Summary
Celle organisering af kraniofaciale knogler har længe været en hypotese, men aldrig direkte visualiseres. Multispektral cellemærkning og in vivo levende billeddannelse tillader visualisering af dynamiske celle adfærd i zebrafisk underkæbe. Her har vi detaljeret protokollen til at manipulere Zebrabow transgene fisk og direkte observere celle intercalation og morfologiske ændringer af chondrocytter i Meckel s brusk.
Abstract
Udvikling af de hvirveldyr kraniofaciale strukturer kræver præcis koordinering af celle migration, spredning, vedhæftning og differentiering. Mønster af Meckel s brusk, en første svælg bue derivat, involverer migrering af kranie neurale crest (CNC) celler og den gradvise partitionering, spredning og organisering af differentierede chondrocytter. Flere undersøgelser har beskrevet CNC migration under underkæben morfogenese, men detaljerne i, hvordan chondrocyterne opnår organisation i vækst og udvidelse af Meckel s brusk fortsat uklart. Den sox10 begrænset og kemisk induceret Cre-rekombinase-medieret rekombination frembringer permutationer af forskellige fluorescerende proteiner (RFP, YFP og FFP), hvorved der skabes en multi-spektral mærkning af progenitorceller og deres afkom, der afspejler forskellige klonpopulationer. Brug konfokal time-lapse fotografering, er det muligt at observere chondrocyterne behavieller under udviklingen af zebrafisk Meckel brusk.
Multispektral celle mærkning gør det muligt for forskerne at påvise udvidelse af Meckel s chondrocytter. Under udvidelse fase af Meckel s brusk, som en forløber underkæben, chondrocytter interkalerer at foretage udvidelse, da de stak på en organiseret encellede lag række. Svigt i denne organiserede interkalerende proces at mægle celle forlængelse giver den cellulære mekanistisk forklaring på hypoplastisk underkæbe, som vi observerer i mandibulære misdannelser.
Introduction
Craniofacial udvikling kræver komplekse molekylære, cellulære og væv interaktioner til at køre celleproliferation, migration og differentiering 1,2, 3. Dette stramt reguleret og kompleks proces er underlagt genetiske og miljømæssige forstyrrelser, således at kraniofaciale misdannelser er blandt de mest almindelige medfødte misdannelser 1-9. Mens kirurgiske indgreb er fortsat grundpillen i behandling for kraniofaciale anomalier, forstå udviklingen grundlag er afgørende for at innovere fremtidige behandlinger. Derfor studere morfogenese og mekanismerne i konvergensprogrammet og udvidelse og celle integration giver nye indsigter i dannelsen af den kraniofacial skelet 1.
Kraniel neurale våbenskjold migrere og befolke den første svælg bue, så danne parrede mandiblens processer, der strækker sig til at danne Meckel s brusk, som en forløber underkæben. Morfogenese of Meckel brusk kræver chondrocyt organisation via retningsbestemt proliferation, cellepolarisering og differentiering 1,10. Men forviklinger af chondrocytter organisation i vækst og udvidelse af Meckel brusk stadig uklar. Forståelse dynamiske celle adfærd er afgørende for forståelsen medfødte misdannelser, der påvirker mandibulær størrelse, såsom hypoplastiske underkæbe fænotyper 11.
Zebrafisk embryoner tilbyder mange udviklingsmæssige og genetiske fordele for detaljeret undersøgelse af Meckel s brusk morfogenese. Deres genetiske sporbarhed, gennemsigtighed, ex vivo og hurtig udvikling er stærke fordele udlån det godt for observation af celle bevægelser og organisation ved direkte billedvisning 6. Brug slægt-sporing værktøjer, såsom sox10: Kaede transgene linje, har vi og andre afgrænset de neurale crest oprindelsen af embryonale kraniofacial skelet 1,5. Using af sox10: ERT2-Cre med ubi: Zebrabow-M transgene linje, er det nu muligt at udforske detaljer om cellulære bevægelser under kraniofacial udvikling. Den Zebrabow-M, er en transgen linje manipuleret med ubiquitinpromotoren driver ekspressionen af forskellige fluoroforer, hver flankeret af lox-steder 8. Den Zebrabow-M standard fluorophor er rød, der udtrykker RFP. Efter induktion af Cre udtryk, den Zebrabow-M konstruere rekombinerer og celler udtrykker en kombination af forskellige fluoroforer (RFP, FFP og YFP) skaber flere spektral udtryk i embryoet. Alle datterceller, som deler fra de mærkede celler efter rekombinationsbegivenheden derefter klonalt mærket, således at cellepopulationer, der stammer fra forskellige sidestillede progenitorer klonalt mærket. Ved denne kloning cellemærkning kan celler proliferation og migration med klonal opløsning følges (figur 1 og 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) godkendte alle procedurer i henhold til protokol nummer # 2010N000106. Dette er i overensstemmelse med Foreningen for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care International (AAALAC) retningslinjer.
1. Reagenser og materialer Fremstilling
- Forbered 1 L 50X E3 embryo medium (se tabel 1) og forberede 1 L 1X E3 embryo medium (se tabel 2).
- Forbered E3 embryo medium med N-phenylthiourinstof (PTU) ved tilsætning af 30 mg af PTU til 1 l 1X E3. Stir O / N at sikre, at PTU fuldstændigt er opløst. Opbevar ved stuetemperatur.
- For at forberede pronaseopløsning, fortyndes 150 pi pronase (0,5 mg / ml) med 15 ml 1X E3. Denne mængde er tilstrækkelig til 1 petriskål. Brug det samme.
- Forbered methylcelluloseopløsning.
- Forbered E3-tricaine løsning ved at blande 75 ml 0,2% tricaine med 25 ml1X E3. Kog 3 g methylcellulose i 75 ml E3-tricaine løsning.
- Gøre den endelige volumen til 100 ml med E3-tricaine løsning. Den endelige methylcellulose løsning er tyktflydende og ugennemsigtige med en gullig nuance. Opbevaring: RT beskyttet mod lyset.
- Tamoxifen materiel og induktion løsning
- Forbered 5 mM tamoxifen stamopløsning ved at opløse 4-hydroxytamoxifen i 100% ethanol. Store lager ved -80 ° C.
- Fremstilles frisk fortynding af tamoxifen ved koncentrationen ønske i 1X E3 at opnå induktion opløsning. ADVARSEL! Kontakt venligst MSDS før brug.
- Forbered 1 L på 0,2% tricaine som pr tabel 3.
- Opnå konfokale lysbilleder. Lim fire dækglas (18 x 18) sammen for at danne en blok derefter placere 2 blokke på en 24 x 60 dækglas 2 cm fra hinanden for at tillade montering af embryoet i midten.
2. Embryo Forberedelse
- Transgene linjer.
- sox10: ERT2-Cre
BEMÆRK: Generer det targeting vektor pDestTol2- sox10: ERT2-Cre under anvendelse af standard molekylær kloning metoder og kommercielt opnåede rekombination kloning teknologi.- Kombiner 5'indgangsklon (pENTR5'- sox10p) indeholdende 7.2Kb af sox10 promotor, en Gateway midterste klon (PME-ERT2-Cre), og en 3'indgangsklon (pENTR3'-polyA) i en LR reaktion med linse destination Vektor pDestTol2- α-crystallin: YFP.
- Rens konstruktion pDestTol2- sox10: ERT2-Cre. Co-injicere oprenset konstruktion (100 ng / pl) med Tol2 transposase mRNA (50 ng / pl) i WT embryoner (F0) på en celle stadium.
- Screen F0 voksne grundlæggere til kim-line transmission baseret på en stærk gul fluorescens i F1 embryoner.
- sox10: ERT2-Cre, Zebrabow-M
- Udkrydsning den Zebrabow-Mlinie (2.1.1) med sox10: ERT2-Cre transgene linje.
- Vælg embryoer udviser en stærk allestedsnærværende RFP udtryk og YFP linse markør og dyrke dem till voksne.
3. Embryo Collection
- Opsæt flere par sox10: ERT2-Cre, Zebrabow-M transgene zebrafisk 17:00 til 18:00 på dag 1.
- Den følgende dag, trække dividers om morgenen og indsamle æg omkring middag.
- Overføre dem til petriskåle og tilsæt 15 ml pronase løsning til at dechorionate embryoner.
- Inkubér embryoner til 1 til 5 min, indtil ca. 60% af embryonerne er blevet dechorionated. Reaktionen standses ved dekantering af opløsningen og pronase vaske embryoerne 3-4 gange med frisk medium E3.
- Inkubér dechorionated embryoner i E3 ved stuetemperatur O / N og lad dem udvikle sig til nå 10 somitter fase. Inkuber 50-60 embryoer pr koblingen for at undgå forskellige udviklingsmæssige vækst. 4. Behandling
- Kontroller embryoner 'udviklingsstadiet under en let felt mikroskop for at sikre, at de er på 10 somitter scenen.
- Anvendelse af et fluorescensmikroskop med et rødt fluorescerende protein (RFP) filter, isolere de lyse røde embryoner.
- Fortsæt til induktion af Cre-rekombination ved tilsætning af 10 uM hydroxytamoxifen løsning på petriskål og inkubere isolerede embryoner ved 28,5 ° C i 3 timer.
- Dekanteres tamoxifen opløsning og vaske embryoerne flere gange med E3.
ADVARSEL! den tamoxifen løsning i en særlig biologisk affaldsbeholder kassere. - Inkuberes embryoner ved 28,5 ° CO / N.
- Når embryonerne er omtrent 28-29 somitter etape (ca. 24 timer efter befrugtning), inkuberes embryoner ved 28,5 ° C i E3-PTU løsning herefter.
BEMÆRK: PTU er her til at hæmme dannelsen af melanoforer i udviklingslandene embryoner. Denne behandling er nødvendig for atundgå signal forvrængning af fluorescens ved auto-fluorescerende melanoforer. - Inkuberes embryoner ved 28,5 ° C
- At visualisere de fuldt udviklede kraniofaciale strukturer, vælge de embryoner på 4 dage efter befrugtning for intensiteten af den røde signal og Cre udtryk markør positivitet (gul i nethinden).
- Bedøver embryoner med E3 / 0,015% tricaine løsning. Anæstesi er bekræftet, når ingen aktive bevægelser eller fin aktivitet observeres, når blidt puffede embryoet.
- Overfør den valgte embryo til billeddannelse i en petriskål, der indeholder en dråbe af methylcellulose og forsigtigt balsamere embryoet med methylcellulose.
- På en ren konfokal dias, placere en dråbe af frisk methylcellulose og montere din embryo inden drop ved hjælp af en microloader tip. Position embryo dorsalt tage forsigtighed for ikke at røreembryoet direkte.
- Dæk monteret embryo med en 25 x 25 dækglas og justere positionen af embryo om nødvendigt ved at manipulere dækglasset.
- Embryoet er nu klar til billedet.
- Brug 20x tør mål linsen (numerisk apertur 0,75, pinhole størrelse 2,0 um) til fokusering embryoet.
- Tryk på knappen L100 på mikroskopet og vælg kanalerne i softwaren.
- Vælg den konfokal setup knappen, og klik på 'auto', og vælg følgende kanaler, før du lukker vinduet: Ch1: fælles fiskeripolitik, Ch2: GFP, Ch3: RFP eller mCherry
- Tænd CH2 og CH3 før du klikker på knappen 'Fjern interlock «. Klik på 'play' for at begynde scanningen.
- Fokus på struktur af interesse, hvilket bedst gøres ved at starte med ½ stel / sek og høj spænding (HV) 150, og derefter justere indstillingerne i overensstemmelse hermed, indtil den ønskede billedkvalitet er achieved. RFP ville være lysere end andre farver, således justere HV. Skift Z position til at finde både YFP og RFP positive celler.
- Når de er indstillet med indstillingerne, fange billedet af din foster. Gem dit billede i konfokal imaging software format og TIFF-format til billedbehandling i hvert split kanal.
- Dernæst til den fælles fiskeripolitik billedbehandling, slukke CH2 og CH3 og slå Ch1. Re-justere indstillingerne som i trin 5 uden at ændre fokusområde.
BEMÆRK: fælles fiskeripolitik kan være virkelig svært at opdage på grund af baggrund signal i blå kanal, der kan omgås ved at justere pinhole størrelse. En større pinhole størrelse tillader bedre påvisning af fluorescensen ved at reducere signal / baggrundsstøj-forhold. Dog vil en større pinhole reducere konfokal effekt, gå på kompromis med billedkvaliteten. Derfor er omhyggelig justering af de indstillinger, der kræves for at opnå den ønskede billedkvalitet og intensitet. - Tage billedet og gemme det i både format (konfokal software og TIFF) til billedbehandling. Billeder kan derefter behandles ved hjælp fælles billedbehandling software til at flette lag og forbedre farveindstillinger som beskrevet af Pan og kolleger 8.
5. Embryo Selection
6. Montering af Embryo i methylcellulose
7. Analyse ved fluorescensmikroskopi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Traditionelle brusk visualisering af hele mount alcianblåt pletter har været uvurderlig i at observere udviklingen Meckel brusk og almindeligt anvendt til at visualisere endelige cellulære organisation 12 (figur 1A). For yderligere at analysere udviklingslandene chondrocytter overarbejde, afstamning sporing hjælp sox10: Kaede transgene linier har gjort det muligt for os at studere celle migration, konvergens og udvidelse i levende fostre 2,12 (Figur 1B). Dog forbliver organiseringen af chondrocytter i kraniofacial skeletstrukturen dårligt forstået. Ved billeddannelse, at Zebrabow-M transgene linje er i stand til at afsløre processen med chondrocytter indskydning og forlængelse, der medierer udvidelse og vækst i Meckel brusk (figur 1C-G).
I denne protokol, Ubi: Zebrabow-M, sox10: ERT2-Cre embryoer blev behandlet med tamoxifen ved 10 somitter og chondrocytes i underkæben blev visualiseret på forskellige tidspunkter under udviklingen (fra 3 dpf til 5 dpf). Underkæben er bedst afbilledet ventralt at tillade fri udsigt over Meckel s brusk uden indblanding af ethmoid plade og neurocranium dorsalt. De stabilt vedligeholdt og nedarvede farver gør det let slægt sporing og CNCC celler skæbne kortlægning som angivet ved de sorte pile i figur 2A-2D. Den enkelte blå celle ser ud til at migrere og interkalere med sine naboceller. Det forlænger derfra langs anterior-posterior akse til dannelse af en ensartet formet chondrocyt derved bevare den globale formen af Meckel brusk idet den strækker sig anteriort.
Denne teknik tillader studiet af underkæben vækst misdannelser på det cellulære og orgel niveau tilstande som Robin sekvens hvor mikrognati er en af de fremtrædende træk beskrives. Svigt i proliferation, udvidelse eller interkalering effektivt kan visualiseres i t han vokser chondrocytter over tid.
| NaCl | 14,61 g |
| KCI | 0,65 g |
| CaCl2 | 1,83 g |
| MgSO4 | 1,99 g |
| Deioniseret H2O | 1000 ml |
| * Opbevaring: RT | |
| ** Tilsæt 1 dråbe af blå methylen som en anti-svampe | |
Tabel 1. 50X E3 embryonale medium opskrift
| 50X E3 | 20 ml |
| Deioniseret H2O | 980 ml |
| * Opbevaring: RT | |
| 1M Tris-CI (pH 9,5) | 9 ml |
| tricaine | 2 g |
| Deioniseret H2O | Der fyldes op til 1 l |
| * Opbevaring: RT | |
Tabel 3. 0,2% tricaine opskrift
Figur 1. (A) Fluorescens Meckel s brusk af sox10:.. GFP (B) dissekeret Meckel s brusk af en 4 dpf Tübingen foster farvet med alcianblåt (C) Transgene zebrafisk linjer Ubi: Zebrabow-M kors med sox10: ERT2-CRE. (GD) Ubi: Zebrabow-M, sox10: ERT2-Cre billede i RFP (D), YFP (E), den fælles fiskeripolitik (F) kanaler og flette (G). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. (AD) Timelapse fotografering af Zebrabow-M: sox10: ERT2-Cre på 3dpf (A), 3.5dpf (B), 4dpf (C) og 5dpf (D). Sorte pile peger på den samme enkelt klon. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alcian Blue og photoconvertible transgene linier som beskrevet ovenfor supplerer hinanden for at definere den indviklede proces af brusk og knogle udvikling. Imidlertid har levende cellulære migration og organisation under organogenesen længe været en hypotese og indirekte demonstreret, men aldrig visualiseret. Zebrabow-M transgene linje kombineret med en brusk- specifikke Cre tillader samtidig levende observation af alle disse forskellige begivenheder involveret i knogle- og bruskdannelse. Denne teknik tillader studiet af underkæben vækst defekter på cellulært og orgel niveau tilstande som Robin sekvens hvor mikrognati er en af de fremtrædende træk beskrives. Svigt i proliferation, udvidelse eller interkalering effektivt kan visualiseres i de voksende chondrocytter over tid.
Farve mangfoldighed optimering
Optimering Cre niveauer ved titrering af koncentrationen af 4-hydroxytamoxifen kan styre EXTENt af rekombination og farve mangfoldighed, uden hvilket resulterer i embryo dødelighed. Østrogen er kritisk for normal retinal udvikling og derfor kan højere doser af tamoxifen (> 25 pM) inducerer retina degeneration, høj dødelighed (~ 60 til 80%), kraniofaciale misdannelser og udviklingsmæssige forsinkelser. Desuden er 4-hydroxytamoxifen fortyndet i ethanol, hvilket i sig selv er toksisk under fosterudviklingen 13. Derfor er det vigtigt at bestemme den bedste koncentration og varighed af udsættelse for opnåelse af en god rekombination sats men begrænse toksiciteten for embryoner.
Den ønskede koncentration af 4-hydroxytamoxifen er optimeret i denne protokol. Forskellige koncentrationer (5-25 uM), induktion tidspunkter (10 somitter, 24, 36 & 48 HPF) og varighed (30 min til 6 timer) blev testet (data ikke vist). En lav dosis af tamoxifen (5 uM) producerede en begrænset rekombination mens højere doser (fra 10 pM til 20 uM) producerede simnende rekombination og farve mangfoldighed. Doser større end 20 uM kompromitteret normal udvikling af embryoner og derfor ikke egnet til at studere kraniofaciale misdannelser. Induktion varigheder mindre end 2 timer var ikke nok til at skabe tilstrækkelig rekombination mens over 6 timer af induktion induceret toksicitet og udviklingsmæssige anomalier i embryoner. Induktion til 3 eller 4 timer afveg ikke i mængden af rekombination og endelige resultater.
Induktion efter 24 HPF fosterstadiet ikke produceret ønskede rekombination og fluorescerende ekspression. Derfor blev det bedste kompromis mellem normal udvikling og egnet mængde af farver uden at det medfører meget høje antal fosterdødelighed bestemt til at være 3 timer af induktion ved 10 somitter med 10 uM koncentration af tamoxifen.
Billedkvalitet
Indhentning konsistente og høje kvalitet billeder kan være udfordrende. Hvis et enkelt felt af VIew er i stand til at visualisere hele Meckel brusk eller kraniofaciale struktur af interesse, kan hele strukturen kortlægges ved at Z-stakke. Dog kan opnå Z-stakke være udfordrende i levende foster billedbehandling grundet bevægelse artefakter. Derfor er det vigtigt at have et kompromis mellem kvaliteten af Z-stack billede, mængden af oplysninger, der kræves i den billeddannende samling og forebyggelse af laser-induceret foto-blegning under længere sigt laser eksponering.
En anden begrænsning ved denne teknik er, at fluorescerende proteiner ikke viser den samme stabilitet under billedbehandling. For eksempel RFP er et relativt stabilt protein, men YFP kan være ustabil. Det er derfor vigtigt at bestemme de bedste imaging indstillinger empirisk at detektere det maksimale antal farver i en given embryo med passende intensitet.
Ud over farve stabilitet, konfokale mikroskop er en anden begrænsning, fordi det er i stand til at læse den fælles fiskeripolitikog YFP kanaler sammen. Dette skyldes det faktum, at emissionen fra FFP detekteres i både 470 nm og 535nm kanaler. Hertil kommer, at emissionsspektret for FFP (470-535nm) og excitation spektrum af YFP (530 nm) overlapper hinanden, hvilket skaber en FRET (fluorescensresonansenergioverførsel) artefakt. Med andre ord, når der registreres fluorescensen FFP, det ophidser YFP fluorescens dermed skabe et ikke-specifikt signal. Af denne grund, skitserer denne protokol scanne alle fluorescens kanaler var separat og sammenlægge de enkelte billeder for sig ved hjælp af en fælles billedbehandling forarbejdning software. For at omgå begrænsningerne i konfokalt mikroskop, kan en to-fotoner mikroskop anvendes som beskrevet i Pan et al papir, hvor alle tre fluorescens udtryk kan læses samtidigt giver mulighed for mere farve mangfoldighed 8. Pan et al har beskrevet et bredt spektrum af farver mangfoldighed i deres Zebrabow-M linjer (op til 30 farver). Efter de betingelser, der er beskrevet i denne protocol, kan opnås forskellige intensiteter af fluorescens og rekombinationer som vist i figur 2, selv om nogle farve permutationer kunne have været tabt under post-imaging.
Farve arv og klonale analyser
Pan et al har beskrevet stabilt opretholdt farve arv i Zebrabow-M fra stamfader til afkom, der giver mulighed for skæbnen kortlægning 8. Denne protokol fokuseret på neurale celler CNCC at karakterisere dannelsen af Meckel brusk. Anvendelsen af CreERT2 i zebrafisk muliggør effektiv tamoxifen inducerede loxP kassette rekombination og evnen til at kontrollere udbrud af CNCC slægt mærkning i kraniofaciale udvikling. Denne metode kan nemt tilpasses til at visualisere alle neurale crest derivater udover Meckel s brusk. Desuden, ved hjælp af en anden transgen reporter linje for klonal analyse i forskellige organsystemer vil fremhæve forskellige moder af cellevækst under organogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker Alex Schier for venligt deler Zebrabow-M transgene linje, Geoffrey Burns for pDEST vektor og Renee Ethier-Daigle for fremragende pleje af fisken facilitet og linjer.
FINANSIERING:
Vi er taknemmelige for generøse finansiering støtte fra NIDCR RO3DE024490 og Shriners Hospitals for Children (ECL) og ph.d.-uddannelsesstipendier fra Shriners Hospitals for Children (LR og YK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
- McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
- Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Vieira, A. R. Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
- Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
- Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).
