Abstract
Digitale Assays sind leistungsfähige Methoden, die Detektion von seltenen Zellen und Zählung von einzelnen Nukleinsäuremoleküle zu ermöglichen. Jedoch digitale Assays noch nicht routinemäßig angewendet wird, aufgrund der Kosten und spezielle Ausstattung mit kommerziell verfügbaren Methoden verbunden. Hier präsentieren wir ein vereinfachtes Verfahren zum Auslesen der digitalen Tröpfchentests unter Verwendung einer herkömmlichen Echtzeit-PCR-Instrument, um Groß Fluoreszenz der tröpfchenbasierten digitalen Assays messen.
Wir charakterisieren die Leistung des Schüttauslese Assays unter Verwendung synthetischer Gemische Tröpfchen und Tröpfchen digitalen Multiple Displacement Amplifikation (MDA) Assay. Quantitative MDA besonders profitiert von einer digitalen Reaktions Format, aber unsere neue Verfahren gilt für alle digitalen Assay. Für etablierte digitale Assay-Protokolle wie digitale PCR dient dieses Verfahren zu beschleunigen und zu vereinfachen Assay Auslesen.
Unsere Großauslesemethode bringt die Vorteile der partitioned Assays ohne die Notwendigkeit für spezielle Auslese Instrumentierung. Die wichtigsten Einschränkungen des Schüttauslesemethode verglichen mit Tropfenzählen Plattformen und die Notwendigkeit für eine Standardprobe reduzierten dynamischen Bereich, wobei die Anforderungen an diese Norm sind weniger anspruchsvoll als für einen herkömmlichen Echtzeit-Experiments. Quantitative Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) wird verwendet, um für Kontaminanten in WGA Reaktionen testen und ist das empfindlichste Art und Weise, um die Anwesenheit von DNA-Fragmenten mit unbekannten Sequenzen zu erkennen, was das Verfahren sehr vielversprechend in unterschiedlichsten Anwendungsbereichen einschließlich der pharmazeutischen Qualitätskontrolle und Astrobiologie.
Introduction
Digitale Assays zur Nukleinsäurequantifizierung (digital PCR) 1-4 und Basis Ordnung (Sequenzierung) stark beeinflussen die Lebenswissenschaften und der Medizin. Digitale Assays stellen die Quantifizierung molekularer zählt auf einer absoluten Skala (nicht relativ zu einer Kontrolle) und bietet hohe Empfindlichkeit und ermöglicht einfache Vergleiche zwischen den Experimenten und entscheidend, so dass der Bau von großen Datenbanken mit vergleichbaren Daten 5 (Tabelle 1).
Im Laufe der letzten 15 Jahre, Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) entstanden neben PCR als allgemeines Instrument für die Nukleinsäure-Amplifikation. Wie PCR ist WGA nützlich für analytische und präparative Anwendungen durch Verstärken Minute Probenelemente bis zu einer Höhe, die leicht nachgewiesen oder für spätere Analysen wie Basensequenzierung verwendet werden kann. Im Gegensatz zur PCR ist WGA nicht speziell auf eine bestimmte DNA-Locus, sondern ermöglicht Amplifikation aller Sequenzen in der Probe, einschließlich der unbekannten Sequenzen.Dieser fundamentale Unterschied zwischen der PCR und WGA macht die Verfahren zueinander komplementär und gibt Anlass zu verschiedenen Herausforderungen in ihrer Anwendung.
Die hohe Ausbeute an WGA Reaktionen 6 ermöglicht Routine-Amplifikation von genomischer DNA aus einzelnen Molekülen 7. Einzelzellen 8 und andere niederBiomasseProben 9 für die Quantifizierung oder eine weitere Analyse. Die großen Herausforderungen mit WGA Chemie verbunden sind seine extreme Empfindlichkeit gegenüber Verunreinigungen und die ungleichmäßige Verstärkung über einzelne Templatmoleküle 6. Allerdings WGA ist an Popularität gewinnt als Single-Cell-Sequenzierung wurde als "Killer-Applikation" des WGA-Technologie 10 und Template-Quantifizierung durch WGA taucht ist in vielen Anwendungsbereichen 7 wichtig.
Instrumentation für digitale Nukleinsäure Quantifizierung wurde zuvor in einer Vielzahl von mit Ventilen und ventillose mikrofluidischen forma beschriebents 11-14 einschließlich tröpfchenbasierten Assays 15,16 (Tabelle 2). , Kommerzielle mikrofluidische Systeme für die digitale Analyse erfordern jedoch Spezialausrüstung für die Reaktionsaufbau und Produkterkennung 17. Benutzerdefinierte Ventil versehenen Mikrofluidik sind flexibel, erfordern aber präzise Mikrofabrikation und pneumatischen Steuerungen 18. Während es relativ einfach ist, monodisperse Mikrotröpfchen zur Emulsionsbasis digitale Assays 19,20 zu machen, ist Digitalanzeige technisch aufwendig und erfordert entweder große Weitfeld-Bildgebung (ähnlich beliebten Next-Generation-Sequencing-Technologien) 21,22 oder High-Speed-Flow-basierte Tröpfchenerkennung 23-25. Im Idealfall, eine digitale Assay wäre einfach vom Set-up, um auszulesen, reduzieren die Notwendigkeit für komplexe Instrumentierung und so eine große Anzahl von Proben schnell ausgelesen werden. Hier beschreiben wir ein vereinfachtes Verfahren zum Auslesen von digitalen Tröpfchen Assays, die einen herkömmlichen Echtzeit-PCR verwendet instrument zur Groß Fluoreszenz der tröpfchenbasierten digitalen Assays messen.
Für digitale WGA Assays für welche analoge Echtzeit-Amplifikationsassays (die ausgezeichnete Ergebnisse liefern für PCR) sind problematisch, besonders vorteilhaft, während der neue Ansatz kann auf digitale PCR-Assays angewendet werden, ist es. WGA gemeinhin Proben mit Templat-Molekülen, die unterschiedlich in Sequenz, Länge und Basengehalt angewandt. Diese unterschiedlichen Templat-Molekülen mit unterschiedlicher Geschwindigkeit 6 verstärkt, was die Verwendung einer Referenz ("standard") Probe mit passenden Eigenschaften. Oft ist eine solche Standard verfügbar sind oder die Eigenschaften der eingehenden Proben unbekannt sind. Die Heterogenität des Eingangsmaterials und längenabhängigen Eigenschaft des WGA-Chemie 26 die Interpretation der Ergebnisse erschweren auch durch die Schaffung von Mehrdeutigkeit, was wird quantifiziert - die Eingangsmasse, Eingangs Anzahl der Moleküle, die eine Kombination der beiden, oder auch nicht. Fsprünglich, die nicht-sequenz Spezifität macht quantitative mehrere Displacement Amplification (MDA) mehr empfindlich gegenüber Verunreinigungen als quantitative PCR, da Schadstoffmoleküle einer beliebigen Sequenz haben ein Potential, sich einzumischen. Mikrofluidischen digitale Assays Adresse Kontamination durch Trennung Templatmoleküle und die Verringerung der Reaktionsvolumina, so dass weniger Schadstoffe abgetastet werden.
Hier verwenden wir ein beliebtes isothermen WGA-Methode, MDA 27. Zu beachten ist, mehrere andere WGA Chemie einschließlich PicoPlex und MALBAC 28 hängen entscheidend von Anfangs isotherme Strangverdrängungsschritte. Isothermen Stufen verstärken die Herausforderung der Anwendung von analogen Echtzeit-Assays für die quantitative WGA. WGA weder vollständig während der Einrichtung verhindert werden, was zu unerwünschten variable Vorverstärkung, noch diskretisiert ("getaktet") in einer Weise, wo die Replikation des heterogenen Moleküle vollständig durchgeführt und gestoppt werden, bevor der nächste Zyklus wie PCR 11 (1). Ein digitales Testformat für WGA empfängt typische Reaktions Setup-Verfahren aufgrund der Segregation von jedem Molekül zur Zählung im Assayendpunkt (so Vorverstärkung beeinflußt die Treffer) Originalausleseeinrichtung Genauigkeit würde weitgehend unabhängig von Variationen in der Amplifikationseffizienz ist.
Der Test ist abhängig von Tröpfchen in Öl mit einheitlichen Mengen hergestellt, wie der Signalpegel pro Tröpfchen in der Assay-Endpunkt wird auf dem Tröpfchenvolumen abhängen, und wir wollen nicht, dass die Konsistenz der Ergebnisse auf Mittelung über eine Verteilung der Tröpfchengrößen abhängen. Erstellen monodisperse Tröpfchen ist heute ein Standardverfahren (etwa 3.500 monodisperse Tröpfchen Papiere sind seit 2013 erschienen), erfordert aber mikrofluidischen Instrumentierung 25. In der Tat haben mehr als sechs Unternehmen entwickelt unabhängige kommerzielle Produkte, die auf die Produktion von solchen Tröpfchen verlassen und Tröpfchenherstellung mikrofluidischen Chipsim Handel erhältlich 23,29. Für diese Studie verwendeten wir kundenspezifische Mikrofluidvorrichtungen in-house (siehe Protokoll) hergestellt. Spritzenpumpen zu fahren Flusses durch die Vorrichtungen sind auch im Handel erhältlich, aber alternativ mit einem einzigen Einmalspritze zur Vakuum angetriebenen Strömungs substituiert werden, um die Kosten von 30 reduzieren.
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Protocol
Anmerkung: Die Herstellung von Mikrofluid-Vorrichtung ist nicht notwendig, diesen Assay als Tröpfchen für dieses Protokoll mit vorhandenen kommerziellen Tropfenträgern 23,29 gebildet werden.
1. Stellen Sie die Tröpfchenbildungs Mikrofluidikvorrichtung
- Vorbereitung Vorlagenform für die Kanäle mit der SU-8 Master Fabrication Protokoll dargelegt zuvor 31, aber mit einem Tröpfchengenerator Maskenmuster 32.
- Fertigen Geräte in PDMS mit den Techniken der Softlithographie 32,33.
2. Bereiten Sie Reaction Mix für Schütt Droplet Anzeige
Hinweis: Das Protokoll kann verwendet werden, um Nukleinsäuren unter Verwendung vieler Arten von Amplifikationsreaktionen zu quantifizieren. Als Beispiel werden die Reagenzien für MDA benötigt mehrerer Lambda DNA-Konzentrationen angegeben. Reagenz Einzelheiten sind in der Tabelle mit den spezifischen Reagenzien aufgeführt. Die Verteilung der Vorlage in den Tröpfchen hängt sufficient Mischen der Probe.
- Zu erhalten oder zu reinigen Phi29 DNA-Polymerase.
- Reinige Phi29 wie zuvor beschrieben 7 oder Kauf von Lieferanten. Die für die gezeigten Experimente verwendet Phi29 gereinigt.
- Herstellung von 10 ml Denaturierungspuffer aus 65 mM KOH, 1,65 mM EDTA und 14 mM DTT.
- Herstellung von 10 ml Neutralisierungspuffer aus 65 mM HCl, 0,21 M Tris-Cl pH 7,0, und 9 mM Tris-Cl pH 8,0.
- Bereiten Sie zwei Standards, einen Leerwert-Kontrolle (NTC), wie Nuklease-freies Wasser, und eine High-Vorlage Konzentration (ungefähr 4 pg / ul Lambda DNA). Denaturieren 3,3 ul jeder Standard mit 3,3 ul Denaturierungspuffer in einem qPCR Rohr. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. Quench mit jeweils 3,3 ul Neutralization Buffer.
- Denaturieren 3,3 ul der Vorlage von Interesse mit 3,3 ul Denaturierungspuffer in einem qPCR Rohr. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. Es wird mit 3,3 & mgr;Neutralisierungspuffer.
- Bereiten Sie 11 ul des Master-Gemisch pro Probe auf Eis. Die 2x MDA Reaktionsmastermischung besteht aus 2x Doppelstrang-DNA (dsDNA) bindenden Farbstoff, 2x qPCR Referenzfarbstoff, 50 uM randomisiert Oligo, 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA Polymerase Reaktionspuffer, 4,8 mM dNTPs, Nuklease-freies Wasser und 40 ug / ml Phi29 DNA-Polymerase. In Phi29 DNA-Polymerase, um den letzten Polymerase nicht begegnen pH-Werte viel höher oder niedriger als 7.5.Mix auch zu gewährleisten.
- Optional: Für weniger False Positives, aussetzen Master-Mix mit UV-Licht vor der Bildung von Tröpfchen 34.
- Bereiten Sie 10 ul der Vormischung pro Probe in einem 0,5 ml oder 1,5 ml klare Röhrchen auf Eis. Die Vormischung besteht aus 55 & mgr; M randomisiert Oligo, 2,2 mg / ml BSA, 1.1x Phi29 DNA Polymerase Reaktionspuffer, 5,3 mM dNTPs und Nuklease-freies Wasser.
- Das Röhrchen wird in Wasser auf Eis, wie beschrieben, 34 und setzen mit UV-Licht (254 nm) mit einem Akku-sammelten Dosis von 5,7 J / cm 2.
- Hinzufügen dsDNA-bindenden Farbstoff auf 1x, Referenzfarbstoff auf 1x und Phi29 bis 40 & mgr; g / ml in der Vormischung. Gut mischen.
- Kombinieren Sie 10 ul der denaturierten Vorlage oder Standard und 10 ul Stammmischung. Gut mischen.
3. Tropfenbildung
Hinweis: Tröpfchen kann sehr empfindlich auf statische Elektrizität und die Scherspannung zu sein. Kleidung, die statische Elektrizität verursachen können, zu entfernen, und erden Sie sich vor der Bildung von Tröpfchen. Griffrohre der Emulsion aus dem oberen Ende der Röhre so weit aus der Emulsion wie möglich. Pipetten-Emulsionen sehr langsam, vorzugsweise mit einer großen Bohrung Pipettenspitze. Bei der Abgabe von einem Pipettenspitze, beobachten Sie die Emulsion auf der Seite der Spitze, um Pipettiergeschwindigkeit bestimmen.
- Form Tröpfchen. Für die Experimente gezeigt, hat der Mikrofluidvorrichtung einen Öleinlass und zwei wässrige Einlässe mit einem Fluss-Fokussierung Übergang zur Erzeugung von Tröpfchen. Verwenden Sie zwei syringe Pumpen, um die Durchflussmengen von 55 ul Öl mit Tensid und einem 20 ul Reaktionsgemisch durch den mikrofluidischen Chip steuern zu 20.000 1 nl Tröpfchen zu erzeugen.
- Anmerkung: Es ist möglich, Tröpfchen mit vielen Arten von Öl mit Tensid zu erzeugen, aber die Zusammensetzung wird Tröpfchenstabilität stark beeinflussen bei hohen Temperaturen und über die Zeit. Eine mögliche Kombination ist fluoriertes Öl HFE 7500 mit einem anionischen Tensid 19,35.
- Erzeugen Tröpfchen in jeder Größe mit einem beliebigen Verfahren 13,36, sondern die Formatvariabilität der Tröpfchenpopulation wird den Groß Fluoreszenz und somit die Genauigkeit des Tests beeinträchtigen. Für die gezeigten Experimente waren monodisperse Tröpfchen mit einem Volumen von 1 nl.
- Sammeln Sie alle der Tröpfchen und Öl in PCR-Röhrchen. Für jede Probe wurden 30 ul Aliquots von Öl in frischen PCR-Röhrchen mit Optokappen und übertragen 20 ul von Tropfen auf der Oberseite des Öl. Die konsistente Volumen sicherzustellen, der Assay als ackuratieren wie möglich.
- Schließen Leitung Kopf fest, als lose Kappen wird das Öl zu verdampfen.
4. isothermen Amplifikation
- Unter Verwendung eines PCR-Thermocycler, qPCR Thermocycler oder Heizplatte, Inkubation der Proben bei 30 ° C für 7 h und inaktivieren für 1 min bei 75 ° C. Die Rohre der Tröpfchen können in einem Kühlschrank mit einer Folie für ein paar Stunden an dieser Stelle abgedeckt gelassen werden.
5. Datenerfassung und Auswertung
- Unmittelbar nach der Reaktion Inaktivierung, messen Farbstofffluoreszenz Ebenen für alle Proben mit der qPCR Thermocycler. Optimalen Filtereinstellungen werden auf die Farbstoff Anregungs- und Emissionsspektren ab. Für dieses Beispiel verwenden Sie die 492 nm-516 nm-Filter für die dsDNA-bindenden Farbstoff gesetzt und die 585 nm-610 nm-Filter für die Referenzfarbstoff eingestellt. Andere Fluoreszenzmesstechniken verwendet, um die Fluoreszenz zu quantifizieren.
- Für jede Probe, die Trägerfluoreszenzintensität des dsDNA-bindenden Farbstoffdie Fluoreszenzintensität der Referenzfarbstoff. Subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz, oder die normalisierte Fluoreszenz des Leerwert-Kontrolle, von allen Proben.
- Erstellen Sie eine lineare Standardkurve unter Verwendung der korrigierten Fluoreszenzmessungen von den Standards. Der NTC-Standard ist der Fluoreszenz einer Probe mit 0% fluoreszierenden Tröpfchen ("alle negativ") und die Hoch Matrizenkonzentration Fluoreszenzmessung ist die erwartete Fluoreszenz für eine Probe mit 100% Fluoreszenz Tröpfchen ("alle positiv"). Verwendung der entsprechenden Standardkurve vorherzusagen, die Zwischenverhältnisse der positiven und negativen Tröpfchen auf der Grundlage ihrer Groß Fluoreszenz.
6. Producing Droplets für Proof-of-Principle-Messungen
- Stellen Fluoreszenz (positiv) Tröpfchen: Vorbereiten eines PCR-Reaktionsgemisch, bestehend aus 0,1 ng Lambda-DNA, 1x dsDNA-bindenden Farbstoff, 1x Referenzfarbstoff, 1,5 Einheiten Taq DNA Polymerase, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,2 mM dNTP und 0,5 uM Primer. Thermozyklus der Mischung 30-mal (95 ° C für 20 sec, 55 ° C für 20 sec, 72 ° C für 1 min), dann bilden Tröpfchen wie oben beschrieben.
- Stellen nicht-fluoreszierenden (negativ) Tröpfchen: Vorbereiten eines PCR-Reaktionsgemisch, bestehend aus 1x dsDNA-bindenden Farbstoff, 1x Referenzfarbstoff, 1,5 Einheiten Taq DNA Polymerase, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,2 mM dNTP, und 0,5 & mgr; M Primer. Thermozyklus die Mischung 30-mal (95 ° C für 20 sec, 55 ° C für 20 sec, 72 ° C für 1 min), dann bilden Tröpfchen.
- Bilden vorgemischten Tröpfchenverhältnisse
- Verteilen Sie 20 ul fluorierte Öl in qPCR Rohre, Deckel mit einem optischen Kappe, um Verdunstung zu verhindern.
- Gently Pipette 10 ul der gut gemischten Tröpfchen in gewünschten Positiv: Negativ-Verhältnisse an der Spitze des Öls. In den gezeigten Ergebnissen, positiv: negativ waren Tröpfchenverhältnisse 1 (alle positiv), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 und 0 (alle negtive).
- Messen Farbstofffluoreszenz Ebenen für alle Proben mit der qPCR Thermocycler. Für dieses Protokoll, verwenden Sie die 492 nm-516 nm-Filter für die dsDNA-bindenden Farbstoff gesetzt und die 585 nm-610 nm-Filter für die Referenzfarbstoff eingestellt.
- Normalisieren dsDNA Bindungsfarbstofffluoreszenz unter Verwendung von Referenzfarbstofffluoreszenz. Weitere Normalisierung durch die Fluoreszenz des "alle positiven" Probe.
- Erstellen Sie eine lineare Standardkurve unter Verwendung der normierten Fluoreszenzmessungen von den "alle positiv" und "aller negativen" Proben. Verwendung der entsprechenden Standardkurve vorherzusagen, die Zwischenverhältnisse der positiven und negativen Tröpfchen auf der Grundlage ihrer Groß Fluoreszenz.
- Das Experiment wiederholt für jedes Verhältnis (n = 3) mit unabhängigen Tröpfchenbildung und Mischen für jede Wiederholung.
7. Proof-of-Principle MDA Experiment
- Messen Sie die Konzentration von Lambda DNA-Stammlösung mit einer specphotometer.
- Berechnen Sie die Template-Konzentration notwendig, um durchschnittlich 10 Templatmoleküle pro Tröpfchen. Aus diesem Protokoll annehmen Tropfenvolumen sind 1 nl und 1 ng des Lambda-DNA enthält etwa 1,9 × 10 7 Kopien. Daher werden 10 Vorlagen pro Tröpfchen 10 Kopien pro nl oder 526 fg Lambda DNA pro ul sein. Die Vorlage wird verdünnt werden ~ 6x, wenn Tröpfchen gebildet werden, damit die ursprüngliche Vorlage höchsten Konzentration 3,2 pg / ul sein.
- Seriell verdünnt das Lambda DNA auf 3,2 pg / ul mit Denaturierungspuffer und gleichen Volumen Neutralization Buffer. Für einen Verdünnungsfaktor von 0,1, zu kombinieren 10 ul Probe mit 45 ul Denaturierungspuffer und Inkubation bei Raumtemperatur für 3 min. In 45 lL Neutralisierungspuffer zu stillen.
- Weiteren Verdünnung der Probe wie in Schritt 7.2 beschrieben, um den Rest der Proben für den Versuch zu machen. Die anfänglichen Vorlage Konzentrationen in den Reaktionen gezeigt, waren 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3,2 fg und fg 1,6 pro Mikroliter.
Hinweis: Die endgültige Vorlage Konzentrationen nach Mastermix Zusätzlich waren 526 fg, 52,6 fg, 26,3 fg, 5,26 fg, 2,63 fg, 526 ag und 263 ag pro Mikroliter. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 und 0,005 erwarteten Lambda Kopien pro Tröpfchen auf. - Generierung und Analyse Tröpfchen aus jeder Probe wie in Schritten von 2,5 bis 5,3 beschrieben.
- Erwerben Sie die gezeigten Fluoreszenzbilder (Abbildung 2,3) mit einer Digitalkamera montiert auf eine Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop mit einer 10-fach Objektiv bei RT. Erwerben zwölf Sichtfelder für jede Probe. Correct Fluoreszenzbilder durch ein Hintergrundbild mit einer Leuchtstoffschieber erhalten.
- Verwenden Sie einen enthaltenen Kammer zur Abbildung 37, wie die Emulsion Öl wird schnell verdunsten.
- Analysieren Sie einzelne Tröpfchen Intensitäten unter Verwendung eines ImageJ Makro (Supplemental Code-Datei).
- Wählen Sie einen Schwellenwert Fluoreszenzintensität, die am besten trennt nicht fluoreszierenden Tröpfchen in der NTC-Bilder von den fluoreszierenden Tröpfchen in den Hoch Matrizenkonzentration Bilder. Für jede unbekannte Probe, die Berechnung der Bruchteil der Tropfen mit einem Fluoreszenz-Intensität oberhalb der Schwelle.
8. PCR und MDA Groß Reaktionen
- Bereiten PCR-Reaktion.
- Seriell verdünnt Matrizen-DNA mit einem Verdünnungsfaktor von 0,1. Für jede Verdünnung, zu kombinieren 10 ul-Vorlage mit 45 & mgr; l Denaturierungspuffer und Inkubation bei Raumtemperatur für 3 min. Kombinieren Sie die Verdünnung mit 45 & mgr; l Neutralization Buffer.
- Es werden 20 & mgr; l PCR-Mastermix pro Probe. Die PCR-Reaktion 1,1x Stammischung besteht aus 60 Einheiten / ul Taq DNA-Polymerase, 11 mM Tris-HCl, 55 mM KCl, 1,65 mM MgCl 2, 0,22 mM dNTP, 1,1 x dsDNA-bindenden Farbstoff, 1,1x Referenzfarbstoff und 550 nM jeder Primer.
- Kombinieren Sie 2 ul verdünnt Vorlage und 20 ul Mastermix.
Hinweis: Die endgültige Vorlage Konzentrationen in ter Reaktionen gezeigt PCR waren 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag und 0 g Lambda-DNA pro Mikroliter und wurden dreifach durchgeführt. - Thermozyklus PCR-Reaktion in qPCR-Maschine mit dem folgenden Programm. Laufen 40 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 57 ° C für 20 sec, 72 ° C für 30 s, bevor 2 min bei 72 ° C für 2 Minuten und Halten bei 4 ° C.
- Normalisieren dsDNA Bindungsfarbstofffluoreszenz unter Verwendung von Referenzfarbstofffluoreszenz vor der weiteren Analyse.
- Bereiten MDA Reaktion.
- Verdünnte Proben wie in Schritt 8.1.1 beschrieben.
- Bereiten Sie 11 ul des Master-Gemisch pro Probe auf Eis. Die 2x MDA Reaktionsmastermischung besteht aus 2x dsDNA-bindenden Farbstoff, 2x Referenzfarbstoff, 50 uM randomisiert Oligo, 2 mg / ml BSA, 2x phi29 DNA Polymerase Reaktionspuffer, 4,8 mM dNTPs, Nuklease-freies Wasser, und 40 ug / ml phi29 DNA-Polymerase.
- Fügen Sie den Phi29 DNA-Polymerase, um 40 ug / ml reicht, um die Polymerase d sicherzustellen,oes nicht begegnen pH-Werte viel höher oder niedriger als 7,5. Gut mischen.
- Denaturieren 3,3 & mgr; l verdünnt Vorlage mit 3,3 ul Denaturierungspuffer in einem qPCR Rohr. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. 3.3 ul Neutralization Buffer.
- Mähdrescher 10 ul der denaturierten Template und 10 ul der Stammmischung. Gut mischen.
- Führen MDA Reaktion in qPCR-Maschine mit dem folgenden Programm.
- Halten bei 30 ° C für 4 Stunden, messen Fluoreszenz jedes 7,5 min.
- Inaktivierung bei 75 ° C für 1 min.
- Normalisieren dsDNA Bindungsfarbstofffluoreszenz unter Verwendung von Referenzfarbstofffluoreszenz. Weiter normalisiert durch die maximale Fluoreszenz für jede Probe.
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Representative Results
Während herkömmliche Bulk / Echtzeit-Auslesen kann sowohl für quantitative PCR und quantitative Assays WGA (Figur 1) verwendet werden, digital quantitative Assays bieten Vorteile (Tabelle 1). In dem beschriebenen Verfahren ausgelesen wir digitalen Assays in Mikrotröpfchen-Format mit einer einfachen Schüttendpunktmessung (Abbildung 2). Während dieses Verfahren breit anwendbar, konzentrieren wir uns auf quantitative WGA (MDA), da dieses Verfahren stellt besondere Herausforderungen für herkömmliche Echtzeit-Assays.
Um zu überprüfen, ob unsere Echtzeit-PCR-Instrument könnte unterschiedlicher Fraktionen von fluoreszierenden Mikrotröpfchen in Öl dispergiert zu erkennen, haben wir den Groß Fluoreszenz der synthetischen Mischungen von fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Tröpfchen (Abbildung 2). Der Groß Fluoreszenz und positive Tropfenzahl (unabhängig durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht) skaliert linear mit der Eingangsbruchteil der Leuchtstofftröpfchen, wie erwartet (Abbildung 3a). Das Experiment wurde dreimal durchgeführt, wobei unabhängig die Tröpfchenbildung und das Mischen für jeden Satz.
Um die theoretischen Quantifizierung Leistung für "unbekannt" Proben zu bewerten, haben wir lineare Standardkurven unter Verwendung von ausschließlich positiven und völlig negative Kontrollproben. Mit solchen tröpfchenchargenspezifische Standardkurven, berechneten wir den Anteil der synthetischen positive und negative Tröpfchengemische auf Basis von jeder Probe Groß Fluoreszenz. Die Ergebnisse zeigen eine gute Leistung in Tröpfchenverhältnis Quantifizierung auf zwei Klotz des Dynamikbereichs (R 2 = 0,984; 3B). Die Eingangs Analytkonzentration wird leicht aus der Fraktion von positiven oder negativen Tröpfchen 38 berechnet.
Um unsere Methode in einem echten quantitativen WGA-Test zu testen, maßen wir Fluoreszenzstufen und Bruchteil positive Tröpfchen einer digitalen Tröpfchen MDA-Test mit Lambda-DNA über einen wi de Konzentrationsbereich (Abbildung 4). In 4B sind repräsentative Fluoreszenzbilder der Tröpfchen gezeigt. Sowohl Schütt Fluoreszenz und positive Tröpfchen Fraktion aus den digitalen Samples zu skalieren MDA wie bei der Mittelvorlage pro Tröpfchen zu erwarten, was darauf hinweist, dass der Großauslesegetreu Ergebnis auffangen eines digitalen Assay (R 2 = 0,927). Wir wiederholten das Experiment für jede Konzentration, unabhängige Bildung von Tröpfchen und Durchführung von WGA für jede Wiederholung.
Tabelle 1. Zusammenfassung der Echtzeit-und digitalen Assays. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Tabelle 2. Zusammenfassung der bestehenden Methoden zur Quantifizierung von Nukleinsäuren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 1 quantitative Echtzeit-PCR und MDA von Lambda-DNA. MDA nicht durch Temperaturwechsel wie PCR diskretisiert, und ist anfällig für Vorverstärkung, wenn nicht sorgfältig auf Eis hergestellt. Dabei wurden quantitative PCR und MDA mit steigenden Konzentrationen von Lambda-DNA durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figure 2. Schematische Darstellung der analogen Auslese von Tröpfchen und repräsentativen Bilder. (A) Die positiven und negativen Tröpfchen wurden aus fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Reagenzien in einer Mikrofluidik-Vorrichtung generiert. Negativen Verhältnisse: Die Tröpfchen wurden in verschiedenen positiven vorgemischt. Großfluoreszenzwerte wurden mit einem Standard-Echtzeit-Thermocycler gemessen und Bruchteil des positiven Tröpfchen wurde durch Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. (B) Repräsentative fluoreszierenden überlagert Bilder der zunehmenden Verhältnissen von positiven Tröpfchen (Maßstab = 200 & mgr; m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Bulk-Fluoreszenz und Fluoreszenzanteil von Kombinationen von separat hergestellten positiven und negativen droplets. (A) Fluorescent (positiv) und nicht-fluoreszierenden (negativ) Tröpfchen wurden vorgemischt in unterschiedlichen Verhältnissen. Vergleich der Eingangsbruchteil des positiven Tröpfchen mit dem gemessenen Massenfluoreszenz und gemessene positive Tröpfchenanteil (n = 3, Balken repräsentieren +/- SD). Die punktierte Linie die erwartete Fluoreszenzfraktion bei einer linearen Beziehung. (B) Vergleich der vorhergesagten Verhältnisse auf Basis von Standards, um die erwartete Fluoreszenzeingangsfraktion. Die Linie zeigt die erwarteten Wert bei einer linearen Beziehung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Bulk-Fluoreszenz und Fluoreszenzbruchteil eines Tropfens digitale MDA-Test. Digitale MDA wurde mit incre geführtAsing Konzentrationen Vorlage Lambda DNA (n = 3, Fehlerbalken stellen SD) und gemessen, wie in 2A beschrieben. Die Linie zeigt die erwartete Fluoreszenz Fraktion unter Verwendung der Poisson-Verteilung, die Daten aus unserem Experiment modellieren. b) Vertreter fluoreszierenden überlagert Bilder von Tröpfchen nach der Reaktion Inaktivierung (Maßstab = 200 & mgr; m) zur Erhöhung erwartet Lambda DNA-Moleküle pro Tröpfchen (NTC, 0,005, 0,05, 0,5, und 10). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen .
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Discussion
Digital Assays sind leistungsfähige Methoden, die den Nachweis von seltenen Zellen und Zählen der einzelnen Nukleinsäuremoleküle zu ermöglichen. Jedoch digital Assays sind noch nicht routinemäßig in analytischen Labors zu den Kosten von Spezialausrüstung mit kommerziell verfügbaren Methoden verbunden angewendet, die teilweise. Hier beschreiben wir einen Endpunkt digitalen Assay zur Quantifizierung von Nukleinsäuren mit einer vereinfachten analogen Auslese Verwendung eines Standard quantitative Echtzeit-PCR-Maschine. Diese Methode ist schnell zu Set-up, und das Auslesen ist viel einfacher als Tröpfchen Zählverfahren.
Unser Test verliert das Einzelmolekül (Single-Tröpfchen) Empfindlichkeit einzelner Tröpfchen Messungen für die Einfachheit der Massen-Endpunkt-Messung unter Verwendung von Standard-Instrumentierung. In unserer digitalen MDA Experiment konnten wir nicht unterscheiden, weniger als 1 positive Tröpfchen pro 200 negativen Tröpfchen aus Hintergrund, trotz Bestätigung durch Fluoreszenzmikroskopie, die das tatsächliche fraRésol positiver Tröpfchen als erwartet (Abbildung 4). Die Empfindlichkeit und den Hintergrund in der Masse Fluoreszenzmessgrenze der Empfindlichkeit der Massenmessung Assay für niedrige positive Tröpfchenfraktionen. Wenn höhere Empfindlichkeit erforderlich ist, wird ein digitales Auslese empfohlen. Unterschiede in der Ölstand oder Großtropfenvolumen kann großen Einfluss auf die Probe Fluoreszenzdaten. Auch die Normalisierung mit einem Referenzfarbstoff kann sich nicht entschließen, für die Unterschiede Ölmengen zu machen in der Fluoreszenz liest. Es ist möglich, dass die Optimierung Assayvolumen, instrument Erfassungsparameter, Mikrovertiefungsgeometrie oder optischen Filtern kann die Testqualität zu verbessern.
Die Empfindlichkeit und den dynamischen Bereich des digitalen Groß Assays kann auch durch Optimierung der Partitionsgröße verbessert werden. Größere Tröpfchen ergeben eine größere Menge von fluoreszierenden Produkten aus jedem Template-Molekül, die helfen können, zu überwinden instrumentale Hintergrund und verbessert die Empfindlichkeit für niedrige Eingangskonzentrationen. Amdie andere Hand, kleinere Tröpfchen ermöglichen die Isolierung von mehr Moleküle pro Volumen untersucht. Wenn Matrizenkonzentration ist höchst unterschiedlich Proben können kleine und große Tröpfchen Reaktionen parallel durchgeführt, um den Assay dynamischen Bereich 39 erweitern.
Mäßiger Tropfenvolumina sind auch für eine genaue Messung erforderlich ist. Viele kundenspezifische mikrofluidische Lösungen existieren für die rasche Bildung monodisperser Tropfen aus einer Probe, die beide in Serie 19,40 und parallel 41,42. Während nur wenige ermöglichen die Tröpfchenerzeugung aus mehreren getrennten Proben parallel würden einfache Modifikationen an bestehenden Konstruktionen für die gleichzeitige Erzeugung von Tröpfchen einer beliebigen Anzahl von Proben ermöglicht. Zum Beispiel kann die Bio-Rad ddPCR System 23 gilt gleichmäßigen Druck an den Einlässen aus einer Reihe von unabhängigen Tröpfchen Entscheidungsträger, ermöglicht die gleichzeitige Tröpfchenbildung von mehreren Proben.
Unsere Großauslese Methodik greift SchlüsselVorteile der partitionierten digitalen Assays ohne die Notwendigkeit für spezielle Auslese Instrumentierung und dient zur quantitativen WGA gut geeignet. Hier, auf quantitative WGA, die sehr anfällig für Hintergrund Verunreinigungen konzentrierten wir aufgrund seiner fehlenden Sequenzspezifität 7. Darüber hinaus ist die unbekannten und möglicherweise breiter Molekulargewichtsverteilung der Produkte von der quantitativen Echtzeit-Assays WGA Interpretation erschweren in Anwendungen, bei denen die Anzahl der Originalvorlagen von Interesse ist. Digitale Assay Formatierung wendet sich sowohl diese Probleme. Verunreinigungen werden in den einzelnen Reaktions Partitionen enthalten sind, verhindern, dass die Dominanz von niedrigem Molekulargewicht von Analyten hochmolekularen Verunreinigungen, wie sie bei einem herkömmlichen Echtzeit-Assay erfolgen. In den 2B und 4B, mögliche Verunreinigungen, als helle Flecken innerhalb der Tröpfchen zu sehen ist, werden ausgesondert und nicht verstärken oder wesentlich zur Gesamtfluoreszenz. Ferner dasin digitaler Assays erzeugte Signal ist proportional zu der Anzahl von Vorlagen, nicht die Größe der Vorlagen oder ihrer Verstärkungsrate. Obwohl unsere Methode beruht auf Standards, um den Groß digitale Messung zu kalibrieren, die Verpflichtung zur Probe übereinstimmt und Standardeigenschaften können erheblich gelockert werden.
Quantitative WGA wird häufig verwendet, um Verunreinigungen in WGA Reaktionen 7,34 quantifizieren und ist das empfindlichste Verfahren bekannt, um die Anwesenheit von DNA des unbekannten Sequenz zu quantifizieren, so dass die Methode sehr vielversprechend in der Anwendung so unterschiedlichen Bereichen wie der pharmazeutischen Qualitätskontrolle, Forensik und Astrobiologie. Großdigitalanzeige können andere digitale Assay-Protokolle wie digitale PCR profitieren, durch die Beschleunigung, Parallelisierung und Vereinfachung Assay Auslesen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25 micromolar each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler - Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
References
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