Introduction
多孔性配位高分子（のPCP）は、非晶質または結晶質であってもよい1-3 1、2または3次元に延びる調整エンティティを繰り返し、有機リガンドにより結合された金属中心に基づいて、配位化合物です。近年では、多孔性材料のこのクラスは、それらの高い多孔性、広い化学調整可能性、及びその安定性に広く注目を集めています。のPCPは、ガス貯蔵、ガス分離、および触媒3-6を含むアプリケーションの範囲について検討されており、非常に最近のPCPの最初の分析アプリケーションは、7に記載されています。
そのため、その強化された化学官能性と高気孔率のPCPの精製プロセスおよびクロマトグラフィー分離の改善のための巨大な潜在的な対象のされており、このトピックに関するレポートの数は7-13を公開されています。しかし、のPCPの性能はequivaleで、現在ではありませんそれらの粒子または結晶のそれらの一般的に不規則な形状の形態に起因するこれらの固体の充填床に大きな粒子間の空隙を介して高速拡散する可能性が高い既存のクロマトグラフィー材料とNTレベル。この不規則に分布パッキンが予想より低い性能だけでなく、高いカラム背圧、望ましくないピーク形状形態14,15につながります。
粒子間の空隙を介して高速拡散の問題を解決し、同時に分析アプリケーションのためのPCPの性能を高めるために、マクロ細孔の表面にPCPを含んでいるマクロ多孔性ポリマーモノリス16に基づいて、ハイブリッド材料の開発希望ことが望ましいこと。ポリマーモノリスは、それらパッキンをビーズに最も効率的な代替手段の一つであり、正常にいくつかのCによって商品化されていることができており、その孔を通して対流を維持することができる自己完結型、シングルピースの材料であります ompanies 17,18。多孔質ポリマーモノリスは、通常、モノマーの重合と、典型的には、有機溶媒の二成分混合物であるポロゲンの存在下で架橋剤に基づいています。得られたモノリス材料はmicroglobular構造と高気孔率と流れ透過性を有します。
PCPを含むポリマーモノリスを調製するために、これらの材料を統一するための単純なアプローチは、モノリスの重合混合物のような合成のPCPの直接添加に基づいています。このアプローチは、主にポリマー骨格内に埋め込 まのPCPをもたらし、最終的な材料14,15のさらなる適用のためにアクティブではありません。別の合成アプローチは、明らかに、例えば、結晶中に含まれる気孔の大部分は、ポリマーモノリスのマクロ孔からアクセス可能であるのPCP、または結晶質の金属有機構造体（MOF）の均一な膜を開発するために必要とされます。
tは ">ここで、我々は簡単に自己完結型の単として実装することができるのPCPの取り付けに適した官能基を有するマクロ多孔性ポリマー支持体に基づく有機金属ポリマーハイブリッド材料（MOPH）の調製のための簡単なプロトコルを報告しますフロースルーのアプリケーションに最適な特性を有する列形式で-pieceポリマーモノリス。ポリマー合成手順は、単純な室温の溶液系が続きます モノリス19-20の孔の内面にPCPコーティングを成長させる方法。第1の例として、我々は、マクロ孔質ポリ（スチレン - ジビニルベンゼン - メタクリル酸）モノリス内の鉄（III）benzenetricarboxylate（FeBTC）配位ポリマーフィルムの調製を記載します。この方法は、バルク粉末の調製並びにキャピラリカラムのために効果的であると記載されているプロトコルは、他のPCPに容易に実装可能です。フローthrouのための機能性材料としてMOPHsの電位の例として、GHアプリケーションでは、我々は、Fe（III）の緻密なコーティングは、Fe（III）へのリン酸化の結合親和性を利用する消化されたタンパク質の混合物からリン酸化ペプチドを豊かにする中心含まれている開発FeBTC MOPHを適用しました。開発されたプロトコル21は、3つの主要部分を含む：マクロポーラス有機ポリマーモノリス担体の調製;モノリスの細孔の表面にPCPコーティングの成長;ホスホペプチドの濃縮のためのアプリケーションです。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：開始する前に、関連するすべての材料データシート（MSDSを）を確認します。合成およびアプリケーションの手順で使用される化学物質のいくつかは有毒です。すべての適切な安全対策に従って、適切な保護具（白衣、フルレングスのパンツ、閉じたつま先の靴、安全眼鏡、手袋）を使用してください。窒素吸着測定のために液体窒素（絶縁手袋、フェースシールド）を取り扱う際は、すべての極低温個人用保護具を使用してください。
バルクとキャピラリカラム形式で1多孔質ポリマーモノリスの準備
- 特性評価のためのバルクポリマーモノリス
- 重合抑制剤を除去するために、塩基性アルミナのカラムに通し、スチレン、ジビニルベンゼン、メタクリル酸を精製します。シリンジチップに詰めたガラスウール繊維のプラグ付きの25ミリリットル使い捨てのプラスチック製注射器に塩基性アルミナ10gを配置します。カラムを通して単量体の約10ミリリットルを浸透。
- モノマー（50 mgのスチレン、100mgのジビニルベンゼンおよび50mgメタクリル酸）および1ミリリットルのガラスバイアルの孔形成剤（300 mgのトルエンと300ミリグラムイソオクタン）をロードします。重合開始剤、2,2'-アゾビスイソブチロニトリル（AIBN、モノマーに対して1％）の4ミリグラムを追加します。
- 10分間の超音波処理によってホモジナイズします。 10分間液体窒素をバブリングすることによって溶存酸素を除去します。パラフィンフィルムでバイアルキャップを密封し、混合物を重合するために6時間、60℃の水浴中に置き。
- 室温まで冷却し、慎重にバイアルを破ります。セルロース抽出シンブルにポリマーモノリスを転送します。ソックスレー抽出チャンバ内に抽出シンブルに入れ、抽出チャンバの少なくとも3倍の体積であるメタノールの量が含まれている丸底フラスコに組み立てます。抽出チャンバーの上部にコンデンサーを組み立てます。メタノールを沸騰させてソックスレー抽出を行います16時間、未反応モノマーおよび孔形成剤の完全な除去を確実にします。
- 60℃の真空オーブンで一晩乾燥。赤外分光法（FT-IR）をフーリエ変換することによりPCPを取り付けるためのカルボン酸官能基の存在を確認します。窒素吸着ポロシメータによって表面積を測定します。
- モノリシックカラムの作製のためのシリカキャピラリーの機能化
- ポリイミドコーティングされた100ミクロンのID溶融シリカキャピラリーの2メートルをカット。 0.25〜0.50ミリリットルのガラス製注射器に接続し、アセトンでキャピラリーを洗浄します。水でキャピラリーをすすぐことによりアセトンを除去。
- キャピラリーの内部シリカコーティングを活性化するために、30分間、0.25μL/分で0.2 M NaOH水溶液を流すシリンジポンプを使用。流出液が中性になるまで水で洗い流してください。
- 流出液のpHをチェックするためにpH試験紙ストリップを使用してください。キャピラリーのシラノール基をプロトン化するために、0.2 M aqueoポンプ30分間、0.25マイクロリットル/分でキャピラリーを通して私たちのHCl溶液。流出液が中性になるまで水で洗い流してください。エタノールですすいでください。
- 0.25μlの1時間/分で、3-（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート（pH5の酢酸で調節）の20％（w / w）のエタノール溶液をポンプ。このステップでは、シリカキャピラリーは、キャピラリー内表面にポリマーモノリスを取り付けるためにビニル基で官能化されます。
- 、アセトンですすぎ、窒素気流中で乾燥し、使用前に室温で一晩おきます。長さ20cmの短い断片にキャピラリをカット。
- モノリシックキャピラリカラムの調製
- ゴム隔壁を1ミリリットルのガラスバイアルにバルクポリマーモノリス（セクション1.1）のためのものと同一の重合混合物を準備します。モノマーに対する開始剤を1％AIBNを追加します。 10分間の超音波処理によってホモジナイズします。
- 非官能基化シリカキャピラリーを結合することによって、窒素で重合混合物をパージ窒素気流へ。
- バイアルのゴム隔壁を通して窒素流キャピラリーを挿入し、窒素が液体を介して気泡ように重合混合物にそれを浸します。過剰圧力を回避するために、少し緩いバイアルキャップを残します。 10分間パージします。
- バイアルのヘッドスペースに重合混合物から窒素流キャピラリーを持ち上げ、しっかりとキャップを閉じます。重合混合物中にセプタムを通して官能キャピラリを挿入します。ヘッドスペース内に注入窒素を介してキャピラリーに発生する圧力の過剰は、官能毛細管を通して重合混合物をポンプ。
- それが完全に満たされることを確実にするために、毛細管の流出物から重合混合物を数滴を収集し、ゴム隔膜で閉じます。非常に慎重にバイアルからキャピラリを取り、ゴム隔膜でキャピラリーの入口を閉じます。
- ミックスを重合6時間、60℃の水浴中でキャピラリー内に含まれるチャー。室温で冷却し、キャピラリーの両端の数ミリを切りました。 30分間の3μL/ minでHPLCポンプを用いてアセトニトリルでカラムを洗浄することにより未反応モノマーおよび孔形成剤を除去します。キャピラリカラムの背圧を確認してください。
鉄benzenetrycarboxylate 2.成長（FeBTC）PCP
- 特性評価のためのバルクポリマーモノリスのFeBTC MOPHの成長
- 乳鉢と乳棒を用いて予め乾燥モノリスを粉砕。
- 15分間、エタノール中の2mMのFeCl 3·6H 2 O 5ml中モノリス粉末100mgを浸し。ナイロンフィルター（0.22μm）を用いて、真空フィルター、エタノールで粉末を洗浄します。 15分間、エタノール中の2 mMの1,3,5-ベンゼントリカルボン酸（BTC）5ml中モノリス粉末を浸し。ナイロンフィルター（0.22μm）を用いて、真空フィルター、エタノールで粉末を洗浄します。
- 必要に応じて、ステップ数2を繰り返します。最終的な有機金属被膜の成長は、適用されたサイクル数によって定義されます。典型的には、10〜30サイクルが行われます。窒素吸着ポロシメータによる新たな細孔が存在することを確認してください。熱重量分析（TGA）によって、追加の金属部位の量を測定します。
- ホスホペプチドの濃縮のためのキャピラリーモノリスカラム上FeBTC MOPHの成長
- シリンジポンプを使用しました。 2μL/分で15分間、エタノール中の2mMのFeCl 3·6H 2 Oでキャピラリーモノリスをフラッシュします。 2μL/分で15分間、エタノールで洗浄します。 2μL/分で15分間、エタノール中の2 mMのBTCとキャピラリーモノリスをフラッシュします。 2μL/分で15分間、エタノールで洗浄します。
- 必要に応じて、ステップ1を繰り返します。最終的な有機金属被膜の成長を行うサイクルの数によって定義されます。
3.タンパク質消化およびEリン酸化ペプチドのnrichment
- タンパク消化
- 1mlの水に無脂乳0.5mlのを溶解し、200μlの画分に分割します。
- タンパク質消化のためのジスルフィド結合を切断するために、各画分に160μlの1 M重炭酸アンモニウムと50μlの45mMのジチオスレイトールを追加します。 15分間、サーモミキサーで50℃でインキュベートします。
- 溶液を室温まで冷却しながら、ヨードアセトアミドの100mM水溶液を徐々に50μlを添加します。ヨードアセトアミドは、新たなジスルフィド結合の形成を防ぐことができます。
- 室温で15分間、暗所でインキュベートします。脱イオン水1ミリリットルを追加します。 2μgのトリプシンを添加し、14時間、37℃でサーモ中のタンパク質を消化します。
- 1％トリフルオロ酢酸の10μlの酸性化によって消化を終了し、そして室温で5分間サーモミキサーに入れます。 -20℃で消化したタンパク質を保存します °C。
- キャピラリMOPHカラムを用いてリン酸化ペプチドの濃縮。
- 1μL/分の流速で10分間、0.1％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの4：1混合物100μlでカラムを洗浄します。 30分間、2μL/分でカラムに通してタンパク質消化ポンプ。
- 1μL/分の流速で10分間、0.1％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの混合物1：4で再び非リン酸化ペプチドを洗浄します。 1μL/分の流速で10分間水で洗浄します。
- 15分間、1μL/分でポンピング250mMのpH7のリン酸緩衝液を用いてリン酸化ペプチドを溶出させます。バイアルに溶離液を収集し、標準的なプロトコル19を用いて、溶液を脱塩します。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF-MS）のためのマトリックスとして使用するために2 mg / mlの2,5-ジヒドロキシ安息香酸を調製します。 phosphopeを溶出するために、先端に2,5-ジヒドロキシ安息香酸の2μLを描かptidesとMALDIプレート上に直接それらを見つけます。
- MALDI-TOF-MSによるスポットを分析し、水、次いでメタノールで十分に洗い流すことによって列を再生成します。
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Representative Results
有機ポリマーモノリスの細孔表面上のPCPの成長の概略図を図1に示す。この図では、我々は、カルボキシル官能基に配位し、元のポリマーモノリスの細孔表面上に保持され、初期のFe（III）原 子を例示します。プロトコルを使用して、本明細書中に追加の有機配位子とを記載したFe（III）イオンは、ポリマーモノリス内の多孔性配位ネットワークを成形、表面に添加されている。また、概略的にするためのフロースルー支持されるように調製キャピラリMOPHカラムの使用を示す図1ホスホペプチドの濃縮。表面積と細孔分布の測定、走査型電子顕微鏡像（SEM）、FT-IR及びTGAを調製した材料（ 図2）のために収集しました。これらの特性評価実験はFeBTC PCP（ 図2A）の成長後の新たな孔の出現についての貴重な情報を提供しました。 MOFeBTC PCPと変更後の材料のrphologyは、 図2Bに示されています。結晶シミュレーションに基づいて、それぞれの個々のMOF層の厚さは、成長する結晶の配向性に依存して、3,5Åであると推定されます。 FT-IRスペクトルは、合成ポリマーモノリスとFeBTCサイクル（ 図2C）の異なる数とその変性対応物中の官能基の存在を示します。 TGAは、元のポリマーモノリスの変更後に得られた熱安定性と金属部位（ 図2D）の増加を示しています。 600°Cの残基は、粉末X線回折によって確認されるように、α- の Fe 2 O 3です。キャピラリカラムフォーマット中の鉄の存在は、エネルギー分散型X線分光法21によって検出される。 図3は、からホスホペプチドの濃縮のために開発さMOPH材料の実際のサンプル·アプリケーションの一例を示す図脱脂乳の消化。
図1：リン酸化ペプチドを抽出するためのMOPHのキャピラリカラムを調製するための主要工程を示すスキーム（A）イラスト。 （B）を調製MOPHカラムを用いてリン酸化ペプチドを抽出するための手順の説明図。
図2：バルクFeBTC MOPH特性評価結果を元の有機ポリマーモノリス30調整サイクル後MOPHの（A）細孔サイズ分布および窒素吸着等温線。 （B）30の調整サイクル後MOPHのSEM像。 （C）は、元のポリマーモノリスと10、20、30調整サイクル後MOPHのFT-IRスペクトル。 （金属前駆体溶液を有する単一の洗浄後、10、20、30調整サイクル後、元のポリマーモノリスのD）TGA。 （参考文献から適応。21ジョン·ワイリー·アンド·サンズからの許可を得て。）
図3：10 FeBTC協調サイクル後MOPHキャピラリカラムを使用して濃縮前後で消化された脱脂乳サンプルの毛管FeBTC MOPH列 MALDI-TOF-MSスペクトルを用いて乳からリン酸化ペプチドの濃縮 。脱リン酸化フラグメントがハッシュで示され、一方リン酸化に起因するMSピークは、アスタリスクで示されています。リン酸化ペプチドは、参考文献23〜27を使用して割り当てました。 （参考文献から転載。21ジョン·ワイリー·アンド·サンズからの許可を得て。）
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Discussion
元のポリマーモノリスは、金属に結合することができるカルボン酸官能基を含んでいます。元の材料に初期金属部位の調整、我々は、微孔性ネットワークを成形する付加的な金属部位の数を取り入れ、PCPコーティング（ 図1A）を増殖することができます。これは、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）法などの金属種が関与している抽出または精製手順のための魅力的な提示MOPH材料を行います。ホスホペプチドの濃縮のためのキャピラリカラムを用いた一般的な手順は、 図1Bに示されています。
バルク粉末モノリスの製造は、元のモノリシック材料の特性評価およびその改変の対応を可能にしました。私たちは、主にO、低P / Pのそれは30 PCPサイクル後、N 2の取り込みを示しており、77 K（ 図2A）でN 2吸収等温線を測定しました材料中の新しいミクロ孔の存在を示す、増加しました。元のモノリス増加の表面積389メートル2 / gで106 m 2の / gの約4倍。ただサイクルの数が少ない（10 PCPサイクル）を行う156メートル2 / gの表面積に材料の多孔度の増加を測定しました。詳細なアプローチを用いて、多孔質材料の調製は、Fe系のPCPにだけ限定されるものではありません。銅によって鉄を代入すると、結果として得られるCuBTCコーティングのわずか10サイクル219 2 / gの106メートル2 / gでMOPHの表面積を増大させるために必要でした。細孔径分布（ 図2A）に示すように変更材料中に存在する新たな細孔が3ナノメートルより小さい直径を有します。ポリマーモノリスの表面にPCPコーティングの分布は、SEMを用いて調べた。 図2B、microglobulに基づく多孔性構造で構成されて30 PCPサイクル後にモノリスを示し、したがって、元のポリマーモノリスの初期形態を保持ARネットワーク。大きなメソ及びマクロは、有機ポリマーモノリスの優れた流動性を維持し、変更後のそのまま残ります。 FT-IRを用いて、我々はFeBTC PCPの取り付けのための（1707センチメートル-1のバンド）カルボン酸官能基の初期取り込みを確認しただけでなく、バンド1,382の増加により、コーティングの成長を監視し、1,449、1,627および3400センチメートル- 1（ 図2C）。 TGAを行う我々は、材料中のFe（III）（ 図2D）の量の増加を測定しました。我々は、600°CでのTGA残基が2 O 3、鉄をα、残留物の質量に基づいていることが確認された粉末X線回折を用いて、元のポリマーモノリスとMOPHsで質量％のFeを算出します。示す例では、元のモノリスに初期％Feが1.1％であり、この値は10.5％aに増加しますFTER 30 PCPサイクル。
MOPHsの調製は、アプリケーションを通る流れを開発するためのキャピラリカラムフォーマットに容易に適合可能です。この場合、孔の表面上の鉄（III）の部位の高い豊富に含有して調製MOPHは低豊富なホスホペプチドのIMACの濃縮のための優れた候補になります。固定化されたFe（III）を有するオリジナルの支持体は、5または10 PCPサイクル21の後に類似の支持体と比較した場合、材料の性能の緩やかな増加が観察されます。 MOPHキャピラリーカラムの製造における重要なステップはFeBTC配位ポリマーのサイクル数がMOPHカラムのさらなる適用のために適切であることを保証することです。一例として、 図3は MOPHキャピラリカラムを使用して、消化商業脱脂乳からホスホペプチドの濃縮のために得られた結果を示しています。この例では、MOPH塔10 FeBTCサイクルを発揮した後にリン酸化のための驚くべき選択。濃縮せずにサンプルを直接分析することにより、低豊富なリン酸化ペプチドのいずれも検出されません。開発MOPH材料を使用して同じサンプルを濃縮した後、12の異なるリン酸化を選択的にそれらの良好な検出を可能に抽出されます。 30 FeBTCサイクルで修飾されたキャピラリカラムの容量は、ニトリロ酢酸28に基づいて、市販の鉄親和性ゲルよりも優れている3.25モルATP / mlです。開発されたFe系MOPHは、このような有機リン系殺虫剤や神経剤などの他の有機リン酸塩、の抽出のための潜在的に実現することができます。生体分子の濃縮に向かってMOPHの選択性は、配位重合体の調製のための異なる結合特性を有する金属を選択することによって調整することができます。
私たちは、多孔性ポリマーモノリスにおいて、高多孔質PCPコーティングの成長のための簡単な手順を示しています均一ポリマーマクロ孔を被覆する機能PCPを含むフロースルーのサポートの最初の例です。得られたMOPHsは、列形式にパックされた、多孔質ポリマー中に埋め込まれているときに、粒子間の空隙を通って流れ、ならびに多孔質固体の小孔への浸透に関連した拡散物質移動の制限を克服します。私たちは、IMACによるホスホペプチドの濃縮のためにこれらの材料の有用性を示しました。ここで報告された手順は、多くのPCPと同様の材料を使用して実施することができます。技術の主な制限は、コーティングの面倒な手動の製造です。しかし、著者らによる現在の研究は、コンピュータ制御された流れの技術を使用して、この方法の自動化に向けて集中しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyimide-coated capillaries | Polymicro Technologies | TSP100375 | 100 μm i.d. |
| 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98% | Sigma-Aldrich | 440159 | |
| Styrene, 99% | Sigma-Aldrich | W323306 | Technical grade |
| Divinylbenzene, 80% | Sigma-Aldrich | 414565 | |
| Methacrylic acid, 98% | Mallinckrodt | MK150659 | |
| Toluene, ≥99.5% | EMD chemicals | MTX0735-6 | |
| Isooctane, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 650439 | |
| 2,2'-azobisisobutyronitrile, 98% | Sigma-Aldrich | 441090 | |
| Aluminium oxide (basic alumina) | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate, 97% | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| 1,3,5-benzenetrycarboxylic acid, 95% | Sigma-Aldrich | 482749 | |
| Acetonitrile, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 360457 | |
| Ammonium bicarbonate, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Trifluoroacetic acid, ≥99% | Sigma-Aldrich | 302031 | |
| Ethanol, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 2854 | |
| Iodoacetamide, ≥99% | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Dithiothreitol, ≥99% | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| Monobasic sodium phosphate dihydrate, ≥99% | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Dibasic sodium phosphate dihydrate, ≥99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Phosphoric acid, ≥85% | Sigma-Aldrich | 438081 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid, ≥99% | Sigma-Aldrich | 85707 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | Bovine pancreas |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | Bovine milk |
| ZipTip pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | C18 resin |
References
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