Abstract
Digitale assays zijn krachtige werkwijzen die detectie van zeldzame cellen en telling van individuele nucleïnezuurmoleculen mogelijk. Echter, digitale assays nog niet routinematig toegepast, vanwege de kosten en de specifieke uitrusting geassocieerd met commercieel beschikbare methoden. Hier presenteren we een vereenvoudigde werkwijze voor het uitlezen van digitale druppel assays met een gebruikelijke real-time PCR-instrument om fluorescentie van bulk-droplet gebaseerde digitale assays meten.
We karakteriseren van de prestaties van de bulk uitlezing assay met behulp van synthetische droplet mengsels en een druppel digitale multiple verplaatsing amplificatie (MDA) assay. Kwantitatieve MDA vooral voordelen van een digitale reactie formaat, maar onze nieuwe methode is van toepassing op elke digitale test. Voor gevestigde digitale testprotocollen zoals digitale PCR methode dient te versnellen en te vereenvoudigen assay uitlezing.
Onze bulk uitlezing methode brengt de voordelen van partitioned assays zonder de behoefte aan gespecialiseerde uitlezing instrumentatie. De voornaamste beperkingen van de bulk uitlezing methode worden gereduceerd dynamisch bereik in vergelijking met druppel-telling platforms en de noodzaak van een standaardmonster, hoewel de vereisten voor deze standaard zijn minder veeleisend dan bij conventionele real-time experiment. Kwantitatieve gehele genoom amplificatie (WGA) wordt gebruikt om te testen op verontreinigingen in WGA reacties en is de meest gevoelige manier om de aanwezigheid van DNA-fragmenten met onbekende sequenties te detecteren, waardoor de werkwijze grote belofte in diverse toepassingsgebieden zoals farmaceutische kwaliteitscontrole en astrobiology.
Introduction
Digitale assays voor nucleïnezuur kwantificatie (digitale PCR) 1-4 en de basis orde (sequencing) sterk beïnvloeden de life sciences en de geneeskunde. Digitale testen leveren kwantificering van moleculaire rekent op een absolute schaal (niet ten opzichte van een controle), het verstrekken van hoge gevoeligheid, waardoor gemakkelijke vergelijkingen tussen experimenten, en cruciaal, zodat de bouw van grote databases met vergelijkbare gegevens 5 (tabel 1).
In de afgelopen 15 jaar, hele genoom amplificatie (WGA) ontstond naast PCR als een algemeen hulpmiddel voor nucleïnezuuramplificatie. Zoals PCR, WGA nuttig voor analytische en preparatieve toepassingen door amplificatie minuut steekproefelementen tot een niveau dat gemakkelijk kan worden gedetecteerd of gebruikt voor verdere analysen achtige basis sequencing. In tegenstelling tot PCR, WGA is niet specifiek voor een bepaalde DNA locus plaats waardoor amplificatie van sequenties in het monster, met inbegrip van onbekende sequenties.Het fundamentele verschil tussen de PCR en WGA maakt de werkwijzen complementair aan elkaar en geeft aanleiding tot verschillende problemen bij de toepassing.
De hoge opbrengst van WGA reacties 6 maakt routine amplificatie van genoom DNA van enkele moleculen 7, enkele cellen 8 en andere low-biomassa monsters 9 voor kwantificering of verdere analyse. De belangrijkste uitdagingen in verband met WGA chemie zijn de extreme gevoeligheid voor contaminanten en de ongelijke amplificatie over individuele template moleculen 6. Echter, WGA wint aan populariteit als single-cell sequencing heeft ontpopt als de "killer application" van WGA-technologie 10, en kwantificatie van WGA is belangrijk in vele toepassingsgebieden 7.
Instrumentatie voor digitale nucleïnezuur kwantificatie is eerder beschreven in een verscheidenheid van met klep en ventielloze microfluidic formats 11-14, waaronder druppel gebaseerde testen 15,16 (tabel 2). Echter, commerciële microfluïdische systemen voor de digitale analyse vereisen gespecialiseerde apparatuur voor de reactie en setup product detectie 17. Aangepaste klep microfluidics zijn flexibel, maar vereisen precisie microfabricage en pneumatische besturingssystemen 18. Hoewel het relatief eenvoudig om monodisperse microdruppels voor-emulsie gebaseerde digitale assays 19,20 maken digitale uitlezing is technisch omslachtig, vereist hetzij grote wide-field imaging (vergelijkbaar met populaire sequeneren volgende generatie) of 21,22 high-speed stroom-gebaseerde druppel detectie 23-25. Idealiter zou een digitale test eenvoudig van opzet zijn uitlezen, waardoor de behoefte aan ingewikkelde instrumenten en waardoor grote aantallen monsters snel worden uitgelezen. Hier beschrijven we een vereenvoudigde werkwijze voor het uitlezen van digitale druppel assays die gebruik maakt van een conventionele real-time PCR instrument om bulk van fluorescentie-druppel gebaseerde digitale testen meten.
Terwijl de nieuwe benadering kan worden toegepast op digitale PCR assays, is het bijzonder voordelig voor digitale WGA assays die analoog real time amplificatie assays (die uitstekende resultaten geven PCR) problematisch. WGA wordt algemeen toegepast op monsters met template moleculen die heterogeen sequentie, lengte en basegehalte zijn. Deze verschillende template moleculen geamplificeerd met verschillende snelheden 6, in het gebruik van een referentie ("standaard") monster met bijpassende eigenschappen. Vaak is een dergelijke standaard beschikbaar is, of de kenmerken van de inkomende monsters onbekend. De heterogeniteit van het uitgangsmateriaal en de lengte-afhankelijke eigendom van WGA chemische 26 ook bemoeilijken de interpretatie van de resultaten door het creëren van onduidelijkheid in wat er wordt gekwantificeerd - de ingang massa ingang aantal moleculen, een combinatie van de twee, of geen van beide. Fot slot, de sequentie niet-specificiteit maakt kwantitatieve meervoudige verplaatsing amplificatie (MDA) gevoeliger voor verontreiniging dan kwantitatieve PCR aangezien verontreinigende moleculen van elke sequentie hebben kunnen aantasten. Microfluïdische digitale assays pakken besmetting door scheiding template moleculen reductiereactie volumes zodanig dat minder verontreinigingen worden bemonsterd.
Hier gebruiken we een populaire isothermische WGA methode, MDA 27. Van de nota, een aantal andere WGA chemie waaronder PicoPlex en Malbac 28 afhankelijk cruciaal bij de eerste isothermale strengverplaatsing stappen. Isotherme stappen verergeren de uitdaging van de toepassing van analoge real-time assays voor kwantitatieve WGA. WGA kan niet volledig worden voorkomen tijdens de installatie, waardoor ongewenste variabele pre-amplificatie of gediscretiseerd ("cycling") op een wijze waarbij replicatie van heterogene moleculen kunnen worden gereden tot voltooiing en gestopt voorafgaand aan de volgende cyclus zoals PCR 11 (Figuur 1). Een digitale analyse-opzet voor WGA ontvangt kenmerkende reactie installatieprocedures gevolg van de scheiding van elk molecuul voor de telling van het eindpunt assay (dus voorversterking laat de resultaten) oorspronkelijke uitleesmiddelen nauwkeurigheid zou grotendeels onafhankelijk van variaties in amplificatie efficiëntie.
De assay is afhankelijk van druppeltjes geproduceerde olie met uniforme volumes, als het signaalniveau per druppel aan het eindpunt assay is afhankelijk van het volume druppel, en we niet willen dat de consistentie van resultaten afhankelijk gemiddeld over een verdeling van druppelgrootten. Maken monodisperse druppels is nu een standaard procedure (ongeveer 3.500 monodisperse druppel kranten zijn gepubliceerd sinds 2013), maar vereist microfluïdische instrumentatie 25. In feite zijn er meer dan zes bedrijven onafhankelijke commerciële producten die afhankelijk zijn van de productie van dergelijke druppels ontwikkeld, en druppel maken van microfluïdische chipscommercieel beschikbaar 23,29. Voor deze studie, gebruikten we op maat microfluïdische apparaten geproduceerd in eigen huis (zie Protocol). Spuitpompen rijden stroming door de inrichtingen zijn ook commercieel verkrijgbaar, maar als alternatief kan worden gesubstitueerd met één wegwerpspuit voor vacuüm aangedreven stroming de kosten 30 verlagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: het fabriceren microfluïdische inrichting niet noodzakelijk deze test als druppeltjes dit protocol kan worden gevormd met bestaande commerciële druppel makers 23,29.
1. Maak de Droplet-vormende microfluïdische apparaat
- Bereid meester mal voor de kanalen met SU-8 master Fabrication eerder beschreven protocol 31, maar met een druppelgenerator maskerpatroon 32.
- Fabriceren apparaten PDMS gebruik van de technieken van zachte lithografie 32,33.
2. Bereid Reaction Mix voor Bulk Droplet uitlezing
Opmerking: Het protocol kan worden gebruikt om nucleïnezuren met behulp van vele soorten amplificatiereacties kwantificeren. Als voorbeeld worden de reagentia nodig voor MDA meerdere Lambda DNA concentraties bepaald. Reagens gegevens staan vermeld in de tabel van specifieke reagentia. De verdeling van sjabloon in de druppels afhankelijk sufficient menging van het monster.
- Verkrijgen of te zuiveren Phi29 DNA polymerase.
- Zuiveren Phi29 zoals eerder beschreven 7, of de aankoop van de leverancier. De Phi29 voor de getoonde experimenten werd gezuiverd.
- Bereid 10 ml denaturatie buffer bestaande uit 65 mM KOH, 1,65 mM EDTA en 14 mM DTT.
- Bereid 10 ml Neutralisatie Buffer, bestaande uit 65 mM HCl, 0,21 M Tris-Cl pH 7,0 en 9 mM Tris-Cl pH 8,0.
- Bereid twee standaarden, een geen template controle (NTC), zoals nuclease-vrij water, en een hoge template concentratie (ongeveer 4 pg / ul Lambda DNA). Denatureren 3,3 pi van elke standaard met 3,3 pi denaturatiebuffer in een qPCR buis. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. Quench elk met 3,3 pi neutralisatiebuffer.
- Denatureren 3,3 ul van de sjabloon van belang met 3,3 pi denaturatiebuffer in een qPCR buis. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. Blussen met 3,3 pineutralisatiebuffer.
- Bereid 11 pi meester mengsel per monster op ijs. De 2x MDA reactie meester mengsel bestaat uit 2x dubbelstrengs DNA (dsDNA) binden kleurstof, 2x qPCR verwijzing kleurstof, 50 uM gerandomiseerde oligo, 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer, 4,8 mM dNTPs, nuclease-vrij water en 40 ug / ml Phi29 DNA-polymerase. Voeg Phi29 DNA polymerase laatste aan de polymerase niet tegenkomen pH-niveau veel hoger of lager zijn dan 7.5.Mix goed te verzekeren.
- Optioneel: Voor minder valse positieven, bloot master mix met UV-licht voorafgaand aan het vormen druppels 34.
- Bereid 10 pi pre-mengsel per monster in een 0,5 ml of 1,5 ml heldere buis op ijs. Het voormengsel uit 55 uM oligo gerandomiseerde, 2,2 mg / ml BSA, 1.1x Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer, 5,3 mM dNTPs, en nuclease-vrij water.
- Plaats de buis in water op ijs zoals beschreven 34 en blootstellen aan UV-licht (254 nm) van een acculeerd dosis van 5,7 J / cm2.
- Add dsDNA-bindende kleurstof 1x verwijzing kleurstof 1x en Phi29 tot 40 ug / ml in het voormengsel. Meng goed.
- Combineer 10 pi gedenatureerd template of standaard en 10 ul van meester mengsel. Meng goed.
3. druppelvorming
Opmerking: Druppeltjes kan zeer gevoelig voor statische elektriciteit en shear stress. Verwijder kleding die statische elektriciteit kunnen veroorzaken en uzelf te aarden voordat de vorming van druppels. Handgreepbuizen emulsie vanaf de bovenkant van de buis zo ver van de emulsie mogelijk. Pipet emulsies heel langzaam, bij voorkeur met een brede boring pipet tip. Bij het afgeven van een pipet tip, kijk naar de emulsie aan de kant van de tip om pipetteren snelheid te bepalen.
- Vorm druppeltjes. Voor de proeven weergegeven, de microfluïdische inrichting een olie-inlaat en twee waterige inlaten met een stroming richt knooppunt voor het opwekken van druppels. Gebruik twee SyriNSE pompen om de stroomsnelheden van 55 pl olie met surfactant en een 20 gl reactiemengsel controleren via de microfluïdische chip 20.000 1 nl druppels te genereren.
- Opmerking: Het is mogelijk om druppeltjes met vele soorten olie met surfactant te produceren, maar de samenstelling zal grote invloed druppel stabiliteit bij hoge temperaturen en tijd. Een mogelijke combinatie gefluoreerd olie HFE 7500 een anionisch surfactant 19,35.
- Opbrengst druppeltjes op elk formaat met elke werkwijze 13,36, maar de grootte variabiliteit van de druppel bevolking zal de bulk fluorescentie, en derhalve de nauwkeurigheid van de test beïnvloeden. Voor de getoonde experimenten werden monodisperse druppels met een volume van 1 nl.
- Verzamel alle van de druppeltjes en olie in de PCR-buizen. Voor elk monster werd 30 pl aliquot van olie in verse PCR buizen met optische kappen en breng 20 pl druppels bovenop de olie. De constante volumes zorgen voor de assay als accurator mogelijk.
- Nauwe buis caps strak, losse caps zal de olie verdampen.
4. Isothermische Versterking
- Met behulp van een PCR-thermocycler, qPCR thermocycler of hete plaat, incubeer de monsters bij 30 ° C gedurende 7 uur en inactiveren gedurende 1 min bij 75 ° C. De buizen van druppeltjes kan worden achtergelaten in een koelkast bedekt met folie gedurende enkele uren op dit punt.
5. Data Acquisition and Analysis
- Onmiddellijk na de reactie inactivatie, meten kleurstof fluorescentie niveaus voor alle monsters met behulp van de qPCR thermocycler. Optimale filterinstellingen zal afhangen kleurstof excitatie- en emissiespectra. Voor dit voorbeeld, gebruik dan de 492 nm-516 nm filter instellen voor het dsDNA-bindende kleurstof, en de 585 nm-610 nm filter voor de referentie kleurstof. Andere fluorescente metingen kunnen worden gebruikt om de fluorescentie te kwantificeren.
- Voor elk monster, verdelen de fluorescentie-intensiteit van de dsDNA-bindende kleurstof doorde fluorescentie-intensiteit van de referentie kleurstof. Aftrekken van de achtergrond fluorescentie, of de genormaliseerde fluorescentie van de templateloze controle van alle monsters.
- Een lineaire standaardkromme met de gecorrigeerde fluorescentiemetingen van de normen. De NTC standaard vertegenwoordigt de fluorescentie van een monster met 0% fluorescent druppeltjes ("allemaal negatief"), en de hoge templateconcentratie fluorescentiemeting de verwachte fluorescentie van een monster met 100% fluorescent druppeltjes ("allemaal positief"). De corresponderende standaardcurve, voorspellen de tussenliggende verhoudingen van positieve en negatieve druppels op basis van hun omvang fluorescentie.
6. Produceren Droplets voor Proof-of-principle Metingen
- Voeg fluorescent (positief) druppels: Bereid een PCR reactiemengsel bestaande uit 0,1 ng Lambda DNA, 1x dsDNA-bindende kleurstof, 1x verwijzing kleurstof, 1,5 eenheden Taq DNA polymerase, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP en 0,5 uM primers. Thermocyclus het mengsel 30 keer (95 ° C gedurende 20 sec, 55 ° C gedurende 20 sec, 72 ° C gedurende 1 min), vervolgens druppeltjes vormen zoals hierboven beschreven.
- Maak niet-fluorescerende (negatieve) druppels: Bereid een PCR reactiemengsel bestaande uit 1x dsDNA-bindende kleurstof, 1x verwijzing kleurstof, 1,5 eenheden Taq DNA polymerase, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, en 0,5 uM primers. Thermocyclus het mengsel 30 keer (95 ° C gedurende 20 sec, 55 ° C gedurende 20 sec, 72 ° C gedurende 1 min), vormen dan druppels.
- Vorming van pre-gemengde druppel verhoudingen
- Verdeel 20 ul van gefluoreerde olie in qPCR buisjes, bedekken met een optische dop om verdamping te voorkomen.
- Voorzichtig pipet 10 pi goed gemengde druppeltjes in gewenste positieve: negatieve ratio bovenop de olie. In de getoonde resultaten positief: negatieve druppeltje verhoudingen waren 1 (alle positief), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 en 0 (alle negtieve).
- Meet kleurstof fluorescentie niveaus voor alle monsters met behulp van de qPCR thermocycler. Voor dit protocol, gebruik maken van de 492 nm-516 nm filter instellen voor het dsDNA-bindende kleurstof, en de 585 nm-610 nm filter voor de referentie kleurstof.
- Normaliseren dsDNA binding kleurstof fluorescentie met verwijzing kleurstof fluorescentie. Verdere normaliseren van de fluorescentie van "alle positieve" sample.
- Maak een lineaire standaardcurve met behulp van de genormaliseerde fluorescentie metingen van het "allemaal positief" en "alle negatieve" monsters. De corresponderende standaardcurve, voorspellen de tussenliggende verhoudingen van positieve en negatieve druppels op basis van hun omvang fluorescentie.
- Herhaal het experiment voor elke verhouding (n = 3) met onafhankelijke druppelvorming en mengen elke duplo.
7. Proof-of-principle MDA Experiment
- Meet de concentratie van Lambda DNA stockoplossing met een spectrophotometer.
- Bereken de templateconcentratie noodzakelijk gemiddeld 10 template moleculen per druppel. Voor dit protocol, veronderstellen druppel volumes 1 nl en 1 ng van Lambda DNA bevat ongeveer 1,9 x 10 7 exemplaren. Daarom zal 10 sjablonen per druppel zijn 10 kopieën per nl, of 526 fg Lambda DNA per pi. De sjabloon wordt verdund ~ 6x wanneer druppels worden gevormd, dan wordt de aanvankelijke hoogste templateconcentratie 3,2 pg / pl zijn.
- Serieel verdunnen Lambda DNA 3,2 pg / pl denaturatie buffer en met gelijk volume Neutralisatie Buffer. Voor een verdunningsfactor van 0,1, combineer 10 pl monster met 45 pl denaturatie buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. Voeg 45 IL neutralisatiebuffer te blussen.
- Verdun het monster zoals beschreven in stap 7.2 van de rest van de steekproeven van het experiment. Het uitgangstemplate concentraties in de getoonde reacties waren 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3,2 fg en 1,6 fg per microliter.
Opmerking: De uiteindelijke template concentraties na mastermix Daarnaast waren 526 fg, 52,6 fg, 26,3 fg, 5.26 fg, 2,63 fg, 526 ag, en 263 ag per microliter. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 en 0,005 verwachte Lambda kopieën per druppel, respectievelijk. - Genereren en analyseren van druppeltjes van elk monster, zoals beschreven in de stappen 2,5-5,3.
- Verwerven van de fluorescentiebeelden weergegeven (figuur 2,3) met een digitale camera gemonteerd op een epi-fluorescentie microscoop met een 10x objectief bij RT. Verwerven twaalf gebieden van het oog voor elk monster. Juiste fluorescentie-beelden een achtergrond afbeelding verkregen met een fluorescerende glijbaan door.
- Gebruik een bevatte kamer voor beeldvorming 37 als de emulsie olie snel zal verdampen.
- Analyseer individuele druppel intensiteiten met behulp van een ImageJ macro (Aanvullende code-bestand).
- Kies een drempel fluorescentie-intensiteit die best scheidt niet-fluorescerende druppels in het NTC beelden van de fluorescerende druppeltjes in hoge templateconcentratie afbeeldingen. Voor elk onbekende monster, berekent de fractie van druppels met een fluorescentie-intensiteit boven de drempel.
8. PCR en MDA bulk reacties
- Bereid PCR reactie.
- Serieel verdunnen template DNA met een verdunningsfactor van 0,1. Voor elke verdunning, combineer 10 pi sjabloon met 45 pl denaturatie buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. Combineer de verdunning met 45 ul neutralisatiebuffer.
- Bereid 20 pi PCR mastermix per monster. De 1,1x PCR reactiemengsel modelmengsel bestaat uit 60 eenheden / ul Taq DNA-polymerase, 11 mM Tris-HCl, 55 mm KCl, 1,65 mM MgCl2, 0,22 mM dNTP, 1,1 x dsDNA-bindende kleurstof, 1.1x referentie kleurstof en 550 nM elke primer.
- Combineer 2 pl verdunde template en 20 pi mastermix.
Opmerking: De uiteindelijke template concentraties in tHij reacties getoond PCR waren 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag en 0 g Lambda DNA per microliter, en werden in drievoud uitgevoerd. - Thermocyclus PCR reactie qPCR machine met de volgende programma. Run 40 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 57 ° C gedurende 20 sec, 72 ° C gedurende 30 seconden voor 2 min bij 72 ° C gedurende 2 min en handhaven bij 4 ° C.
- Normaliseren dsDNA binding kleurstof fluorescentie met verwijzing kleurstof fluorescentie voorafgaand aan verdere analyse.
- Bereid MDA reactie.
- Verdun monsters zoals beschreven in stap 8.1.1.
- Bereid 11 pi meester mengsel per monster op ijs. De 2x MDA reactiemengsel modelmengsel bestaat uit 2x dsDNA-bindende kleurstof, 2x verwijzing kleurstof, 50 uM gerandomiseerde oligo, 2 mg / ml BSA, 2x phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer, 4,8 mM dNTPs, nuclease-vrij water en 40 ug / ml Phi29 DNA Polymerase.
- Voeg de Phi29 DNA-polymerase aan 40 ug / ml laatste te zorgen voor de polymerase does niet tegenkomen pH-niveau veel hoger of lager zijn dan 7,5. Meng goed.
- Denatureren 3,3 pi van verdunde sjabloon met 3,3 pi denaturatiebuffer in een qPCR buis. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. Voeg 3,3 ul neutralisatiebuffer.
- Combineer 10 pi gedenatureerd template en 10 pi modelmengsel. Meng goed.
- Run MDA reactie qPCR machine met de volgende programma.
- Houden op 30 ° C gedurende 4 uur, gemeten fluorescentie elke 7,5 min.
- Inactiveren bij 75 ° C gedurende 1 min.
- Normaliseren dsDNA binding kleurstof fluorescentie met verwijzing kleurstof fluorescentie. Verdere normaliseren van de maximale fluorescentie van elk monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Terwijl conventionele bulk / real-time uitlezingen kunnen worden gebruikt voor kwantitatieve PCR en kwantitatieve WGA assays (figuur 1), digitale kwantitatieve testen leveren voordelen (tabel 1). In de beschreven werkwijze lezen we uit digitale assays micro-droplet formaat met een eenvoudige bulk eindpunt meting (figuur 2). Hoewel deze methode is breed toepasbaar, richten we ons op kwantitatieve WGA (MDA) omdat deze methode presenteert speciale uitdagingen voor conventionele real-time assays.
Om te controleren of onze real-time PCR instrument variërende fracties van fluorescerende microdruppels gedispergeerd in olie kunnen detecteren, maten we het grootste fluorescentie van synthetische mengsels van fluorescente en niet- fluorescente druppeltjes (figuur 2). Het grootste deel fluorescentie en positieve druppel telt (onafhankelijk beoordeeld door fluorescentiemicroscopie) schaal lineair met de ingang fractie van fluorescerende druppeltjes zoals verwacht (Figuur 3A). Het experiment werd drie keer uitgevoerd, met onafhankelijke druppelvorming en mengen voor elke set.
Om de theoretische kwantificering prestaties voor "onbekende" monsters te evalueren, hebben we lineaire standaard curves met onverdeeld positief en geheel negatieve controlemonsters. Met een dergelijke druppel-veel-specifieke standaard curves, berekenden we de fractie van synthetische positieve en negatieve druppel mengsels op basis van elk monster de bulk fluorescentie. De resultaten tonen aan goede prestaties in druppel verhouding kwantificatie over twee blokken van het dynamisch bereik (R 2 = 0,984; figuur 3B). De ingang analytconcentratie wordt gemakkelijk berekend uit de fractie van positieve of negatieve druppels 38.
Onze methode te testen in een echte kwantitatieve WGA-test, we gemeten fluorescentie niveaus en fractie van positieve druppeltjes van een digitaal druppel MDA test met Lambda DNA over een wi de reeks concentraties (Figuur 4). In figuur 4B, worden representatieve fluorescerende beelden van de druppels weergegeven. Zowel bulk fluorescentie positieve druppeltje fractie uit de digitale monsters MDA schaal zoals verwacht met de gemiddelde sjabloon per druppel, wat aangeeft dat het grootste deel het resultaat getrouw uitlezen van een digitale assay (R 2 = 0,927) kan vastleggen. We herhaalde het experiment voor elke concentratie, onafhankelijke vorming van druppels en uitvoeren van WGA voor elke repliceren.
Tabel 1. Samenvatting van de real-time en digitale testen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
able2.jpg "/>
Tabel 2. Samenvatting van de bestaande methoden voor het kwantificeren van nucleïnezuren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 1. Real-time kwantitatieve PCR en MDA van Lambda DNA. MDA is niet gediscretiseerd door middel temperatuurcycli zoals PCR, en is gevoelig voor voorversterking indien niet zorgvuldig voorbereid op ijs. Hier, kwantitatieve PCR en MDA werden uitgevoerd met toenemende concentraties van Lambda DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figure 2. Schematische analoge uitlezing van druppels en representatieve beelden. (A) Positieve en negatieve druppeltjes werden gegenereerd uit fluorescerende en niet-fluorescerende reagentia in een microfluïdische inrichting. De druppels werden vooraf gemengd in verschillende positieve: negatieve verhoudingen. Bulk fluorescentie niveaus werden gemeten met een standaard real-time thermocycler en fractie positieve druppeltjes werd bepaald met fluorescentiemicroscopie. (B) Vertegenwoordiger fluorescentie bedekt beelden van toenemende verhoudingen van positieve druppeltjes (schaal bar = 200 pm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Bulk fluorescentie en fluorescerende fractie van combinaties van afzonderlijk bereid positieve en negatieve droplets. (A) TL (positief) en niet-fluorescerende (negatieve) druppels werden voorgemengd in verschillende verhoudingen. Vergelijking van de inputfractie positieve druppeltjes met de gemeten massa en fluorescentie gemeten positieve druppeltje fractie (n = 3, staven stellen +/- SD). De stippellijn geeft de verwachte fluorescerende fractie krijgt een lineair verband. (B) Vergelijking van de voorspelde ratio's op basis van de normen van de verwachte fluorescerende inputfractie. De lijn geeft de verwachte waarde die een lineair verband. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Bulk fluorescentie en fluorescentie fractie van een druppel digitale MDA assay. Digital MDA werd uitgevoerd met IncreAsing concentraties van matrijs Lambda DNA (n = 3 foutbalken SD) en gemeten zoals beschreven in figuur 2A. De lijn geeft de verwachte fluorescerende fractie met behulp van de Poisson-verdeling voor het modelleren van de gegevens uit ons experiment. b) Vertegenwoordiger fluorescentie bedekt beelden van druppels na reactie inactivatie (schaal bar = 200 pm) voor het verhogen van verwachte Lambda DNA-moleculen per druppel (NTC, 0,005, 0,05, 0,5 en 10). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Digitale assays zijn krachtige werkwijzen die detectie van zeldzame cellen en tellen van afzonderlijke nucleïnezuurmoleculen mogelijk. Echter, digitale assays nog niet routinematig toegepast analytische laboratoria, mede door de kosten van gespecialiseerde apparatuur verbonden met commercieel beschikbare methoden. Hier beschrijven we een eindpunt digitale assay voor het kwantificeren van nucleïnezuren met een vereenvoudigde analoge uitlezing met een standaard real-time kwantitatieve PCR machine. Deze methode is snel op te zetten en uitlezing is veel eenvoudiger dan druppel telmethoden.
Onze test verbeurt de single-molecule (één druppel) gevoeligheid van individuele druppel metingen voor de eenvoud van massaal eindpunt meting met behulp van standaard instrumentarium. In onze digitale MDA experiment, konden we niet minder dan 1 positieve druppel per 200 negatieve druppels van de achtergrond te onderscheiden, ondanks bevestiging door fluorescentiemicroscopie dat de werkelijke fractie positieve druppeltjes was zoals verwacht (Figuur 4). De gevoeligheid en achtergrond in de massa fluorescentiemeting beperken de gevoeligheid van de meting bulk assay voor lage positieve druppel fracties. Indien een hogere gevoeligheid nodig, wordt een digitale uitlezing aanbevolen. Verschillen in olie niveaus of bulk druppel volumes kunnen grote invloed hebben op het monster fluorescentie data. Zelfs normalisering met een verwijzing kleurstof kan geen make-up voor de verschillen olie volumes maken in fluorescentie leest. Het is mogelijk dat het optimaliseren testvolume, verwerving instrument parameters microwell geometrie, optische filters assay prestaties kunnen verbeteren.
De gevoeligheid en dynamisch bereik van bulk digitale assays kunnen ook worden verbeterd door optimalisatie van de partitie. Grotere druppels een grotere hoeveelheid fluorescerende producten opleveren van elke sjabloon molecuul, dat kan helpen overwinnen instrumentale achtergrond en het verbeteren van de gevoeligheid voor lage input concentraties. OpAnderzijds kleinere druppels laat de isolatie van meer moleculen per volume bepaald. Als sjabloon concentratie is zeer variabel over monsters, zowel kleine als grote druppel reacties kunnen worden uitgevoerd in parallel uitgevoerd om de test dynamisch bereik 39 uit te breiden.
Consistente druppel volumes ook noodzakelijk voor een nauwkeurige meting. Veel aangepaste microfluïdische oplossingen bestaan voor het snel vormen monodisperse druppels uit een monster, zowel in serie 19,40 en parallel 41,42. Terwijl weinig mogelijk de druppel generatie van verschillende afzonderlijke monsters parallel zouden eenvoudige aanpassingen aan bestaande ontwerpen zorgen voor gelijktijdige opwekking van elke druppel aantal monsters. Bijvoorbeeld, de Bio-Rad ddPCR systeem 23 zijn uniforme druk op de inlaten van een reeks onafhankelijke druppeltje makers, waardoor gelijktijdige druppelvorming van meerdere monsters.
Onze bulk uitlezing methodologie toegang sleutelvoordelen van gepartitioneerde digitale testen zonder dat hiervoor gespecialiseerde uitlezing instrumentatie en is zeer geschikt voor de kwantitatieve WGA. Hier hebben we ons gericht op kwantitatieve WGA, die zeer gevoelig voor verontreinigingen achtergrond vanwege het ontbreken van sequentiespecificiteit 7. Daarnaast is de onbekende en potentieel brede molecuulgewichtsverdeling van producten van real-time kwantitatieve assays WGA de interpretatie moeilijker in toepassingen waarbij het aantal originele templates van belang. Digitale test opmaak adressen beide problemen. Verontreinigingen zijn vervat in afzonderlijke reactiezones wanden, waardoor de dominantie van laag molecuulgewicht analyten door hoog molecuulgewicht verontreinigingen zoals zou optreden bij een conventionele real-time test. In de figuren 2B en 4B, mogelijke verontreinigingen, gezien als heldere vlekken in de druppels, zijn gescheiden en niet versterken of aanzienlijk bijdragen aan de totale fluorescentie. Bovendien is degegenereerd in digitale assays is evenredig met het aantal templates, niet de omvang van sjablonen of de versterking rate. Hoewel onze werkwijze berust op voor aan de bulk digitale meting te kalibreren, de vereiste om monster te passen en standaardkenmerken kan aanzienlijk worden versoepeld.
Kwantitatieve WGA wordt vaak gebruikt om verontreinigingen in WGA reacties 7,34 kwantificeren, en is de meest gevoelige methode bekend voor de aanwezigheid van DNA van onbekende sequenties te kwantificeren, waardoor de werkwijze veelbelovend in toepassingsgebieden zo divers als farmaceutische kwaliteitscontrole, forensische en astrobiology. Bulk digitale uitlezing kan profiteren andere digitale test protocollen zoals digitale PCR, door het versnellen, parallelizing, en vereenvoudiging test uitlezing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25 micromolar each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler - Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
References
- Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59 (1), 101-107 (2013).
- Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).
- Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).
- Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).
- Method of the Year 2013. Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
- OpenArray Technology Overview. , Life Technologies. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html (2014).
- Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip. Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).
- Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).
- Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).
- Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).
- Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).
- Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).
- Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).
- Illumina. , Technology. http://www.illumina.com/technology.html (2014).
- Droplet digital PCR applications guide. , Bio-Rad. Available from: http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr (2014).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).
- Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).
- Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
- Mitos Dropix Systems. , Dolomite. http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system (2014).
- Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
- Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
- Fainman, Y. Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , McGraw-Hill. (2010).
- Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).
- Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).
- System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. Hindson, B. J. , (2014).
- Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).
- Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).
- Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).
- Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).
- Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
- Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).
