Protocol
وأجريت جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للقانون الاسترالي من الممارسة لرعاية واستخدام الحيوانات لأغراض علمية والمبادئ التوجيهية لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية، وتمت الموافقة من قبل: بيان الأخلاق لجنة أخلاقيات الحيوان من جامعة ماكواري.
1. VEP الكهربائي زرع
- تخدير الحيوانات مع حقن داخل الصفاق من الكيتامين (75 ملغ / كلغ) وmedetomidine (0.5 ملغ / كلغ).
ملاحظة: بعد التخدير، ومراقبة ردود الفعل انسحاب (اختبار قرصة، منعكسة القرنية وجفني، الخ) وغيابها مؤشرا لبدء عملية جراحية. باستمرار مراقبة الحيوانات في جميع أنحاء الجراحة وإدارة المخدرات مخدر إضافية (10٪ من جرعة الكيتامين الأولية في أعلى متابعة) في حالة وجود ردود الفعل. وتستخدم الجرذان الكبار (> 12 أسبوعا) في التجارب. - حلق الجلد من منطقة العمليات الجراحية.وضع الحيوان على وسادة ارتفاع درجة حرارة (37 درجة مئوية) للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة. تحضير الجلد من خلال التطبيق الموضعي للبوفيدون اليود. تطبيق اللف الجراحي. تطبيق مرهم موضعي لمنع جفاف القرنية تحت التخدير العام. الحفاظ على عقامة باستخدام أدوات معقمة.
- جعل شق الجلد الطولي في خط الوسط من جلد الرأس. مسح النسيج الضام لتحقيق التعرض جيدة من الجمجمة.
- بعناية، حفر ثقوب لدغ صغيرة يدويا باستخدام الحفر اليد الصغيرة في 7 مم وراء bregma و 3 مم الوحشي على خط الوسط.
- أقطاب المسمار الزرع من خلال الجمجمة في القشرة (منطقة 17)، اختراق القشرة على عمق حوالي 0.5 مم. زرع قطب كهربائي المسمار إشارة على خط الوسط 3 مم منقاري إلى bregma. تطبيق الاسمنت الأسنان ليغلف وإصلاح مسامير (غير مطلوب دائما).
- خياطة الجلد من الرأس، وإدارة مرهم مضاد حيوي على الجلد والسماح للحيوان لريكوالنسخة من التخدير على لوحة ظاهرة الاحتباس.
ملاحظة: بدلا من ذلك، الأقطاب الكهربائية يمكن تركها مكشوفة، لذلك لا يحتاج أن الجلد لإعادة فتح في كل تسجيل. فور وقف عملية جراحية ولكن قبل الاستعادة مخدر، وإدارة الدواء غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (NSAID) (إن لم تكن تدار قبل الجراحة) أو مسكن أفيوني. مراقبة الحيوانات باستمرار حتى الشفاء التام من التخدير والعيادات الخارجية بالكامل. - تسمح على الأقل 1 أسبوع للحيوانات للتعافي من عملية جراحية قبل التسجيل VEP.
2. حقن العصب البصري
- تخدير الحيوان، وإعداد البشرة وتطبيق اللف على النحو الوارد أعلاه (1.1 و 1.2).
- جعل 1- 1.5 سم شق في الجلد فوق المدار من العين تم اختيارها عشوائيا. فتح الأنسجة تحت الجلد لتصل إلى تجويف المداري باستخدام مقص القزحية الجميلة. فتح الملتحمة والأمامي كبسولة تينون تحت المجهر التشغيل.
- التراجع عن المقلةالعضلات والغدد الدمعية intraobital لفضح ما يقرب من 3 ملم طول العصب البصري. فتح الجافية والمواد العنكبوتية طبقات حول العصب البصري طوليا باستخدام شفرة العيون.
- إدراج ماصة الزجاج في العصب البصري على مسافة 2 مم الخلفي إلى العالم. يتم إرفاق micropipette الزجاج لحقنة هاملتون.
- حقن 1٪ ليزوليسيتين (0،4-1،0 ميكرولتر، مع 0.02٪ الأزرق ايفان والتي لا يكون لها آثار على المايلين) ببطء في العصب تقريبا على مدى فترة 30 ثانية.
- خياطة شق الجلد. تطبيق مرهم مضاد حيوي لمنع العدوى. ويمكن تقديم عيون زميل والضوابط الداخلية للتسجيلات الكهربية.
- وضع الحيوانات على لوحة ظاهرة الاحتباس للتعافي من التخدير.
3. VEP تسجيل
- تخدير الحيوان وإعداد الجلد مثل 1.1 و 1.2.
ملاحظة: أقل جرعة من التخدير يمكن استخدامها لريكو الكهربيةrding (الكيتامين 40 ملغ / كغ وmedetomidine 0.25 ملغ / كلغ). - وضع فأر في غرفة مظلمة واتركه على التكيف مع الظلام ل5-30 دقيقة. في بعض الحالات الفئران يمكن أن يكون على التوالي الظلام O تكييفها / N للالرؤية الليلية أو ضوء تكييفها للتسجيلات ضيائية VEP 8.
- الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 ± 0.5 ° C من قبل النظام بطانية homoeothermic مع لجنة التحقيق مقياس الحرارة المستقيم.
- تمدد التلاميذ مع 1.0٪ قطرات تروبيكاميد العين. فتح الجلد فوق الجمجمة للوصول إلى أقطاب المسمار في الموقع الطبيعي وضعت مسبقا.
- ربط المسمار على القشرة البصرية المقابل للعين حفز والمسمار إشارة إلى مكبر للصوت. إدراج القطب الإبرة في ذيل مثل الأرض. قياس والحفاظ على مقاومة الكهربائي أقل من 5 أوم.
- وضع مشجعا مصغرة فريق Ganzfeld مباشرة على الجلد حول الجفون لتوفير العين متفوقة العزلة 7. إضاءة للمشجعا تحتاج إلى معايرة مسبقاقبل مضواء.
- تقديم تحفيز ضوئي من خلال ومضات ضوء 100 مرة بتردد 1 هرتز، مع إعدادات التصفية الفرقة تمرير المنخفضة والعالية من 1 و 100 هرتز، على التوالي. معدل أخذ العينات إشارة هو في 5 كيلو هرتز.
ملاحظة: يجب أخذ عينات إشارات على الأقل في حوالي 250-300 هرتز للتأكد من أن أكثر من اثنين من العينات التي تم جمعها خلال كل دورة. - خياطة الجلد إلى الوراء والحفاظ على الحيوانات على لوحة ظاهرة الاحتباس للتعافي من التخدير. تسجيل يمكن تسجيل مرارا وتكرارا على الحيوانات الفردية لرصد التغيرات الوظيفية على مدى فترة من الزمن.
- في نهاية المرحلة، إدارة حقن جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتون (100 ملغ / كغ، والملكية الفكرية) إلى الموت ببطء الحيوان. تأكيد القتل الرحيم التي كتبها سكتة قلبية، توقف التنفس وانخفاض في درجة حرارة الجسم.
4. إعداد الأنسجة والأنسجة
- إزالة الأعصاب البصرية من الحيوانات الموت الرحيم تحت المجهر وإصلاح الأنسجة في 1٪ بارافورمالدهيد O / N. <لى> غسل الأنسجة تماما باستخدام محلول ملحي. علاج الأنسجة في معالج النسيج الآلي وتغرس في البارافين. أقسام قطع (5-10 ميكرون) باستخدام مشراح الدوارة.
- احتضان المقاطع في 0.1٪ محلول أزرق سريع مثل Luxol (في 95٪ من الإيثانول) O / N عند 56 ° C. تمييز المقاطع في 0.05٪ كربونات الليثيوم لمدة 30 ثانية ثم الايثانول 70٪ لمدة 30 ثانية أخرى. أخيرا، مباين في 0.1٪ محلول الكريزيل البنفسجي لمدة 30 ثانية قبل تركيب الأبواب. استخدام تلطيخ الأزرق سريع لتحديد المايلين في العصب البصري 5.
ملاحظة: للحصول على دراسة المناعية، وإصلاح الأنسجة في 1٪ امتصاص العرق، ويغسل بمحلول ملحي واحتضان مع 30٪ سكروز O / N. الأنسجة تغرس في أكتوبر التضمين المتوسطة وتجعل cryosections باستخدام ناظم البرد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر آثار استنساخه VEP داخل الدورات في الشكل 1 و تأخير كبير في الكمون N1 يمكن أن ينظر بعد حقن العصب البصري. ويمكن ملاحظة آفات العصب البصري جزئية من إزالة الميالين على أقسام النسيجية باستخدام Luxol تلطيخ الأزرق سريع 5 الشكل 2 يوضح مقطع تمثيلي مع آفة عديمة الميلين التنسيق صغيرة في وسط العصب البصري. لاحظ أن المقطع العرضي لا تمثل الحجم الكلي للآفة. ويمكن قياس منطقة عديمة الميلين على كل شريحة على التوالي من العصب للاستدلال على حجم الآفة باستخدام إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد. لقد أثبتنا وجود علاقة قوية بين تأخير الكمون وحجم الآفة باستخدام هذا النموذج في دراساتنا السابقة، وكان هناك أي تأخير الكمون VEP في الضوابط حقن محلول ملحي 5.
ويعتقد أن المكونات VEP الأولى بعد فلاش إضاءة أكثر استقرارا 7 5. وبالتالي، فإننا نوصي بأن N1 الكمون وينبغي أن تستخدم لتحليل البيانات ورصد VEP الطولي في تقييم أثر العلاجات remyelinating. اتساع VEP، على الرغم من أن أكثر المتغيرات بالمقارنة مع الكمون، هو أكثر دلالة على وظيفة من محاور عصبية في العصب البصري 6. ويمكن اعتبار التوسع القائم الكهربائي لتحليل السعة 9.
الشكل 1. VEP تأخير بعد حقن العصب البصري. الممثل VEP يتتبع من الفئران الفردية قبل و2 أيام بعد microinjection العصب البصري (0.8 ميكرولتر ليزوليسيتين). تكررت التسجيلات VEP على كل يوم (آثار البينية الدورات هي عرضن في نفس اللون) للتدليل على استنساخ هذا البروتوكول تسجيل VEP. (العمودي شريط النطاق: 10 μV؛ شريط النطاق الأفقي: 10 ميللي ثانية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. إزالة الميالين في العصب البصري. الممثل المقطع العرضي للعصب البصري من الفئران بعد ليزوليسيتين microinjection. اتسخت المكون المايلين الأزرق باستخدام luxol الأزرق سريع. ويمكن الاطلاع على آفة التنسيق صغيرة من إزالة الميالين في وسط هذا الباب. ويمكن قياس منطقة عديمة الميلين في مسلسل طولية المقاطع العرضية لتقدير حجم الآفة في نطاق ثلاثي الأبعاد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل معهد بحوث أمراض العيون أستراليا (ORIA). نشكر الأستاذ Algis Vingrys والدكتور بانغ بوي، جامعة ملبورن، لمساعدتنا في البداية لتطوير تقنية تسجيل VEP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 100 mg/ml (Ketamil) | Troy Laboratories | AC 116 | |
| Medetomidine 1 mg/ml (Domitor) | Pfizer | sc-204073 | |
| Tropicamide 1.0% (Mydriacyl) | Alcon | sc-202371 | |
| Homoeothermic blanket system | Harvard Apparatus | NC9203819 | |
| Impedance meter | Grass | F-EZM5 | |
| Screw electrodes | Micro Fasteners | M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S | |
| Subdermal needle electrodes | Grass | F-E3M-72 | |
| Rapid Repair | DeguDent GmbH | ||
| Light-emitting diode | Nichia | NSPG300A | |
| Bioamplifier | CWE, Inc. | BMA-400 | |
| CED system | Cambridge Electronic Design, Ltd. | Power1401 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 87930 | |
| Lysolecithin | Sigma | L4129 | |
| Evan’s blue | Sigma | E2129 |
References
- Balcer, L. J. Clinical practice. Optic neuritis. N Engl J Med. 354 (12), 1273-1280 (2006).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis as a neuronal disease. Waxman, S. G. , Elsevier. 153-164 (2005).
- Fahle, M., Bach, M. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. Heckenlively, J., Arden, G. , MIT Press. 207-234 (2006).
- Halliday, A. M., McDonald, W. I., Mushin, J. Delayed visual evoked response in optic neuritis. Lancet. 1, 982-985 (1972).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Latency delay of visual evoked potential is a real measurement of demyelination in a rat model of optic neuritis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6911-6918 (2011).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Gupta, V. K., Graham, S. L. Axonal loss in a rat model of optic neuritis is closely correlated with visual evoked potential amplitudes using electroencephalogram based scaling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3662 (2012).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Doc Ophthalmol. 123 (2), 109-119 (2011).
- Heiduschka, P., Schraermeyer, U. Comparison of visual function in pigmented and albino rats by electroretinography and visual evoked potentials. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (11), 1559-1573 (2008).
- You, Y., Thie, J., Klistorner, A., Gupta, V. K., Graham, S. L. Normalization of visual evoked potentials using underlying electroencephalogram levels improves amplitude reproducibility in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1473-1478 (2012).
- Levkovitch-Verbin, H. Animal models of optic nerve diseases. Eye (Lond). 18 (11), 1066-1074 (2004).
- Henry, K. R., Rhoades, R. W. Relation of albinism and drugs to the visual evoked potential of the mouse). J Comp Physiol Psychol. 92 (2), 271-279 (1978).
- Murrell, J. C., Waters, D., Johnson, C. B. Comparative effects of halothane, isoflurane, sevoflurane and desflurane on the electroencephalogram of the rat. Lab Anim. 42 (2), 161-170 (2008).
- Makela, K., Hartikainen, K., Rorarius, M., Jantti, V. Suppression of F-VEP during isoflurane-induced EEG suppression. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 100 (3), 269-272 (1996).
- Boyes, W. K., Padilla, S., Dyer, R. S. Body temperature-dependent and independent actions of chlordimeform on visual evoked potentials and axonal transport in optic system of rat. Neuropharmacology. 24 (8), 743-749 (1985).
- Hetzler, B. E., Boyes, W. K., Creason, J. P., Dyer, R. S. Temperature-dependent changes in visual evoked potentials of rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 70 (2), 137-154 (1988).
- Mitchell, J. The effects of lysolecithin on non-myelinated axons in vitro. Acta Neuropathol. 58 (4), 243-248 (1982).
- Meyer, R., et al. Acute neuronal apoptosis in a rat model of multiple sclerosis. J Neurosci. 21 (16), 6214-6220 (2001).
- Lachapelle, F., et al. Failure of remyelination in the nonhuman primate optic nerve. Brain Pathol. 15 (3), 198-207 (2005).
