Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات

Published: September 24, 2015 doi: 10.3791/52925
Automatic Translation
1, 2
1Broad Institute, 2Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

Abstract

المقايسات الرقمية وطرق القوية التي تمكن الكشف عن خلايا نادرة وفرز الفردية جزيئات الحمض النووي. ومع ذلك، المقايسات الرقمية لا تزال لم تطبق بشكل روتيني، وذلك بسبب التكلفة ومعدات معينة المرتبطة بالطرق المتاحة تجاريا. هنا نقدم طريقة مبسطة لقراءات من المقايسات قطرة الرقمية باستخدام الوقت الحقيقي PCR التقليدية أداة لقياس مضان الجزء الأكبر من المقايسات الرقمية القائمة على الحبرية.

نحن تميز أداء فحص قراءات بالجملة باستخدام خليط من قطرة الاصطناعية وقطرات الرقمي المتعدد التضخيم التشرد (MDA) فحص. الكمية MDA ولا سيما الفوائد من تنسيق رد فعل الرقمي، ولكن ينطبق أسلوب جديد لدينا على أي فحص الرقمي. لإنشاء بروتوكولات الفحص الرقمية مثل PCR الرقمي، ويقدم طريقة لتسريع وتبسيط فحص قراءات.

لدينا منهجية قراءات الأكبر يجلب مزايا partitioneد فحوصات دون الحاجة إلى متخصص قراءات أجهزة القياس. يتم تخفيض القيود الرئيسية للمنهجية قراءات السائبة النطاق الديناميكي مقارنة مع منصات القطيرات العد والحاجة لعينة القياسية، على الرغم من أن متطلبات هذا المعيار هي أقل تطلبا من لتجربة في الوقت الحقيقي التقليدية. يستخدم الكمي كامل الجينوم التضخيم (WGA) لاختبار الملوثات في ردود الفعل وغ وهي الطريقة الأكثر حساسية للكشف عن وجود شظايا الحمض النووي مع تسلسل غير معروفة، مما يتيح أسلوب الوعد الكبير في مجالات التطبيق المختلفة بما في ذلك مراقبة الجودة الدوائية والبيولوجيا الفلكية.

Introduction

المقايسات الرقمية للحمض النووي الكمي (PCR الرقمي) 1-4 وقاعدة النظام (التسلسل) والتي تؤثر بشدة علوم الحياة والطب. توفر فحوصات الرقمية الكمي من التهم الجزيئية على نطاق المطلق (وليس نسبة إلى عنصر تحكم)، وتوفير حساسية عالية، مما المقارنات السطحية عبر التجارب، وبشكل حاسم، وتمكن من بناء قواعد البيانات الكبيرة التي تحتوي على بيانات قابلة للمقارنة 5 (الجدول 1).

على مدى السنوات ال 15 الماضية، برزت كامل الجينوم التضخيم (WGA) جنبا إلى جنب مع PCR كأداة العامة لتضخيم الحمض النووي. مثل PCR، WGA مفيد للتطبيقات التحليلية وإعدادي عن طريق تضخيم عناصر عينة دقيقة تصل إلى المستوى الذي يمكن الكشف بسهولة أو استخدامها لتحليلات لاحقة مثل قاعدة التسلسل. على عكس PCR، WGA ليست محددة لموضع DNA معين، بدلا مما يسمح التضخيم من جميع متواليات في العينة، بما في ذلك تسلسل غير معروفة.هذا الاختلاف الجوهري بين PCR وWGA يجعل الطرق مكملة لبعضها البعض، وتثير تحديات مختلفة في تطبيقها.

ارتفاع العائد من ردود الفعل وغ 6 يمكن التضخيم الروتيني من الحمض النووي الجيني من الجزيئات واحدة 7، 8 خلايا واحدة وغيرها من العينات الكتلة الحيوية منخفضة 9 لتقدير أو مزيد من التحليل. التحديات الرئيسية المرتبطة الكيمياء WGA هي الحساسية المفرطة لالملوثات والتضخيم غير المتكافئ عبر جزيئات قالب الفردية 6. برز ومع ذلك، WGA تكتسب شعبية والتسلسل وحيدة الخلية مثل "تطبيق القاتل" التكنولوجيا WGA 10، وقالب الكمي من قبل WGA المهم في العديد من مجالات التطبيق 7.

تم الأجهزة الرقمية لالكمي الحمض النووي الموصوفة سابقا في مجموعة متنوعة من محكم بصمام وعديم الصمامات الشكل ميكروفلويديكنهاية الخبر 11-14، بما في ذلك فحوصات القائم على قطرة 15،16 (الجدول 2). ومع ذلك، نظم ميكروفلويديك التجارية للتحليل الرقمي تتطلب معدات متخصصة لإعداد رد فعل وكشف المنتج 17. على microfluidics المزودة بصمامات مخصصة مرنة، ولكنها تتطلب دقة التصنيع الدقيق وأنظمة التحكم بالهواء المضغوط 18. في حين أنها بسيطة نسبيا لجعل monodisperse قطرات متناهية الصغر، التى تستند إلى مستحلب المقايسات الرقمية 19،20، قراءات رقمية هي مرهقة من الناحية الفنية، والتي تتطلب إما على نطاق واسع التصوير واسعة المجال (على غرار تقنيات التسلسل الجيل المقبل من شعبية) 21،22 أو القائم على تدفق عالية السرعة كشف قطرة 23-25. من الناحية المثالية، فإن فحص الرقمية تكون بسيطة من انشاء لقراءات، والحد من الحاجة إلى أجهزة معقدة والسماح أعداد كبيرة من العينات في أن تقرأ بسرعة. نحن هنا تصف طريقة مبسطة لقراءات من المقايسات قطرة الرقمية التي تستخدم في الوقت الحقيقي التقليدي PCR طnstrument لقياس مضان الجزء الأكبر من المقايسات الرقمية القائمة على الحبرية.

في حين أن نهج جديد يمكن تطبيقه على المقايسات PCR الرقمية، فإنه من المفيد بشكل خاص لفحوصات وغ الرقمية التي التناظرية المقايسات التضخيم في الوقت الحقيقي (التي تعطي نتائج ممتازة للPCR) هي إشكالية. يتم تطبيق WGA عادة عينات مع جزيئات قالب التي هي غير متجانسة في تسلسل، وطول، ومحتوى قاعدة. وتتضخم هذه الجزيئات قالب مختلف بمعدلات مختلفة 6، مما يستدعي استخدام إشارة ("القياسية") عينة ذات خصائص مطابقة. في كثير من الأحيان، لا يوجد مثل هذا المعيار هو متاح، أو خصائص العينات الواردة غير معروفة. عدم تجانس المواد المدخلات والممتلكات التي تعتمد على طول كيمياء WGA 26 أيضا تعقيد تفسير النتائج من خلال خلق غموض في ما يجري كميا - كتلة المدخلات، وعدد المدخلات من الجزيئات، وهو مزيج من الاثنين، أو لا. Fومكونا، للتسلسل غير خصوصية تجعل الكمي متعددة التضخيم التشرد (MDA) أكثر حساسية للتلوث من الكمي PCR منذ الجزيئات الملوثة من أي تسلسل لديها القدرة على التدخل. وتتناول المقايسات الرقمية ميكروفلويديك التلوث خلال فصل جزيئات قالب والحد من كميات رد فعل مثل أن عددا أقل من الملوثات يتم أخذ عينات.

هنا نستخدم طريقة WGA متحاور شعبية، MDA 27. وتجدر الإشارة، عدة كيمياء WGA الأخرى بما في ذلك PicoPlex وMALBAC 28 تعتمد بشكل حاسم على الخطوات النزوح متساوي الحرارة حبلا الأولية. خطوات متساوي الحرارة تؤدي إلى تفاقم التحدي المتمثل في تطبيق فحوصات في الوقت الحقيقي التناظرية لالكمي WGA. WGA لا يمكنها أن تمنع تماما أثناء الإعداد، مما يؤدي إلى متغير غير المرغوب فيها قبل التضخيم، ولا discretized ("تدوير") بطريقة حيث يمكن أن تكون مدفوعة تكرار جزيئات غير متجانسة على الانتهاء، وتوقفت قبل الدورة القادمة مثل PCR 11 (الشكل 1). صيغة الفحص الرقمي للWGA تتسع إجراءات الإعداد رد فعل نموذجية بسبب الفصل بين كل جزيء لتعداد عند نقطة الفحص (حتى ما قبل التضخيم لا يؤثر على النتائج) قراءات الأصلية تعني أن دقة مستقلة إلى حد كبير من الاختلاف في كفاءة التضخيم.

الفحص يعتمد على قطرات إنتاجها في النفط مع وحدات التخزين موحدة، حيث أن مستوى الإشارة في قطرة عند نقطة الفحص سوف تعتمد على حجم القطيرات، ونحن لا نريد اتساق النتائج تعتمد على المتوسط ​​عبر توزيع أحجام قطرات. جعل قطرات monodisperse الآن إجراء القياسي (وقد نشرت حول 3500 أوراق قطرة monodisperse منذ 2013)، ولكنها تتطلب الأجهزة ميكروفلويديك 25. في الواقع، أكثر من ست شركات تطوير المنتجات التجارية المستقلة التي تعتمد على إنتاج مثل هذه القطرات، وصنع قطرات رقائق ميكروفلويديك هممتوفرة تجاريا 23،29. لهذه الدراسة، كنا أجهزة ميكروفلويديك مخصصة أنتجت في المنزل (انظر البروتوكول). مضخات حقنة لدفع التدفق من خلال الأجهزة وتتوفر أيضا تجاريا، ولكن بدلا من ذلك، يمكن أن تكون بديلا مع الحقنة وحيدة لتدفق يحركها الفراغ لخفض التكاليف 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: افتعال الجهاز ميكروفلويديك ليس من الضروري لهذا الاختبار، وقطرات لهذا البروتوكول يمكن تشكيلها مع صانعي قطرة التجارية القائمة 23،29.

1. جعل الجهاز ميكروفلويديك القطرة تشكيل

  1. إعداد القالب الرئيسي للقنوات مع بروتوكول تصنيع ماستر SU-8 المبينة سابقا 31، ولكن مع وجود نمط قناع مولد قطرة 32.
  2. صنع أجهزة في PDMS باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة 32،33.

2. إعداد رد فعل ميكس للالسائبة القطرة قراءات


ملاحظة: بروتوكول يمكن استخدامها لقياس الأحماض النووية باستخدام أنواع عديدة من ردود الفعل التضخيم. وكمثال على ذلك، وبالنظر إلى الكواشف اللازمة لنجمة داود الحمراء في عدة تجمعات لامبدا DNA. يتم سرد تفاصيل كاشف في جدول الكواشف محددة. توزيع قالب داخل قطرات يعتمد على sufficienتي خلط العينة.

  1. الحصول على أو نق Phi29 DNA البلمرة.
    1. تنقية Phi29 كما هو موضح سابقا 7، أو الشراء من المورد. وتنقيته من Phi29 المستخدمة في التجارب مبين.
  2. إعداد 10 مل من تمسخ عازلة مكونة من 65 ملي KOH، 1.65 ملي EDTA، و 14 ملي DTT.
  3. إعداد 10 مل من تحييد العازلة التي تتكون من 65 ملم حمض الهيدروكلوريك، 0.21 M تريس، الكلور ودرجة الحموضة 7.0 و 9 ملي تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.0.
  4. إعداد معايير اثنين، واحد لا سيطرة القالب (NTC) مثل nuclease خالية من المياه، واحد تركيز قالب عالية (حوالي 4 غ / ميكرولتر امدا DNA). تفسد 3.3 ميكرولتر من كل مستوى مع 3.3 ميكرولتر من تمسخ العازلة في أنبوب QPCR. في احتضان RT لمدة 3 دقائق. إخماد كل منها 3.3 ميكرولتر من تحييد العازلة.
  5. تفسد 3.3 ميكرولتر من القالب في المصالح مع 3.3 ميكرولتر من تمسخ العازلة في أنبوب QPCR. في احتضان RT لمدة 3 دقائق. إخماد مع 3.3 ميكرولترمن تحييد العازلة.
  6. إعداد 11 ميكرولتر من مزيج الرئيسي لكل عينة على الجليد. يتكون 2X MDA خليط سيد رد فعل من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل 2X (dsDNA) صبغة ملزمة، 2X QPCR إشارة صبغ، 50 ميكرومتر العشوائية بنسبة ضئيلة، 2 ملغ / مل BSA، 2X Phi29 البلمرة DNA رد فعل مؤقت، 4.8 ملي dNTPs، خالية من المياه ، و 40 ميكروغرام / مل Phi29 DNA البلمرة. إضافة Phi29 DNA بوليميريز الماضي لضمان البلمرة لا تواجه مستويات الحموضة أعلى من ذلك بكثير أو أقل من 7.5.Mix جيدا.
  7. اختياري: للحصول على عدد أقل من ايجابيات كاذبة، فضح مزيج الرئيسي للأشعة فوق البنفسجية قبل تشكيل قطرات 34.
    1. إعداد 10 ميكرولتر من قبل مزيج لكل عينة في 0.5 مل أو 1.5 مل أنبوب واضح على الجليد. ويتكون ما قبل مزيج من 55 ميكرومتر بنسبة ضئيلة العشوائية، 2.2 ملغ / مل BSA، 1.1x Phi29 البلمرة DNA رد فعل مؤقت، 5.3 ملي dNTPs، وnuclease خالية من المياه.
    2. وضع أنبوب في المياه على الجليد كما هو موضح 34 و فضح لضوء الأشعة فوق البنفسجية (254 نانومتر) إلى هددتجرعة mulated 5.7 J / سم 2.
    3. إضافة صبغة dsDNA ملزم ل1x أخرى، صبغ إشارة إلى 1x أخرى، وPhi29 إلى 40 ميكروغرام / مل في مرحلة ما قبل الخليط. تخلط جيدا.
  8. الجمع بين 10 ميكرولتر من قالب التشويه والتحريف أو معيار و10 ميكرولتر من مزيج الرئيسي. تخلط جيدا.

3. تشكيل القطرة

ملاحظة: يمكن القطرات تكون حساسة جدا لالكهرباء الساكنة وإجهاد القص. إزالة الملابس التي قد تسبب الكهرباء الساكنة، والأرض نفسك قبل تشكيل قطرات. التعامل مع أنابيب من مستحلب من أعلى الأنبوب، بعيدة عن مستحلب وقت ممكن. المستحلبات ماصة ببطء شديد، ويفضل أن يكون مع طرف واسعة تحمل الماصة. عندما الاستغناء من طرف ماصة، ومشاهدة مستحلب على الجانب من طرف لتحديد سرعة pipetting ل.

  1. قطرات النموذج. لالتجارب أظهرت، الجهاز ميكروفلويديك له مدخل النفط واثنين من مداخل المائية مع تقاطع مع التركيز تدفق لتوليد قطرات. استخدام اثنين بسوريانجى مضخات للسيطرة على معدلات تدفق 55 ميكرولتر من النفط مع السطحي و 20 ميكرولتر من خليط التفاعل من خلال رقاقة ميكروفلويديك لتوليد 20،000 1 قطرات نيكولا لانغ.
  2. ملاحظة: من الممكن أن تنتج قطرات مع العديد من أنواع النفط مع السطحي، ولكن تكوين تؤثر بشكل كبير الاستقرار القطيرات في درجات حرارة عالية وعلى مر الزمن. واحد تركيبة ممكنة هو HFE النفط المفلورة 7500 مع السطحي أنيوني 19،35.
  3. إنتاج قطرات في أي حجم مع أي وسيلة 13،36، إلا أن التباين في حجم السكان قطرة تؤثر على مضان الأكبر، وبالتالي دقة الفحص. للتجارب مبين، كانت قطرات monodisperse مع حجم 1 NL.
  4. جمع كل من قطرات والنفط في أنابيب PCR. لكل عينة، قسامة 30 ميكرولتر من النفط في أنابيب PCR جديدة مع قبعات البصرية، ونقل 20 ميكرولتر من قطرات على رأس النفط. أحجام متناسقة تضمن الفحص كما هو ميلانالإشراف ممكن.
  5. انهيار أنبوب قبعات بإحكام، وقبعات فضفاضة سيسمح للنفط لتتبخر.

4. متساوي التضخيم

  1. باستخدام thermocycler PCR، QPCR thermocycler، أو صفيحة ساخنة، واحتضان العينات عند 30 درجة مئوية لمدة 7 ساعات، وتعطيل لمدة 1 دقيقة في 75 ° C. قد يكون غادر الأنابيب من قطرات في الثلاجة مغطاة بورق لبضع ساعات في هذه المرحلة.

5. اكتساب وتحليل البيانات

  1. مباشرة بعد تعطيل رد الفعل، وقياس مستويات مضان صبغ لجميع العينات باستخدام thermocycler QPCR. سيعتمد إعدادات التصفية المثلى على الإثارة صبغ والأطياف الانبعاثات. على سبيل المثال، استخدم 492 نانومتر 516 نانومتر مرشح المحددة للصبغة dsDNA ملزم، وتصفية 585 نانومتر 610 نانومتر المحددة للصبغة المرجعية. ويمكن استخدام تقنيات قياس الفلورسنت أخرى لقياس مضان.
  2. لكل عينة، تقسيم كثافة مضان من صبغ dsDNA ملزم من قبلكثافة مضان من صبغ المرجعية. طرح مضان الخلفية، أو مضان تطبيع للسيطرة أي قالب، من جميع العينات.
  3. إنشاء منحنى القياسية الخطية باستخدام القياسات مضان تصحيح من المعايير. يمثل مستوى المجلس الوطني الانتقالي في مضان لعينة مع 0٪ قطرات الفلورسنت ("جميع السلبي")، والقالب عالية قياس تركيز مضان هو مضان المتوقع للعينة مع 100٪ قطرات الفلورسنت ("كلها إيجابية"). باستخدام المنحنى القياسي المقابل، توقع نسب متوسطة من قطرات الإيجابية والسلبية على أساس مضان معظم بهم.

6. إنتاج قطرات لقياسات إثبات صحة المبدأ

  1. جعل الفلورسنت (إيجابية) قطرات: إعداد خليط التفاعل PCR تتألف من 0.1 نانوغرام امدا DNA، صبغ 1X dsDNA ملزم، 1X صبغ المرجعية، 1،5 وحدة طق البلمرة DNA، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 50MM بوكل، 1.5 مترM MgCl 2، 0.2 ملي dNTP، و 0.5 ميكرومتر التمهيدي. Thermocycle الخليط 30 مرات (95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة)، ثم تشكيل قطرات كما هو موضح أعلاه.
  2. جعل عدم الفلورسنت (السلبية) قطرات: إعداد خليط التفاعل PCR تتألف من صبغ 1X dsDNA ملزم، 1X إشارة صبغ، 1،5 وحدة طق DNA البلمرة، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 50MM بوكل، 1.5 ملي MgCl 2، 0.2 ملي dNTP، و 0.5 ميكرومتر التمهيدي. Thermocycle الخليط 30 مرات (95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة)، ثم شكل قطرات.
  3. تشكيل نسب قطرة قبل مختلطة
    1. توزيع 20 ميكرولتر من النفط المفلورة في أنابيب QPCR، وتغطي مع غطاء الضوئية لمنع التبخر.
    2. ماصة بلطف 10 ميكرولتر من قطرات جيدة الامتزاج في الإيجابية المرجوة: نسب السلبية على الجزء العلوي من النفط. في النتائج المعروضة، الإيجابية: كانت نسب قطرة السلبية 1 (كلها إيجابية)، 0.8، 0.5، 0.2، 0.1، 0.01، 0.001، 0.0001، و0 (كل NEGative).
  4. قياس مستويات صبغ مضان لجميع العينات باستخدام thermocycler QPCR. لهذا البروتوكول، استخدم 492 نانومتر 516 نانومتر مرشح المحددة للصبغة dsDNA ملزم، وتصفية 585 نانومتر 610 نانومتر المحددة للصبغة المرجعية.
    1. تطبيع dsDNA ملزمة مضان صبغ باستخدام صبغة إشارة مضان. مزيد من تطبيع من قبل مضان من "كلها إيجابية" عينة.
  5. إنشاء منحنى القياسية الخطية باستخدام القياسات مضان تطبيع من "كل ايجابية" و "جميعها سلبية" العينات. باستخدام المنحنى القياسي المقابل، توقع نسب متوسطة من قطرات الإيجابية والسلبية على أساس مضان معظم بهم.
  6. تكرار التجربة لكل نسبة (ن = 3) مع تشكيل الحبرية مستقل وخلط للكل تكرار.

7. إثبات صحة المبدأ MDA التجربة

  1. قياس تركيز المحلول امبدا DNA مع المواصفاتtrophotometer.
    1. حساب تركيز قالب الضروري متوسط ​​جزيئات 10 قالب لكل قطرة. لهذا البروتوكول، افترض أحجام قطرات هي 1 NL و 1 نانوغرام من امدا DNA يحتوي على حوالي 1.9 × 10 7 النسخ. ولذلك، فإن 10 في قوالب قطرة يكون 10 نسخة لكل NL، أو 526 FG امدا DNA لكل ميكرولتر. وسوف تضعف القالب ~ 6X عندما تتشكل قطرات، وبالتالي الأولي للتركيز أعلى القالب سيكون 3.2 جزء من الغرام / ميكرولتر.
  2. متسلسل تمييع DNA لامبدا إلى 3.2 جزء من الغرام / ميكرولتر مع تمسخ العازلة وحجم مساو تحييد العازلة. لعامل التخفيف من 0.1، والجمع بين عينة 10 ميكرولتر مع 45 ميكرولتر من تمسخ العازلة واحتضان في RT لمدة 3 دقائق. إضافة 45 ليرة لبنانية من تحييد مؤقت لإرواء.
  3. وعلاوة على ذلك تمييع العينة كما هو موضح في الخطوة 7.2 لجعل بقية عينات للتجربة. وكانت تركيزات قالب الأولية في ردود الفعل هو مبين 3.2 خريج، 320 FG،160 FG، 32 FG، 16 FG، 3.2 FG، و 1.6 FG لكل ميكروليتر.
    ملاحظة: كانت تركيزات قالب النهائية بعد إضافة mastermix 526 FG، 52.6 FG، 26.3 FG، 5.26 FG، 2.63 FG، 526 AG، و 263 آغ لكل ميكروليتر. 10، 1، 0.5، 0.1، 0.05، 0.01، و 0.005 المتوقع نسخ امدا في الحبرية، على التوالي.
  4. توليد وتحليل قطرات من كل عينة كما هو موضح في الخطوات 2،5-5،3.
  5. الحصول على الصور مضان يظهر الشكل (2،3) باستخدام كاميرا رقمية مثبتة على مجهر برنامج التحصين الموسع ومضان مع الهدف 10X في RT. الحصول على اثني عشر مجالات عرض لكل عينة. الصور مضان الصحيحة من قبل صورة الخلفية التي تم الحصول عليها مع شريحة الفلورسنت.
  6. استخدام غرفة الواردة للتصوير 37 مثل النفط مستحلب سوف تتبخر بسرعة.
  7. تحليل شدة قطرة الفردية باستخدام ماكرو يماغيج (ملف التعليمات البرمجية إضافي).
    1. اختيار كثافة عتبة مضان أن أفضل يفصل قطرات غير الفلورية في Nصور التعاون الفني من قطرات الفلورسنت في الصور تركيز قالب عالية. لكل عينة غير معروفة، وحساب جزء من قطرات مع كثافة مضان فوق العتبة.

8. PCR وMDA ردود الفعل الأكبر

  1. إعداد رد فعل PCR.
    1. متسلسل تمييع DNA القالب مع عامل التخفيف من 0.1. لكل التخفيف، والجمع بين 10 ميكرولتر من القالب مع 45 ميكرولتر من تمسخ العازلة واحتضان في RT لمدة 3 دقائق. الجمع بين التخفيف مع 45 ميكرولتر من تحييد العازلة.
    2. إعداد 20 ميكرولتر من PCR mastermix لكل عينة. يتكون 1.1x PCR خليط سيد رد فعل من 60 وحدة / ميكرولتر طق البلمرة DNA، 11 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 55MM بوكل، 1.65 ملي MgCl 2، 0.22 ملي dNTP، صبغ، 1.1x إشارة صبغ، و 550 نيوتن متر 1.1x dsDNA ملزم كل التمهيدي.
    3. الجمع بين 2 ميكرولتر من القالب الواحد و 20 ميكرولتر من mastermix.
      ملاحظة: تركيزات قالب النهائية في تيانه PCR ردود الفعل هو مبين كانت 50 خريج، 5 خريج، 500 FG، 50 FG، 5 FG، 500 AG، و 0 ز امدا DNA لكل ميكروليتر، وأجريت في ثلاث نسخ.
    4. رد فعل Thermocycle PCR في جهاز QPCR مع البرنامج التالي. تشغيل 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 57 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية قبل 2 دقيقة عند 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية.
    5. تطبيع dsDNA ملزمة صبغ مضان باستخدام إشارة صبغ مضان قبل مزيد من التحليل.
  2. إعداد رد فعل MDA.
    1. تمييع عينات كما هو موضح في الخطوة 8.1.1.
    2. إعداد 11 ميكرولتر من مزيج الرئيسي لكل عينة على الجليد. يتكون 2X MDA خليط سيد رد الفعل صبغ 2X dsDNA ملزم، 2X إشارة صبغ، 50 ميكرومتر العشوائية بنسبة ضئيلة، 2 ملغ / مل BSA، 2X phi29 البلمرة DNA رد فعل مؤقت، 4.8 ملي dNTPs، nuclease خالية من المياه، و 40 ميكروغرام / مل Phi29 البلمرة DNA.
    3. إضافة البلمرة DNA Phi29 إلى 40 ميكروغرام / مل تستمر لضمان البلمرة دالتضامن الإماراتي لا تواجه مستويات الحموضة أعلى من ذلك بكثير أو أقل من 7.5. تخلط جيدا.
    4. تفسد 3.3 ميكرولتر من قالب المخفف مع 3.3 ميكرولتر من تمسخ العازلة في أنبوب QPCR. في احتضان RT لمدة 3 دقائق. إضافة 3.3 ميكرولتر من تحييد العازلة.
    5. الجمع بين 10 ميكرولتر من قالب التشويه والتحريف و10 ميكرولتر من مزيج الرئيسي. تخلط جيدا.
    6. تشغيل رد الفعل MDA في آلة QPCR مع البرنامج التالي.
    7. عقد في 30 درجة مئوية لمدة 4 ساعات، وقياس مضان كل 7.5 دقيقة.
    8. تعطيل في 75 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    9. تطبيع dsDNA ملزمة مضان صبغ باستخدام صبغة إشارة مضان. مزيد من تطبيع كتبها أقصى مضان لكل عينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في حين قراءات الأكبر التقليدي / في الوقت الحقيقي يمكن أن تستخدم في كل PCR الكمي والمقايسات WGA الكمية (الشكل 1)، المقايسات الكمية رقمية توفر مزايا (الجدول 1). في طريقة وصفها، وتلا المقايسات الرقمية في شكل قطرات صغيرة مع قياس نقطة نهاية الجزء الأكبر بسيط (الشكل 2). في حين أن هذا الأسلوب هو المعمول به على نطاق واسع، ونحن نركز على WGA الكمي (MDA) حيث يمثل هذا الأسلوب تحديات خاصة لفحوصات في الوقت الحقيقي التقليدية.

للتحقق ما إذا كان لدينا الوقت الحقيقي PCR أداة يمكن الكشف عن كسور متفاوتة من microdroplets الفلورسنت منتشر في زيت، قمنا بقياس مضان الجزء الأكبر من خلائط الاصطناعية من الفلورسنت وقطرات غير الفلورسنت (الشكل 2). مضان الأكبر وتعول قطرة الإيجابية (تقييم مستقل من قبل مضان المجهر) مقياس خطيا مع جزء مدخلات قطرات الفلورسنت كما هو متوقع (الشكل 3A). وأجريت التجربة ثلاث مرات، مع تشكيل الحبرية مستقل وخلط لكل مجموعة.

لتقييم الأداء الكمي النظري للعينات "غير معروف"، أنشأنا منحنيات معيار الخطية باستخدام عينات إيجابية تماما وسلبية تماما السيطرة. مع هذه القطيرات في الكثير محددة مستوى المنحنيات، وحسبنا جزء من الاصطناعية مخاليط قطرة الإيجابية والسلبية على أساس الجزء الأكبر مضان كل العينة. أظهرت النتائج الأداء الجيد في القطيرات نسبة الكمي عبر جهازي سجلات النطاق الديناميكي (R 2 = 0.984؛ الشكل 3B). يتم حساب تركيز المدخلات تحليلها بسهولة من جزء من قطرات إيجابية أو سلبية 38.

لاختبار أسلوبنا في الحقيقي الكمي مقايسة WGA، قمنا بقياس مستويات مضان وجزء من قطرات إيجابية من قطرات الرقمية MDA مقايسة مع الحمض النووي لامبدا عبر واي مجموعة دي تركيزات (الشكل 4). في الشكل 4B، وتظهر الصور الفلورسنت تمثيلية من قطرات. كلا مضان بالجملة وإيجابي جزء قطرة من العينات MDA مقياس رقمي كما هو متوقع مع متوسط ​​قالب لكل قطرة، مشيرا إلى أن معظم قراءات يمكن التقاط نتيجة الفحص الرقمي (R 2 = 0.927) بأمانة. كررنا التجربة لكل تركيز، وتشكيل قطرات مستقلة وتنفيذ WGA عن كل تكرار.

الجدول 1
الجدول 1. ملخص في الوقت الحقيقي والمقايسات الرقمية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

able2.jpg "/>
الجدول 2. ملخص الأساليب الحالية لquantitating الأحماض النووية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 1
لا discretized الرقم 1. في الوقت الحقيقي PCR الكمي وMDA من امدا DNA. MDA من خلال درجة حرارة الدراجات مثل PCR، وعرضة لpreamplification إن لم يكن أعدت بعناية على الجليد. هنا، تم تنفيذ PCR الكمي وMDA مع زيادة تركيزات امدا DNA. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
شملت رقمه 2. تخطيطي من قراءات التناظرية من قطرات والصور التمثيلية. (A) تم إنشاؤها قطرات الإيجابية والسلبية من الكواشف الفلورية وغير الفلورسنت في جهاز ميكروفلويديك. كانت قطرات مختلطة قبل في إيجابية مختلفة: نسب سلبية. تم قياس مستويات مضان السائبة مع معيار thermocycler في الوقت الحقيقي، وتحديد جزء من قطرات الإيجابية التي مضان المجهري. (B) فلوري الممثل مضافين الصور من زيادة نسب قطرات الإيجابية (مقياس بار = 200 ميكرون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. السائبة مضان وجزء فلوري من مزيج من إعدادها بصورة منفصلة drople الإيجابية والسلبيةTS. (A) نيون (إيجابي) وغير الفلورسنت كانت (السلبية) قطرات قبل مختلطة في نسب مختلفة. مقارنة بين نسبة مساهمة قطرات إيجابية مع مضان بالجملة قياسها وقياس نسبة قطرة الإيجابي (ن = 3، وأشرطة تمثل +/- SD). يمثل خط منقط جزء الفلورسنت متوقع نظرا جود علاقة خطية. (B) مقارنة النسب المتوقعة استنادا إلى معايير الفلورسنت جزء الإدخال المتوقع. خط يشير إلى القيمة المتوقعة نظرا لعلاقة خطية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
تم تنفيذ الشكل 4. السائبة مضان وجزء فلوري من قطرات الرقمي مقايسة MDA. MDA رقمية مع increتركيزات asing من قالب امدا DNA (ن = 3، وأشرطة الخطأ تمثل SD) وقياس كما هو موضح في الشكل 2A. خط يشير إلى جزء الفلورسنت المتوقع باستخدام توزيع بواسون لنمذجة البيانات من تجربتنا. ب) مضافين فلوري الممثل الصور من قطرات بعد تعطيل رد فعل (مقياس بار = 200 ميكرون) لزيادة المتوقع الجزيئات امبدا DNA لكل قطرة (NTC، 0.005، 0.05، 0.5، و 10). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المقايسات الرقمية وطرق القوية التي تمكن الكشف عن خلايا نادرة والعد من فرد من جزيئات الحمض النووي. ومع ذلك، لا تزال لا تطبق فحوصات الرقمية بشكل روتيني في المختبرات التحليلية، ويرجع ذلك جزئيا إلى تكلفة المعدات المتخصصة المرتبطة بالطرق المتاحة تجاريا. نحن هنا وصف مقايسة الرقمي نقطة النهاية لقياس الأحماض النووية مع قراءات التناظرية مبسطة باستخدام الوقت الحقيقي القياسية الكمية آلة PCR. هذا الأسلوب هو سريع لانشاء، وقراءات هي أبسط بكثير من طرق العد قطرة.

لدينا فحص تتخلى عن جزيء واحد (واحد قطرة) حساسية القياسات قطرة الفردية لبساطة بشكل جماعي نقطة النهاية قياس باستخدام الأدوات القياسية. في تجربتنا MDA الرقمية، لم نتمكن من التمييز بين أقل من 1 قطرة إيجابية لكل 200 قطرات السلبية من الخلفية، على الرغم من تأكيد مضان المجهر أن FRA الفعليction من قطرات الإيجابية وكما هو متوقع (الشكل 4). حساسية والخلفية في الجزء الأكبر الحد قياس مضان حساسية من فحص قياس بالجملة لانخفاض الكسور قطرة إيجابية. إذا كنت بحاجة حساسية أعلى، فمن المستحسن قراءات رقمية. الاختلافات في مستويات النفط أو وحدات التخزين الحبرية كبيرة الحجم يمكن أن تؤثر بشكل كبير على البيانات عينة مضان. حتى التطبيع مع صبغة إشارة لا يمكن أن يعوض عن الاختلافات كميات النفط تجعل في يقرأ مضان. فمن الممكن أن تحسين حجم الفحص، المعلمات اقتناء أداة، الهندسة microwell، أو المرشحات الضوئية قد يحسن أداء الاختبار.

ويمكن أيضا حساسية ومجموعة ديناميكية من المقايسات الرقمية السائبة أن تتحسن عن طريق الاستفادة المثلى من حجم القسم. قطرات أكبر تسفر كمية أكبر من منتجات الفلورسنت من كل جزيء القالب، والتي يمكن أن تساعد في التغلب على خلفية دور فعال وتحسين حساسية لتركيزات منخفضة الدخل. علىمن ناحية أخرى، قطرات صغيرة تسمح للعزل أكثر من الجزيئات في حجم يعاير. إذا تركيز قالب متغير بدرجة كبيرة في عينات، سواء ردود الفعل قطرات صغيرة وكبيرة يمكن القيام بها بالتوازي مع توسيع النطاق الديناميكي فحص 39.

أحجام قطرات متسقة ضرورية لقياس دقيق أيضا. وتوجد العديد من الحلول ميكروفلويديك مخصصة لتشكيل بسرعة قطرات monodisperse من عينة، سواء في سلسلة 19،40 و 41،42 في مواز. بينما عدد قليل تمكين الجيل قطرة من عدة عينات منفصلة في موازاة ذلك، أن تعديلات بسيطة لتصاميم الحالية تسمح لتوليد الحبرية في وقت واحد في أي عدد من العينات. على سبيل المثال، بيو راد نظام ddPCR 23 ينطبق ضغط موحد لمداخل سلسلة من صناع قطرة مستقلة، مما يتيح تشكيل الحبرية في وقت واحد من عينات متعددة.

لدينا منهجية قراءات معظم مداخل رئيسيةمزايا المقايسات الرقمية المقسمة دون الحاجة إلى متخصص الأجهزة قراءات وهي مناسبة تماما لالكمي WGA. هنا، ركزنا على WGA الكمي، الذي هو عرضة للملوثات الخلفية بسبب افتقارها للتسلسل خصوصية 7. وبالإضافة إلى ذلك، فإن توزيع الوزن الجزيئي غير معروف وربما واسعة من المنتجات من الوقت الحقيقي المقايسات WGA الكمية جعل التفسير صعبا في التطبيقات حيث بلغ عدد القوالب الأصلية هو من مصلحة. عناوين التنسيق فحص الرقمية على حد سواء هذه المشاكل. وترد الملوثات داخل أقسام رد فعل الفردية، ومنع هيمنة التحاليل منخفضة الوزن الجزيئي من الملوثات عالية الوزن الجزيئي كما يمكن أن يحدث في التقليدية فحص في الوقت الحقيقي. في أرقام 2B و4B، الملوثات المحتملة التي ينظر اليها على النقاط المضيئة داخل قطرات، هي الفصل بين الجنسين وعدم تضخيم أو تسهم إلى حد كبير في مضان العام. علاوة على ذلك،إشارة ولدت في المقايسات الرقمية يتناسب مع عدد من القوالب، وليس حجم القوالب أو معدل التضخيم بهم. على الرغم من أن أسلوبنا يعتمد على معايير لمعايرة قياس الرقمي بالجملة، واشتراط تطابق العينة والخصائص القياسية يمكن أن تخفف بشكل كبير.

يستخدم الكمي WGA عادة لقياس الملوثات في ردود الفعل وغ 7،34، وهي الطريقة الأكثر حساسية معروفة لتحديد وجود الحمض النووي للتسلسل معروف، إعطاء أسلوب الوعد الكبير في مجالات التطبيق متنوعة مثل الأدوية ومراقبة الجودة، والطب الشرعي، و بيولوجيا الفضاء. قراءات رقمية كبيرة الحجم يمكن أن تستفيد أخرى بروتوكولات الفحص الرقمي مثل PCR الرقمية، من خلال تسريع وparallelizing، وتبسيط فحص قراءات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Evagreen Dye Biotium 31000
Bovine serum albumin New England Biotechnologies B9000S
Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer New England Biotechnologies B0269S Vortex periodically until aggregate dissolves
Lambda DNA New England Biotechnologies N3011S Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution
Randomized MDA oligos Integrated DNA Technologies 5'-NNNNN*N-3'
PCR primers Integrated DNA Technologies 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’
UltraPure Nuclease-free water Life Technologies 10977-015 UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)
ROX reference dye Life Technologies 12223-012
PCR optical strip caps Life Technologies 4323032
PCR tubes Agilent Technologies 401428
dNTP (25 micromolar each) Agilent Technologies 200415
Thermocycler - Mx3000P qPCR system Agilent Technologies 401403
Barrier pipette tips VWR 89003-046
Bio-rad oil for evagreen Bio-rad 186-4005
JumpStart Taq ReadyMix Sigma-Aldrich P2893-100RXN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
  2. Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
  3. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  4. Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59 (1), 101-107 (2013).
  5. Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).
  6. Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).
  7. Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).
  8. Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).
  9. Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).
  10. Method of the Year 2013. Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).
  11. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
  12. OpenArray Technology Overview. , Life Technologies. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html (2014).
  13. Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip. Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).
  14. Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).
  15. Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).
  16. Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).
  17. Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).
  18. Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).
  19. Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).
  20. Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).
  21. Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).
  22. Illumina. , Technology. http://www.illumina.com/technology.html (2014).
  23. Droplet digital PCR applications guide. , Bio-Rad. Available from: http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr (2014).
  24. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  25. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
  26. Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).
  27. Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).
  28. Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
  29. Mitos Dropix Systems. , Dolomite. http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system (2014).
  30. Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
  31. Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
  32. Fainman, Y. Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , McGraw-Hill. (2010).
  33. Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).
  34. Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).
  35. System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. Hindson, B. J. , (2014).
  36. Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
  37. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).
  38. Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).
  39. Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).
  40. Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).
  41. Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
  42. Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 103، الجامع الجينوم التضخيم، الفحص الرقمي، MDA، PCR، جزيء واحد، خلية واحدة، والأحماض النووية، قطرات صغيرة، على microfluidics، مستحلب
قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morinishi, L. S., Blainey, P. Simple … More

Morinishi, L. S., Blainey, P. Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays. J. Vis. Exp. (103), e52925, doi:10.3791/52925 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter