Summary
ארגון תא של עצמות craniofacial כבר שיערו ארוך אבל אף פעם לא דמיין ישירות. תיוג תא Multi-רפאים ובשידור חי vivo הדמיה מאפשרת הדמיה של התנהגות הדינמית של תאים בלסת תחתונה דג הזברה. כאן, אנו פירוט הפרוטוקול לתמרן Zebrabow דג מהונדס וישירות להתבונן עיבור תא ושינויים מורפולוגיים של כונדרוציטים בסחוס של מקל.
Abstract
פיתוח של מבני craniofacial חוליות דורש תיאום מדויק של נדידת תאים, התפשטות, הדבקה ובידול. דפוסים של סחוס של מקל, נגזר קשת בלוע ראשון, כרוך בהגירה של תאי רכס עצבי גולגולתי (CNC) ומחיצות, ההפצה המתקדמת וארגון של כונדרוציטים מובחנים. מספר מחקרים שתוארו הגירת CNC במהלך המורפוגנזה לסת תחתונה, אבל את הפרטים של איך להשיג כונדרוציטים ארגון בצמיחה וההרחבה של הסחוס של מקל עדיין לא ברורים. Sox10 מוגבל ורקומבינציה בתיווך recombinase Cre המושרית כימי יוצרת תמורות של חלבונים שונים ניאון (RFP, YFP וCFP), ובכך ליצור תיוג רב-רפאים של תאי אב וצאצאיהם, המשקפת אוכלוסייה משובט שונה. באמצעות צילום הזמן לשגות confocal, ניתן לצפות בכונדרוציטים behaviאו במהלך הפיתוח של הסחוס של דג הזברה מקל.
תיוג תא Multispectral מאפשר למדענים להפגין סיומת של כונדרוציטים של מקל. במהלך שלב הארכה של סחוס של מקל, שבישר הלסת התחתונה, כונדרוציטים intercalate לבצע הרחבה כפי שהם המחסנית בשורה שכבתית תא בודד מאורגנת. כישלון של תהליך intercalating מאורגן זה לתווך הארכת תא מספק הסבר מכניסטי הסלולרי ללסת תחתונה היפופלסטי שאנו רואים במומי לסת.
Introduction
פיתוח Craniofacial דורש אינטראקציות מולקולריות, תאיות ורקמות מורכבות לנהוג התפשטות תאים, הגירה ובידול 1,2, 3. תהליך מוסדר היטב ומורכב זה כפוף להפרעות גנטיות וסביבתיות, כגון שעיוותי craniofacial הן בין המומים הלידה הנפוצים ביותר 1-9. בעוד התערבות כירורגית להישאר התווך של טיפול בחריגות craniofacial, הבנת בסיס הפיתוח הוא חיוני לחדש טיפולים עתידיים. לכן, לימוד המורפוגנזה והמנגנונים בהתכנסות והרחבה והאינטגרציה תא מספק תובנות רומן להיווצרות של שלד craniofacial 1.
להגר רכס העצבי גולגולתי ולאכלס את קשת בלוע הראשונה, תהליכי לסת אז טופס לזווג שמרחיבים לטופס סחוס של מקל, שבישר הלסת התחתונה. o המורפוגנזהF הסחוס של מקל דורש ארגון הכונדרוציטים באמצעות התפשטות כיוונית, קיטוב התא ו1,10 בידול. עם זאת, המורכבות של ארגון הכונדרוציטים בצמיחה וההרחבה של הסחוס של מקל עדיין לא ברורות. ההבנה דינמית התנהגות תא היא קריטית להבנת מומים מולדים המשפיעים על גודל לסת, כגון פנוטיפים לסת תחתונה היפופלסטי 11.
עוברי דג הזברה מציעים יתרונות רבים התפתחותיים וגנטיים למחקר מפורט של המורפוגנזה הסחוס של מקל. נְהִילוּת הגנטית, שקיפות, vivo לשעבר והתפתחות מהירה הן יתרונות חזקים הלוואות זה טוב להתבוננות בתנועת תא וארגון על ידי הדמיה חיה 6. שימוש בכלי התחקות שושלת, כגון sox10: קו מהונדס קאאד, אנו ואחרים התוו את מקורות רכס העצביים של שלד craniofacial העוברי 1,5. Using sox10: ERT2-Cre עם UBI: קו מהונדס Zebrabow-M, ניתן כיום לחקור את הפרטים של תנועות סלולריות במהלך פיתוח craniofacial. Zebrabow-M, הוא קו מהונדס מהונדס עם אמרגן היוביקוויטין נהיגה הביטוי של fluorophores שונה, כל אחד מוקף אתרי קס 8. Fluorophore ברירת מחדל Zebrabow-M הוא אדום, להביע RFP. לאחר האינדוקציה של ביטוי Cre, Zebrabow-M לבנות משתלבת מחדש ותאים להביע שילוב של fluorophores שונה (RFP, CFP ו YFP) יצירת ביטוי רב-רפאים בעובר. כל תאי הבת שלחלק מהתאים שכותרתו לאחר אירוע רקומבינציה לאחר מכן כותרת clonally, כך שאוכלוסיות התאים שנובעות מאבות סמיכותם שונים מסומנות clonally. על ידי תיוג תא שיבוט זה, התפשטות תאים ונדידה עם רזולוציה משובט יכולים להיות אחרי (איור 1 ו -2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הכללית של מסצ'וסטס ועדת בית חולים מוסדי טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) אישרה את כל הנהלים תחת מספר # פרוטוקול 2010N000106. זה עומד באגודה להערכה והסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים בינלאומי (AAALAC) הנחיות.
1. ריאגנטים וחומרי הכנה
- הכן 1 ליטר של 50X בינוני E3 עובר (ראה טבלת 1) ולהכין 1 ליטר של מדיום עובר 1X E3 (ראה טבלה 2).
- הכן בינוני עובר E3 עם N-Phenylthiourea (PTU) על ידי הוספת 30 מ"ג של PTU לL 1 של 1X E3. O מערבבים / N כדי להבטיח שPTU נמס לגמרי. אחסן בRT.
- כדי להכין פתרון pronase, לדלל 150 μl של pronase (0.5 מ"ג / מיליליטר) עם 15 מיליליטר של 1X E3. סכום זה מספיק לצלחת פטרי 1. להשתמש באופן מיידי.
- הכן פתרון Methylcellulose.
- הכן פתרון E3-tricaine על ידי ערבוב 75 מיליליטר של tricaine 0.2% עם 25 מיליליטרשל 1X E3. מרתיחים 3 גרם של methylcellulose ב -75 מיליליטר של תמיסת E3-tricaine.
- מרכיבים את הנפח הסופי 100 מיליליטר עם פתרון E3-tricaine. פתרון methylcellulose הסופי הוא צמיג ואטום עם גוון צהבהב. אחסון: RT מוגן מפני האור.
- מניית טמוקסיפן ופתרון אינדוקציה
- הכן 5 מ"מ פתרון מניות טמוקסיפן ידי ההמסה ב 100% אתנול-hydroxytamoxifen 4. מניית החנות ב -80 ° C.
- הכן דילול טרי של טמוקסיפן בריכוז הרצון ב1X E3 להשיג פתרון האינדוקציה. זהירות! יש להתייעץ MSDS לפני השימוש.
- הכן 1 ליטר של tricaine 0.2% בהתאם לטבלה 3.
- להשיג שקופיות confocal. דבק ארבעה coverglass (18 x 18) יחד כדי ליצור בלוק אז במקום 2 בלוקים על coverglass 24 x 60 סנטימטר זה מזה 2 כדי לאפשר הרכבה של העובר באמצע.
2. העובר הכנה
- קווים מהונדסים.
- sox10: ERT2-Cre
הערה: צור וקטור מיקוד pDestTol2- sox10: ERT2-Cre באמצעות שיטות שיבוט מולקולרי סטנדרטיים ומסחרית שהושגה רקומבינציה שיבוט טכנולוגיה.- לשלב 5 'שיבוט כניסה (pENTR5'- sox10p) המכיל 7.2Kb של אמרגן sox10, שיבוט אמצע Gateway (PME-ERT2-Cre), ו3' שיבוט כניסה (pENTR3'-פולה) בתגובת LR עם יעד עדשה וקטור pDestTol2- α-crystallin: YFP.
- לטהר מבנה pDestTol2- sox10: ERT2-Cre. שיתוף להזריק המבנה מטוהר (100 ng / μl) עם mRNA Tol2 transposase (50 ng / μl) לעוברי WT (F0) בשלב תא אחד.
- מייסדי מבוגרים F0 מסך לשידור נבט-קו המבוססים על הקרינה צהובה חזקה בעוברי F1.
- sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M
- Outcross Zebrabow-Mקו (2.1.1) עם sox10: הקו המהונדס ERT2-Cre.
- עוברים בחרו מציגים ביטוי חזק בכל מקום RFP וסמן עדשת YFP ולגדל אותם עד מבוגרים.
אוסף 3. העובר
- הקים כמה זוגות sox10: ERT2-Cre; דג הזברה מהונדס Zebrabow-M 17:00-06:00 ביום 1.
- למחרת, למשוך את החוצצים בבוקר ולאסוף את הביצים בשעתי הצהריים.
- העבר אותם לפטרי מנות ולהוסיף 15 מיליליטר של פתרון pronase לdechorionate את העוברים.
- דגירה עובר ל1 עד 5 דקות, עד כ -60% מהעוברים כבר dechorionated. לעצור את התגובה באמצעות אחסון פתרון pronase ולשטוף את העוברים 3-4 פעמים עם מדיום E3 טרי.
- דגירה עובר dechorionated בE3 ב RT O / N ולתת להם לפתח כדי להגיע לשלב 10 somites. דגירה 50-60 עוברים לכל מצמד, כדי למנוע צמיחה התפתחותיים שונה. 4. טיפול
- בדוק שלב ההתפתחותי של העוברים תחת מיקרוסקופ שדה אור כדי להבטיח שהם נמצאים בשלב 10 somites.
- באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן אדום חלבון פלואורסצנטי (RFP), לבודד את העוברים בצבע אדומים הבוהקים.
- המשך לאינדוקציה של Cre-רקומבינציה על ידי הוספת 10 מיקרומטר של פתרון hydroxytamoxifen לצלחת פטרי ודוגרים עוברים המבודדים על 28.5 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
- למזוג את פתרון טמוקסיפן ולשטוף את העוברים כמה פעמים עם E3.
זהירות! השלך את פתרון טמוקסיפן במכל פסולת ביולוגי מיוחד. - דגירה עובר על 28.5 מעלות CO / N.
- כאשר הם עובר כ שלב somites 28-29 (כ 24 שעות לאחר ההפריה), דגירה את העוברים על 28.5 מעלות צלזיוס בלהלן פתרון E3-PTU.
הערה: PTU הוא כאן נהג לעכב היווצרות melanophores בעוברים המתפתחים. טיפול זה הוא הכרחי ללמנוע את עיוות האות של הקרינה על ידי melanophores האוטומטי ניאון. - דגירה עובר על 28.5 מעלות צלזיוס
- כדי להמחיש את מבני craniofacial מפותחים, בחר את העוברים על 4 ימים לאחר הפריה לעוצמת האות האדומה וחיוביות Cre סמן ביטוי (צהובה ברשתית).
- להרדים את העוברים עם פתרון E3 / 0.015 tricaine%. הרדמה הוא אישר כאשר אין תנועות פעילים או פעילות סנפיר הוא ציינה כאשר בעדינות דוחפות את העובר.
- העבר את העובר שנבחר להדמיה לצלחת פטרי המכילה ירידה של methylcellulose ועדינות לחנוט את העובר עם methylcellulose.
- בשקופית confocal נקייה, במקום ירידה של methylcellulose הטרי והר העובר שלך בירידה באמצעות קצה microloader. עובר העמדה dorsally לוקח זהירות לא לגעתהעובר ישירות.
- מכסה את העובר רכוב עם coverslip 25 x 25 ולהתאים את המיקום של העובר במידת צורך על ידי מניפולציה של coverslip.
- העובר מוכן לתמונה עכשיו.
- השתמש במטרת 20x היבשה העדשה (הצמצם מספרי 0.75; גודל חריר 2.0 מיקרומטר) להתמקדות העובר.
- לחץ על הכפתור L100 על המיקרוסקופ ובחר את הערוצים בתוכנה.
- בחר confocal התקנת לחצן ולחץ על 'אוטומטי' ובחר את הערוצים הבאים לפני סגירת החלון: CH1: CFP, CH2: GFP, CH3: RFP או mCherry
- הפעל CH2 וCH3 לפני לחיצה על הכפתור 'להסיר את הנעילה'. לחץ על 'הצגה' כדי להתחיל בסריקה.
- להתמקד במבנה של עניין, שנעשה על ידי המיטב מתחיל עם מסגרת ½ / sec ומתח גבוה (HV) 150 ולאחר מכן לשנות את ההגדרות בהתאם עד איכות התמונה הרצויה היא AChieved. RFP יהיה בהיר יותר מצבע אחר, ולכן להתאים את HV. לשנות את מיקום Z למצוא שני YFP ותאים חיוביים RFP.
- ברגע שנקבע עם ההגדרות, ללכוד את התמונה של העובר שלך. להציל את התמונה שלך בפורמט פורמט תוכנת הדמיה וTIFF confocal לעיבוד תמונה בכל ערוץ מפוצל.
- בשלב הבא, להדמיה CFP, לכבות את CH2 וCH3 ולהפעיל CH1. להתאים מחדש את ההגדרות כמו בשלב 5 מבלי לשנות את אזור המיקוד.
הערה: CFP יכול להיות ממש קשה לזהות בגלל אות רקע בערוץ כחול שניתן לעקוף באמצעות התאמת גודל חריר. גודל חריר גדול יותר מאפשר זיהוי טוב יותר של הקרינה על ידי הקטנת יחס רעש אות / רקע. עם זאת, חריר גדול יותר יפחית השפעת confocal, להתפשר על איכות תמונה. לכן, התאמה מדוקדקת של ההגדרות נדרש כדי להשיג את איכות תמונה הרצויה ועוצמה. - ללכוד את התמונה ולשמור אותו בפורמט שניהם (תוכנת confocal וTIFF) לעיבוד תמונה. אז יכולות להיות מעובד תמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה נפוצה למזג שכבות ולשפר את הגדרות צבע כפי שתוארו על ידי פאן ועמיתים 8.
בחירת 5. העובר
6. הרכבה העובר בMethycellulose
7. ניתוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדמיה סחוס מסורתית על ידי כתמים כחולים הר Alcian כל כבר לא יסולא בפז בהתבוננות הסחוס של מקל פיתוח ונפוץ לדמיין (איור 1 א) הסלולרי סופי ארגון 12. כדי לנתח נוסף כונדרוציטים פיתוח שעות נוספות, התחקות שושלת באמצעות sox10: קווים מהונדסים קאאד אפשרו לנו ללמוד נדידת תאים, התכנסות והרחבה בעוברים חיים 2,12 (איור 1). עם זאת, הארגון של כונדרוציטים במבנה שלד craniofacial נשאר הבין היטב. על ידי הדמיה לחיות, הקו המהונדס Zebrabow-M הוא מסוגל לחשוף את תהליך העיבור הכונדרוציטים וההתארכות שמתווך את ההארכה וצמיחה של הסחוס של מקל (איור 1 ג-ז).
בפרוטוקול זה, UBI: Zebrabow-M; sox10: טופלו עוברי ERT2-Cre עם טמוקסיפן ב -10 somites וchondrocytes בלסת התחתונה היו דמיינו בנקודות זמן שונות במהלך פיתוח (בין 3 ל -5 DPF DPF). הלסת התחתונה היא בתמונה הטובה ביותר ventrally לאפשר נוף ברור של הסחוס של מקל ללא ההתערבות של dorsally הצלחת וneurocranium כִּברָתִי. צבעים ביציבות נשמרים וירשו לאפשר שושלת קלה התחקות ומיפוי גורל תאי CNCC כפי שצוין על ידי החיצים השחורים באיור 2 א-2D. התא הכחול הבודד מופיע להגר וintercalate עם תאי שכניה. לאחר מכן הוא מתארך לאורך הציר הקדמי-אחורי כדי ליצור הכונדרוציטים אחידה בצורה ובכך שמירה על הצורה הגלובלית של הסחוס של מקל כפי שמרחיב anteriorly.
טכניקה זו מאפשרת הלימוד של מומים צמיחת לסת תחתונה ברמה התאית ואיבר בתנאים כגון רצף רובין בי micrognathia הוא אחת התכונות הבולטות שתוארו. כישלון בשגשוג, הרחבה או עיבור ניתן דמיין ביעילות בt הוא גדל כונדרוציטים לאורך זמן.
| NaCl | 14.61 גרם |
| KCl | 0.65 גרם |
| CaCl 2 | 1.83 גרם |
| MgSO 4 | 1.99 גרם |
| Deionized H 2 O | 1,000 מיליליטר |
| * אחסון: RT | |
| ** להוסיף 1 טיפה של מתילן הכחול כאנטי פטרייתי | |
טבלת 1. 50X E3 מתכון בינוני עוברי
| 50X E3 | 20 מיליליטר |
| Deionized H 2 O | 980 מיליליטר |
| * אחסון: RT | |
| 1M טריס-Cl (pH 9.5) | 9 מיליליטר |
| tricaine | 2 גרם |
| Deionized H 2 O | לעשות עד 1 ליטר |
| * אחסון: RT | |
3. 0.2% מתכון Tricaine שולחן
1. סחוס איור () של הקרינה מקל של sox10:.. GFP סחוס של גזורה מקל (B) של 4 DPF טובינגן עובר מוכתם בAlcian הכחול (C) קווי דג הזברה מהונדסים UBI: צלב Zebrabow-M עם sox10: ERT2-cre. UBI (DG): Zebrabow-M; sox10: ERT2-CRתמונת דואר בRFP (ד '), YFP (E), CFP ערוצים (F) ולמזג (G). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. צילום (AD) בהילוך איטי של Zebrabow-M: sox10: ERT2-Cre ב3dpf (), 3.5dpf, 4dpf (C) ו5dpf (ד) (ב). חיצים שחורים מצביעים על אותו השיבוט אחד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קווים מהונדסים כחולים וphotoconvertible Alcian כפי שתואר לעיל משלים אחד את השני כדי להגדיר את התהליך המורכב של סחוס ועצם פיתוח. עם זאת, העברת חיה סלולרית וארגון במהלך organogenesis כבר שיערו ארוכה ובעקיפין הפגינו אבל מעולם לא דמיינו. קו מהונדס Zebrabow-M בשילוב עם סחוס Cre הספציפי מאפשר תצפית חיות בו זמנית של כל האירועים שונים אלה מעורבים בהיווצרות עצם וסחוס. טכניקה זו מאפשרת הלימוד של פגמי צמיחת לסת תחתונה ברמה התאית ואיבר בתנאים כגון רצף רובין בי micrognathia הוא אחת התכונות הבולטות שתוארו. כישלון בשגשוג, הרחבה או עיבור ניתן דמיין ביעילות בכונדרוציטים גדלו לאורך זמן.
אופטימיזציה מגוון צבעים
אופטימיזציה של רמות Cre ידי titrating הריכוז של 4 hydroxytamoxifen-יכול לשלוט extenלא של רקומבינציה וגיוון צבע ללא כתוצאה מהקטלניות עובר. אסטרוגן הוא קריטי להתפתחות רשתית נורמלית ולכן, מינונים גבוהים יותר של טמוקסיפן (> 25μM) יכולים לגרום לניוון רשתית, שיעורי תמותה גבוהים (~ 60 עד 80%), מומים craniofacial ועיכובים התפתחותיים. בנוסף, 4 hydroxytamoxifen-מדולל באתנול, אשר בעצמו הוא רעיל במהלך התפתחות עוברית 13. לכן, חשוב לקבוע את הריכוז ומשך החשיפה להשגת שיעור רקומבינציה טוב ביותר אך להגביל את הרעילות לעוברים.
הריכוז הרצוי של 4 hydroxytamoxifen-עבר אופטימיזציה בפרוטוקול זה. ריכוזים שונים (5-25 מיקרומטר), נקודות אינדוקציה זמן (10 somites, 24, 36 ו48 hpf) ומשך (30 דקות עד 6 שעות) נבדקו (מידע לא מוצג). מינון נמוך של טמוקסיפן (5 מיקרומטר) המיוצר על רקומבינציה מוגבלת בזמן במינונים גבוהים יותר (10 מיקרומטר מל -20 מיקרומטר) המיוצרים על ה- SIMרקומבינציה ilar וגיוון צבע. יותר מ -20 מיקרומטר המינונים התפשרו התפתחות תקינה של עוברים ולכן אינם מתאימים ללימוד מומים craniofacial. משכי אינדוקציה פחות משעה 2 לא היו מספיק כדי ליצור רקומבינציה נאותה תוך מעל 6 שעות של רעילות מושרה אינדוקציה וחריגות התפתחותית בעוברים. אינדוקציה במשך 3 או 4 שעות לא הייתה שונה בסך של רקומבינציה ותוצאות סופיות.
אינדוקציה לאחר השלב העוברי hpf 24 לא מיוצר רקומבינציה רצויה וביטוי ניאון. לכן, הפשרה הטובה ביותר בין התפתחות הנורמלית וכמות המתאימה של צבעים ללא כתוצאה ממספרים גבוהים באופן משמעותי לתמותה העוברית הייתה נחוש להיות 3 שעות של אינדוקציה ב 10 somites עם ריכוז 10μM של טמוקסיפן.
איכות תמונה
קבלת תמונות באיכות עקבית וגבוהות יכולה להיות מאתגרת. אם תחום אחד של viEW אינו מסוגל לדמיין את כל הסחוס של מקל או מבנה craniofacial של עניין, כל המבנה יכול להיות ממופה על ידי לקיחת Z- ערימות. עם זאת, קבלת Z- ערימות יכולה להיות מאתגרת בתחום ההדמיה עובר חי בשל חפצי תנועה. לכן, חשוב שתהיינה לי פשרה בין איכות תמונת Z-הערימה, כמות המידע הנדרשת במהלך פגישת ההדמיה והמניעה של צילום הלבנת מושרה לייזר במהלך חשיפת לייזר לטווח ארוכה יותר.
מגבלה נוספת של שיטה זו היא שחלבוני ניאון לא מראים את אותה היציבות במהלך הדמיה. לדוגמא RFP הוא חלבון יציב יחסית אך YFP יכול להיות לא יציב. לכן, חשוב לקבוע את הגדרות ההדמיה הטובות ביותר באופן אמפירי כדי לזהות את המספר המרבי של צבעים בעובר נתון בעוצמה מתאימה.
בנוסף ליציבות צבע, מיקרוסקופ confocal היא מגבלה אחרת משום שאינו מסוגל לקרוא את CFPוערוצי YFP יחד. זאת בשל העובדה כי הפליטה מCFP מזוהה בשני ערוצי 470nm ו535nm. בנוסף, ספקטרום הפליטה של CFP (470-535nm) וספקטרום העירור של YFP חפיפה (530nm), יצירת סריג (העברת אנרגיית תהודת הקרינה) חפץ. במילים אחרות, כאשר הקרינה CFP מזוהה, זה מרגש את הקרינה YFP וכך ליצור אות שאינה ספציפית. מסיבה זו, פרוטוקול זה מתאר סריקה כל ערוצי הקרינה היו בנפרד ומיזוג התמונות בודדות בנפרד באמצעות תוכנת עיבוד הדמיה נפוצה. כדי לעקוף את המגבלות של מיקרוסקופ confocal, מיקרוסקופ שני פוטונים יכול לשמש כמתואר במאמר של פאן et al בו ניתן לקרוא את כל ביטויי הקרינה שלוש בו זמנית מאפשרים ליותר גיוון צבע 8. פאן et al תאר ספקטרום גדול של גיוון צבע בקווי Zebrabow-M שלהם (עד 30 צבעים). בעקבות התנאים המתוארים בprot זהocol, ניתן להשיג בעוצמות שונות של הקרינה ושילובים כפי שמוצגת באיור 2, למרות שחלקם תמורות צבע יכולות כבר איבדו במהלך עיבוד פוסט-ההדמיה.
ירושת צבע וניתוחים משובטים
פאן et al תאר את ירושת הצבע נשמרה יציבות בZebrabow-M מאב לצאצאים המאפשר למיפוי גורל 8. פרוטוקול זה התמקד בתאים עצביים CNCC לאפיין את ההיווצרות של הסחוס של מקל. השימוש בCreERT2 בדג הזברה מאפשר רקומבינציה היעילה טמוקסיפן מושרה קלטת loxP ואת היכולת לשלוט תחילת תיוג שושלת CNCC במהלך פיתוח craniofacial. שיטה זו יכולה בקלות להיות מותאמת כדי להמחיש את כל נגזרי הרכס העצביים מלבד הסחוס של מקל. בנוסף, שימוש בקו כתב מהונדס שונה לניתוח משובט במערכות איברים שונות ידגיש מ 'שונההאודות של צמיחת תאים במהלך organogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מודים אלכס Schier לחביבות שיתוף הקו המהונדס Zebrabow-M, ג'פרי ברנס לוקטור pDEST ורנה Ethier-Daigle לטיפול מצוין של מתקן הדגים וקווים.
מימון:
אנו מודים לתמיכה נדיבה מימון מNIDCR RO3DE024490 ובתי החולים ריינרים לילדים (ECL) ומלגות הכשרת פוסט-דוקטורט מבתי החולים ריינרים לילדים (LR וי.ק.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
- McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
- Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Vieira, A. R. Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
- Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
- Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).
