Implantation av miniosmotiska Pumpar och leverans av Tract Tracers att studera hjärnan Omorganisation i patofysiologiska tillstånd

Protocol

Djurförsök utfördes med regeringens godkännande (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 och G1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung Düsseldorf) baserad på NIH riktlinjer för vård och användning av försöksdjur.

1. Framställning av miniosmotiska Pumpar

1. I en steril miljö (dvs.., Cellodlings huva), erhålla pumpen, kateter, flödesmoderator, hjärninfusionskanyl och distansskivorna som skall användas (figur 1).
2. För tillförsel av läkemedel direkt i ventriklarna använda en distansskiva, så att endast spetsen av kanylen nålen är i kontakt med ventrikeln. Håll kanylen uppochned med en pincett. Tillsätt två droppar cyanoakrylatlim (CA) och införa ett distansskiva.
3. Låt kanylen på en plan yta som är vänd uppåt, så att limmet mellan distansskivan och kanylen torkar.
4. Skär katetern i delar av ca 2,5 cm.
5. För ealm pump, förbereda en minimal av 300-350 pl av lösningen av intresse som det kommer att krävas för att fullständigt fylla pumpen sålunda extrudera all luft inuti den för att förhindra bildning av bubblor i katetern. bubblor kommer att hindra flödet av lösning in i hjärnan.
6. Anslut försiktigt katetern till flödesmoderator.
7. Med användning av en 2 ml spruta som är ansluten till nålen som tillhandahålls av hjärninfusionssats, fylla pumpen tills en liten mängd lösning undgår pumpen, vilket förhindrar luftbubblor inuti den.
8. Fyll försiktigt flödesmoderator och kateter uppmärksamma att förhindra bubblor kvar inne i katetern.
9. Introducera flödesmoderator inuti pumpen.
10. Gång fylldes, noga ansluta kanylen till änden av katetern. Om det konstateras att en bubbla bildas avlägsna kanylen och noggrant fylla katetern med vehikel eller läkemedelslösning och sedan återinföra kanylen.
11. Placera pump i en behållare med steril koksaltlösning och lämna den vid 37 ° CO / N.
12. Före implantering kontrollera igen för bubbelbildning. Om det behövs (ie., Är bubblor observeras) bort kanylen och fylla röret. Anslut kanylen. Detta bör ta endast några mikroliter lösning.

2. Implantation av miniosmotiska Pumpar

Anm: För dessa experiment sövdes djuren med en% isofluran _(30% O2, 70% N ₂ O). Men om detta inte är tillgänglig, är det också möjligt ¹¹ att använda intraperitoneala injektioner av anestesi.

1. Leta reda på djuret i stereotaktisk enheten under narkos och täcker ögonen med en skyddande salva för att förhindra torrhet under narkos. Bekräfta anestesi genom att observera en brist på svar i baktassen när du trycker med fingrarna eller med en pincett. Fortsätt inte förrän djuret är helt sover.
2. Skär pälsen över hanannons antingen med sax eller en rakning maskin. Skär så mycket som möjligt utan att skada huden.
3. Rengör huden med 70% etanol och desinfektionsmedel med antibakteriella och svampmedel egenskaper.
4. Med en skalpell öppna en 1 cm snitt något till höger om mittlinjen och exponera skallen.
5. Rengör skallen med en bomullspinne. Blötlägg det med 70% etanol och passera den över skallen. Detta kommer att leda skallen för att torka.
6. Om skallen har ljus blödning, använd en cauterizer att eliminera eventuella blödningspunkter. Blod hindrar CA torkar ordentligt över benet när kanylen implanteras.
7. Använd stereotaktisk enheten att göra ett märke på den punkten av skallen där kanylen kommer att implanteras. För kammar infusioner på vänster hjärnhalva koordinaterna är -0,2 mm caudal, 0,9 mm lateralt i förhållande till bregma (Figur 2A).
8. Borra försiktigt över skallen gör en 45 ° vinkel; Detta hindrar borren från misstag gå in i brain. Upprepade gånger borra i några sekunder och sedan kontrollera hur djupt hålet är. Sluta borra när skallen har tunnats men ändå inte helt penetreras.
9. Bryt hjärnhinnorna med spetsen på en steril nål tills full tillgång till hjärnan uppnås. Gör så försiktigt för att inte skada hjärnan.
10. Rengör skallen med 70% etanol under användning av en bomullspinne.
11. Införa en rak pincett under huden på djuret i en antero-caudal riktning. Använd pincett för att öppna utrymmet under huden på baksidan av djurets där pumpen kommer att implanteras. Introducera pumpen in i ryggen på djuret som lämnar katetem och kanylen utanför (Figur 2B). Pumpen kommer att förbli i detta läge tills den tas bort och inte behöver någon form av fixering.
12. Placera försiktigt fyra små droppar av lim intill nålen i kanylen.
13. Försiktigt införa nålen genom skallen utan att flytta den i sidled. Håll den i läge för 15-30 sek until kanylen är ordentligt påsatt (fig 2C.1). Väl på plats kommer kanylen att nå 2,5 mm i dorso ventrala riktning om en distansskiva har använts. Om fast ordentligt, kommer kanylen sitta kvar på benet fram till slutet av experimentet.
14. Placera ett finger över fliken avtagbara och sedan använda den andra handen för att skära bort det i halsen med en uppsättning av sax (Figur 2C.2).
15. Stänga såret på huden med en 5-0 sutur och tillsätt några droppar povidon-jodlösning (PVP-I) ovanpå såret för att förhindra infektion (figur 2D).
16. Flytta djuret i en ny bur. Placera inte drivs djur med djur som ännu inte drivits. Håll djur som har implanterats med pumpar ensamma i sina burar under tiden för läkemedelsadministrering.
17. Lämna inte möss utan uppsikt tills de är vakna och har återfått sternala VILA.

3. Pump flytl

Obs: Vanligtvis experimentet kommer att avslutas i slutet av leveranstiden tillåts av pumpen, men det är möjligt att ta bort pumpen för att göra sekundära experiment som en uppföljning till drug delivery. För att göra vägsspår injektioner är det därför nödvändigt att ta bort pumpen.

1. Placera djuret i seterotactic enheten under narkos och täcker ögonen med skyddande salva för att förhindra torrhet under narkos. Bekräfta anestesi genom att observera en brist på svar i baktassen när du trycker med fingrarna eller med en pincett. Fortsätt inte förrän djuret är helt sover.
2. Öppna försiktigt huden genom att skära genom snittet görs samma dag som pump implantering.
3. Med en kirurgisk klämma hålla kanylen och dra ut den. Det bör lätt avlägsnas från skallen. Så skonsam blödning förväntas stoppa den genom att placera en bomullstuss och vänta 1-2 minuter.
4. Dra pumpen ut genom katetern. hanlp det komma ut genom att trycka den, skapar tryck över huden.
5. Stäng såret igen med en 5-0 sutur och tillsätt några droppar PVP-I.
6. Flytta djuret i en ny bur. Gör inte sätta drivs djur med djur som ännu inte drivits. Djur som har genomgått operation kan sättas ihop.
7. Lämna inte möss utan uppsikt tills de är vakna och har återfått sternala VILA.
8. Låt djuret att återhämta sig i 10 dagar innan du fortsätter till vägarna spår injektion.

4. Tryck Tract Tracer Injection vid 45 ° vinklar på Right Motor Cortex

1. Placera djuret på den stereotaktiska anordningen under narkos och täcker ögonen med en skyddande salva för att förhindra torrhet under narkos. Bekräfta anestesi genom att observera en brist på svar i baktassen när du trycker med fingrarna eller med en pincett. Fortsätt inte förrän djuret är helt sover.
2. Öppna sår i huvudet.
3. Cluta skallen med 70% etanol med en bomullspinne.
4. Inför en 5 pl glasspruta (26S ga) på den vertikala hållaren hos anordningen. Se till den nedre änden av glashållaren är exakt vid hållstycket. Sprutan får inte vara för långt under det som då kommer det att bli omöjligt att placera den vid 45 ° från det vertikala läget och utföra injektionen.
5. Orientera sprutan direkt över bregma och leta önskade koordinaterna. För en injektion på motor cortex koordinater: Point # 1: +0,5 mm rostralt och 2,5 mm lateralt i förhållande till bregma. Punkt # 2: 1,34 mm rostral, 2,5 mm lateralt i förhållande till bregma.
6. När koordinaterna har lokaliserats, ange sin position över skallen med en markör med en tunn spets. Gör bara en prick i skallen som överdriven bläck frigivning kan dölja koordinat.
7. Borra försiktigt skallen håller borren vid 45 °. Precis som i steg 2.8, kontrollera skallen ofta så att det inte är helt perforated i syfte att undvika skador på hjärnan orsakad av borren. Använd spetsen på en spruta för att säkerställa att alla ben har avlägsnats.
8. Ladda 600 nl av tarmkanalen spår utspädning i sprutan.
9. Justera den vertikala positionen till 45 ° i riktning mot den högra sidan av djuret. Under mikroskop, placera spetsen på sprutans nål precis framför hålet.
10. Flytta den i vertikal riktning av 1,5 mm. Låt nålen stadigt i denna position i 30 sekunder till 1 minut innan du gör tryck injektioner.
11. Injicera 300 nl av spårämne utspädning i tre steg om 100 nl separerade från varandra med 30 sek. Efter den sista injektionen, lämnar sprutan stadigt för 30 sek till 1 min för att undvika spårämnet att strömma ut ur hjärnan.
12. Dra långsamt ut sprutan, flytta den över det andra hålet och upprepa samma process med de återstående 300 nl som är inne i sprutan.
13. Efter den andra injektionen, ta bort sprutan och fortsätt att stänga wound med en 5-0 sutur och tillsätt några droppar PVP-I.
14. Flytta djuret i en ny bur. Gör inte sätta drivs djur med djur som ännu inte drivits. Djur som har genomgått operation kan sättas ihop. Lämna inte möss utan uppsikt tills de är vakna och har återfått sternala VILA.
15. Låt djuret att återhämta sig i 10 dagar före avlivning.

5. Tract Tracer Observation

1. Söva djuret helt per institutionens riktlinjer. Bekräfta anestesi genom att observera en brist på svar i baktassen när du trycker med fingrarna eller med en pincett. Fortsätt inte förrän djuret är helt sover.
2. Perfundera djuren med 4% paraformaldehyd i PBS (pH 7) under standardprotokoll ^6.
3. Avlägsna hjärnan och post fixera den genom O / N nedsänkning i 4% paraformaldehyd.
4. Cryoprotect hjärnor i sackaros vid 30% fram till hjärnan sjunker. Ta sedan bort hjärnan och frysa dem med 10 sek Immersion i flytande kväve. Håll hjärnor vid -80 ° C tills sektioner produceras.
5. Producera sektioner vid 20 | im för retrograd vägarna spårämne analys och vid 40 | im för anterovägarna spårämne analys genom sektione på en cryostate.

Obs: FG märkta nervceller kan observeras som vita blodkroppar under ultraviolett ljus excitation. BDA detekteras av O / N inkubation med en avidin-biotin-peroxidas komplex och 3,3 'diaminobensidin med tillsats av nickel på 0,4% för att öka kontrasten av fibrerna ^6,7.

Representative Results

Vi har lagt fram djuren till 30 min av mellersta cerebral artärocklusion genom intraluminal sutur metoden inducera en skada i vänster striatum och sedan levereras rhEPO direkt in i hjärnan med hjälp av miniosmotiska pumpar (Figur 1, Figur 3) under 30 dagar med start 3 dagar efter stroke ^6. Figur 4 visar en schematisk bild av kortiko spinalvägarna som spårades efter CB och BDA injektion och det område där spårämnen injicerades. Vi visade en förbättring av greppstyrka och motorisk förmåga (Figur 5) efter 14 och 42 dagar rhEPO leverans respektive. Leverans av BDA i den högra motorn cortex djur som fått en stroke på vänster striatum, visade en ökning av motor fibrer som korsar mittlinjen i nivå med den röda och ansikts kärna (Figur 5), vilket visar framgångsrik färgning av spirande fibrer som en följd av farmakologisk behandling med miniosmotic pumpar. rhEPO behandling också ökat neuronal överlevnad, försenad diffus astrocytos, minskad gliaceller ärrbildning och ökad angiogenes i den studerade perioden ^6. Genom att använda samma teknik för tarmkanalen spårämne injektion kan vi framgångsrikt detektera talamiska kärnor som är anslutna till cortex genom injektion av den retrograda vägarna spårämne FG (figur 6).

Kan observeras Figur 1. Komponenter i miniosmotiska pump som används i detta protokoll. Distans skivor, kanylen och avtagbar flik, kateter, flödes moderator och miniosmotiska pump. Den aspekten av färdigmonterade pumpen kan ses i figur 2A. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

nom-page = "1">
Figur 2. Sammanfattning av pump implantation viktiga punkter. (A) Musen visas som släpps ut på den stereotaktiska enheten med fullt utbyggt miniosmotiska pump bredvid. Pilen indikerar koordinaterna som valts ut för implantering. (B) Pumpen har införts på ryggen av djuret och endast kanylen blir kvar på utsidan. Skallen har redan borrats. (C) aspekt av huvudet efter implantation. (C.1) Kanylen är på plats, men fliken avtagbar har inte sänkts. (C.2) Fliken avtagbar har skurits och sömmar såret kan nu börja. (D) Asterisken visar en nyligen implanterad djur jämfört med ett djur 30 dagar efter implantation (#). När inrymt korrekt, bör såret förbli stängda fram till slutet av proceduren som visas på bilden.ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Nissl-färgning indikerande implantationsstället på cortex. Ett litet snitt kan observeras på en del av den vänstra cortex (pil). Bredden på den penetrerade området är ungefär 50 | im. Det finns inga uppenbara allvarliga vävnadsförändringar baserade på Nissl färgning jämfört med motsvarande kontra området (*). R: Höger halvklotet. L: Vänster halvklotet. Skala bar = 300 um. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Tractspårinsprutningsstrategin som publicerades tidigare av Reitmeier et al. ^6,7. (A) Schematisk indikerar injektionsställen för tarmkanalen spår BDA på kontra motoriska cortex medan CB injicerades i motorn cortex infarkthalvklotet. Fibrer följdes till den röda kärnan (ej visad) och ansikts kärnan (se figur 5). (B) Injektionsstället av anterovägarna tracer BDA bredvid motor cortex visas. Notera den röda pilen indikerar nålen spåret medan den svarta pilen visar några kortikala celler märkta med BDA. Cx: Cortex. CC: Corpus callosum. V: ventrikel. FN: Facial kärna. Skala bar i B = 200 nm. Figur 4A återges med tillstånd ^6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Återvinning av en infarkt hjärna efter leverans av rhEPO. (A) BDA injiceras i contralesional motoriska cortex detekteras sedan i corticobulbara fibrer vid nivån för ansikts kärnan (bregma -5,8 mm till -6,3 mm). Skärningslinjer på varje hemisfär drogs parallellt med mittlinjen och fibrer som passerar varje rad i riktning mot ipsilesional och contralesional halvklotet räknades och uttrycktes som andel av den totala märkta fibrer i kortikospinala vägarna. Erytropoietin ökad fiberkorsningar i riktning mot de contralesional ansikts Nucleus Data är medelvärden + - SD. Data analyserades med envägs ANOVA följt av minst signifikanta skillnader tester, §P <0,05 jämfört med vehikelbehandlade icke-ischemiska möss. (B) Motor beteende visade en förbättring av handgrepp styrka och koordination i turordning stången testet. Data är medelvärden values + - SD. Data analyserades med tvåvägs upprepade mätningar ANOVA, följt av envägs ANOVA / minst signifikanta skillnader tester för varje tidpunkt. §P <0,05 jämfört med pre-ischemisk baslinje; * P <0,05 jämfört med vehikelbehandlade ischemiska möss. Figurerna 5A och B återges med tillstånd ^6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6. målstrukturer uppnås efter injektion av fluorguld (FG). (A) vid injektionsstället av FG bredvid motoriska cortex såsom indikeras i figur 1. Notera den röda pilen indikerar nålen spåret och den vita pilen indikerar några märkta celler i cortex. (B) FG injiceras nära motorncortex detekteras i VPL. Fi: Fimbria. IC: inre kapsel. RT: Thalamic retikulär kärna. VPL: Thalamic ventral posterolateral kärna. Skala bar = 200 nm. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Under många år har forskning kring neurodegenerativa tillstånd som ischemisk stroke eller traumatisk hjärnskada fokuserad på utveckling av neuroprotektiva terapier som syftar till att främja neuronal överlevnad i akut stroke fasen. Den stora majoriteten av läkemedelsterapier som har befunnits vara effektiv i gnagarmodeller misslyckats vid omräkning till kliniken. Orsaker till detta terapeutiska misslyckande inkluderar men är inte begränsade till bristen av fördröjd läkemedelseffekter som resulterar i ihållande funktionell neurologisk återhämtning. Det är därför viktigt att utveckla strategier för att främja hjärnan ombyggnad på längre sikt. Eftersom främjandet av neuronal överlevnad ensam är inte tillräcklig för att möjliggöra en framgångsrik stroke återvinning, som föreslagits av det stora antalet misslyckade neuroprotektion prövningar stimulering av neuronal plasticitet har nyligen erhållit ett stort intresse inom området.

Medel för läkemedelsleverans är intraperitoneal injektion, svans intravaskulär injection, lårbens injektion, enda stereotaktisk injektion av vektorer i hjärnan och fortsatt konstant leverans av miniosmotiska pumpar. Den senare kan inkludera systemisk tillförsel, om pumpen inte har en kanyl, eller som kan organriktad, såsom vi har visat för leverans till hjärnan. Med undantag för miniosmotiska pumpar och användningen av virala vektorer, kommer alla andra strategier inducerar fluktuerande läkemedelskoncentrationer. För långtidsförsök blir det därför nödvändigt att lägga fram djuret till stressen att ta emot frekventa injektioner. BBB innebär ett viktigt hinder för hjärnans upptag av proteiner eller läkemedel från blodet, vilket resulterar i behov av stora protein eller läkemedelsdoser för att uppnå terapeutiska koncentrationer i hjärnan. Till exempel Pellegrini et al. (2013) ⁵ levereras rhEPO genom intraperitoneal injektion i en dos motsvarande 75 IE / dag för ett djur av 30 g (750 IE / dag för en 300 g råtta). I jämförelse, den riktade leveransen av rhEpo till hjärnan tillät oss att använda en mycket lägre dos av bara 10 IU / dag i vår studie för en lyckad stroke återvinning, som gjorde det möjligt för oss att uppnå återhämtning över ett stort tidsskala med en fast ränta på 0,25 ul / h.

I detta arbete har vi visat metoden för implantering av minipumpar med en kanyl ansluten till skallen för att leverera plasticiteten gynnande proteinet rhEPO direkt in i ventrikeln, på så sätt kringgå BBB. Genom denna metod, rhEPO främjade neurologisk återhämtning i ett antal olika sätt, inklusive reduktion av infarktstorlek, reduktion av gliaceller ärrbildning och induktion av angiogenes. rhEPO främjade också neuronal överlevnad och ökad prognoser från contralesional motoriska cortex mot denerverade röda kärnan och ansikts kärnor. Groning av fibrerna avslöjades genom injektion av anterovägarna spår BDA i motoriska cortex (figurerna 4A och 5A). En funktionell korrelat till groning av fibrerna är provided genom förbättringen av motorik (figur 5B). Dessutom har vi visat att kan tillämpat samma tillvägagångssätt för tarmkanalen spår injektion för att avslöja thalamo-kortikala förbindelser med injektion av bakåtsträvande vägarna spår FG (figur 6B).

Vid framställningen av den miniosmotiska pump, är det viktigt att ta hänsyn till målpunkten och användning av distanser. Vi använder ett distanselement för att minska längden på nålen genom att 0,5 mm som på detta sätt den yttersta spetsen av nålen är i kontakt med kammaren på de angivna koordinaterna (-0,2 mm caudal, 0,9 mm lateralt, 2,5 mm dorso ventrala, med avseende på bregma). Men om djupare strukturer är målet för forskning, då kommer att behövas några distanser. Likaså om en mer extern utlämningsställe önskas (dvs., Cortex), sedan flera distans skivor kommer att bli nödvändiga. Katetern måste vara tillräckligt lång så att pumpen inte är för nära huvudet, eftersom det kommer att hindra rörelser av mouse, men inte heller alltför länge en gång implanterats alltför lång tid kan leda till att katetern att böjas, vilket ökar risken för kanyl avlägsnande av den naturliga rörelsen hos musen. En sektion av 2 cm av katetern ger mycket goda resultat i form av rörlighet och stabilitet av implantatet (fig 1 och 2). Inkubation av pumpen vid 37 ° CO / N gör att pumpen omedelbart börja pumpa läkemedlet in i hjärnan vid tidpunkten för implantering.

I miniosmotiska pump implantationen är det kritiskt att säkerställa att skallen är ordentligt torkas innan implantering kanylen. Vanligtvis rengöring med 70% etanol kommer att framkalla benet för att torka, men om kontinuerlig blödning hittas, röra skallen försiktigt med en cauterizer kommer att helt torka. Det är kritiskt för att säkerställa att införandet av nålen är så vertikalt och långsam som möjligt. Väl på plats, och medan limmet torkar, placera fingret på toppen av kanylen hindrar den från att röra sig i sidled over skallen. Särskild försiktighet bör ägnas åt såret och placeringen av kanylen. Det är viktigt att snittet inte utförs exakt över mittlinjen av skallen men något till den högra sidan. Vid stängning av såret, om snittet gjordes vid mittlinjen, kommer huden att vara överbelastade, vilket ökar risken för lindad öppning. Making snittet lite åt sidan kommer att tillåta suturen punkterna att vara borta från den högsta delen av kanylen. Som en följd kommer det att finnas mindre spänning på suturen poäng och såret kommer läka ordentligt. Djuren bör bur ensam och kontrolleras varje dag, speciellt under de första 10-15 dagar efter implantation. Vid sårruptur, sår måste stängas så snart som möjligt. Om kanylen avlägsnas eller ett djur påvisar en infektion, har försöket att avslutas. Re-implantation av kanylen rekommenderas inte. Det är mycket viktigt för en lyckad implantation att använda tillräckliga mängder av vävnads annonshesive (inte för mycket!) som det bryts ned benet och ökar risken för kanyl borttagning. Men med hjälp av för lite lim kommer inte heller att hålla kanylen fäst till benet. De miniosmotiska pumpar kan bära läkemedel lösta i ett stort antal olika ämnen, som är den enda begränsningen till detta att lösningsmedlet är biokompatibla. Dessutom, med tanke på att volymen är liten (200 ^ il) en måste avgöra huruvida den koncentration som krävs för experimentet är lämplig och kommer inte att orsaka utfällning inuti pumpen.

Tract spårning med antingen antero eller bakåtsträvande spårämnen är en mycket väl etablerad teknik för att studera hjärnans anslutning och plasticitet. Man måste ges till användning stereotaktisk ramar när du injicerar för att säkerställa exakthet på inriktning på hjärnans område man vill studera (det vill säga, för att förhindra injektion i corpus callosum vid injektion cortex).

För alla kirurgiska ingrepp och för att minska smärta ochinflammation, bör djuren behandlas med 0,1 mg / kg Buprenorfin före interventionen och Caprofen vid 4 mg / kg en gång dagligen under tre dagar efter insatsen.

Sammanfattningsvis ger detta tillvägagångssätt en riktig verktyg för att studera effekten av proteiner eller farmakologiska föreningar i den skadade hjärnan, vilket motsvarar en metod som är väl lämpad för studier av hjärnans plasticitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alzet miniosmotic pump. Model 2004.	Alzet	000298	Drug container
Brain infusion kit 3 1-3 mm	Alzet	0008851	Drug brain delivery system
Loctite  454 Prism gel	Loctite	45404	Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull
75N glass syringe	Hamilton	87900/00	Injection of tract tracers
Biotin Dextran Amine (10,000 MW)	Molecular probes	N-7167	Anterograde tract tracer
Fluorogold	Fluorochrome, LLC.		Retrograde tract tracer
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection.