एक अप्रत्यक्ष संकेत के रूप में, एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग, मापा गया था CellTracker ग्रीन के साथ पूर्व लेबल। कहा दिनों के बाद विकिरण पर इस तरह के माप से प्राप्त परिणामों और ऊपर ग्राफ पर गूंथकर गया।
चित्रा 4 में वर्णित और परिणाम विकिरणित की है कि 12 दिनों के बाद 10 Gy के विकिरण, 8 से 10 प्रतिशत का प्रदर्शन से ऊपर सारणीबद्ध रूप में तीन गिलास coverslips पर पांच अलग-अलग स्थानों में 1. चिपकने वाला endothelial कोशिकाओं रन बनाए थे तालिका से आसंजन परख स्कोर के 6 चित्रा प्रतिनिधित्व endothelial कोशिकाओं चिपकने वाला बन गया।
| 3 "> चिपकने वाला का प्रतिशत | |||
| डिस्क 1 | डिस्क 2 | 3 डिस्क | |
| फील्ड: 1 | 8.65 | 8.29 | 8.21 |
| 2 फील्ड | 10.44 | 7.27 | 7.21 |
| फील्ड 3 | 9.63 | 9.05 | 8.33 |
| फ़ील्ड 4 | 11.11 | 7.09 | 8.41 |
| फील्ड 5 | 10.55 | 9.4 | 11.61 |
| औसत | 10.07 | 8.22 | 8.75 |
तालिका 1 आसंजन परख स्कोर। एफ में वर्णित के रूप में तीन गिलास coverslips पर पांच अलग-अलग स्थानों में चिपकने वाला endothelial कोशिकाओं रन बनाए थेigure 4 और परिणाम 12 दिनों में 10 Gy के विकिरण के बाद, विकिरणित endothelial कोशिकाओं के 8 से 10 प्रतिशत चिपकने वाला बन गया है कि प्रदर्शन के ऊपर सारणीबद्ध।
Discussion
ऊपर वर्णित monocyte आसंजन परख एन्दोथेलिअल monolayers के 10 पर विकिरण का जैविक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए डिजाइन प्रयोगों में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया था। यह एक endothelial monolayer के चिपचिपाहट का आकलन करने के लिए उपलब्ध एकमात्र तरीका नहीं है, यद्यपि यह चिपकने वाला है कि एक monolayer के भीतर अनुपात या endothelial कोशिकाओं का प्रतिशत की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है कि एकमात्र तरीका है। इस monocytes के आसंजन में एक वैश्विक मात्रात्मक परिवर्तन के रूप में एक महत्वपूर्ण अंतर है, अन्य तरीकों से मापा एन्दोथेलिअल monolayer के या endothelial कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या की वृद्धि चिपचिपाहट के लिए सभी कोशिकाओं की चिपचिपाहट में एक सामान्य वृद्धि करने के लिए या तो जिम्मेदार ठहराया जा सकता है monolayer के भीतर, के रूप में ऊपर के उदाहरण में दिखाया गया है। इस जानकारी होने के मूल्य विकिरण इनेस का नेतृत्व करने के बाद क्षमता में इजाफा चिपचिपाहट का प्रदर्शन किया है कि endothelial कोशिकाओं का प्रतिशत यों के लिए तथ्य यह है कि द्वारा उदाहरण हैइस आशय चिपकने वाला थे कि कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में एक विशेष जीन के आनुवंशिक उत्परिवर्तन के कारण नहीं है कि सक्षम निष्कर्ष है कि खुराक में एक्स-विकिरण से एक जीन के यादृच्छिक उत्परिवर्तन से उम्मीद होगी जो कि (1,000 गुना अधिक) के ऊपर बहुत थे ।
परिणामों की अच्छी reproducibility के लिए अनुमति देता है कि कारक धोने शासन है। कपड़े धोने की प्रक्रिया एक ऊतक पर dabbing द्वारा पीछा धोने बफर में कांच coverslip के विसर्जन शामिल है, अनिवार्य रूप से एक कुएं में धो बफर के pipetting की पुरानी पद्धति से उत्पन्न होती है जो बफर अशांति में परिवर्तनशीलता बचा है। दरअसल यह धोने कदम से परिवर्तनशीलता तत्व निकाल दिया कि एक कपड़े धोने की प्रक्रिया वसीयत करने के लिए हमें मजबूर है कि pipetting विधि का उपयोग कर प्राप्त प्रतिकृति के बीच अत्यधिक परिवर्तनशीलता का अवलोकन किया गया था।
वैसे, जरूरत इस परख झूठ की सीमाओं n करते हैं जो monocyte समूहों का मार्गदर्शन गिनती, बाहर ले जाने के लिएओ.टी. उच्च throughput विश्लेषण के लिए यह अनुकूलित किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं। दूसरे, कई monocytes एक क्लस्टर का गठन कैसे पर निर्णय अर्द्ध मनमाने ढंग से निर्धारित किया जाना है और यह स्तर बहुत अधिक सेट और कुछ वास्तविक समूहों के बहिष्कार का परिणाम हो सकता है। इस विधि में कतरनी बल की कमी भी endothelial कोशिकाओं की निहायत बढ़ाया चिपचिपाहट प्रेरित है, जिसमें प्रयोगों (उदाहरण के लिए, + TNFα) में एक सीमा के रूप में देखा जा सकता है। यह चिपचिपाहट के कम अतिरंजित वृद्धि का पता लगाने के लिए अनुमति देता है के रूप में अन्य स्थितियों में हालांकि, कतरनी बल की कमी के कारण एक फायदा है। Monocyte चिपचिपाहट में मामूली वृद्धि विशेष रूप से महत्वपूर्ण और प्रासंगिक हो सकता है। में vivo, monocytes (एक ठेठ प्रयोगात्मक समय में) बल कतरनी की वजह चिपचिपाहट में मामूली वृद्धि हुई है, के साथ कोशिकाओं endothelial करने के लिए बड़ी संख्या में संलग्न करने के लिए उम्मीद नहीं की जा होगा। कुछ ही समय में हालांकि, कुछ monocytes शायद होगा, और इस जीर्ण सूजन का वातावरण प्रतिनिधित्व करने के लिए और अधिक होने की संभावना है। जैसे की,यह चिपचिपाहट में मामूली वृद्धि कतरनी तनाव के तहत मनाया जा करने की अनुमति के लिए आम तौर पर कम है और संभवतः भी क्षणभंगुर हैं जो प्रयोगात्मक समय फ्रेम में सामने उजागर हो endothelial सेल चिपचिपाहट में छोटे वृद्धि के लिए अवसर प्रदान करता है के रूप में कतरनी बल के अभाव एक फायदा हो सकता है।
प्रदर्शन के ऊपर के रूप में यह विशेष रूप से सेलुलर प्रोटीन या सेलुलर राज्यों को विशिष्ट endothelial कोशिकाओं की चिपचिपाहट की एसोसिएशन की अनुमति देता है के रूप में इस तरह के वार्धक्य परख और immunofluorescence धुंधला के रूप में अन्य विश्लेषण करने के लिए इस परख के बाद कोशिकाओं के अधीन करने की क्षमता, एक विशेषता यह इस पद्धति की उपयोगिता बढ़ जाती है कि पुराने आसंजन assays के साथ उपलब्ध नहीं है।
इस विधि est2-अमर मानव कोरोनरी endothelial कोशिकाओं और इसी तरह के परिणामों के साथ इस्तेमाल किया गया है भी कि यह सिर्फ एक विशेष सेल लाइन के लिए विशिष्ट नहीं है कि प्रदर्शन, प्राथमिक मानव कोरोनरी endothelial कोशिकाओं 10 के साथ प्राप्त किया गया। इसके अलावा, हलचलendothelial कोशिकाओं की चिपचिपाहट परख करने की क्रिया की इस पद्धति का ption में लेबल immunocytes के प्रतिदीप्ति उपाय है कि मानक आसंजन परख करने के लिए एक ही कोशिकाओं को subjecting बाधा नहीं है। साथ में, इस रिपोर्ट में इस विधि, समावेशी बहुमुखी और मानक आसंजन परख की तुलना में बहुत अधिक जानकारी प्रदान करता है कि यह दर्शाता है।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
| Glass coverslips Round 12 mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
| 24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
| Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
| Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
| Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
| Fibronectin | Sigma | F0895 |
References
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