Summary
Cell organisation av kraniofaciala ben har länge varit en hypotes men aldrig direkt visualiseras. Multi-spektral cellmärkning och in vivo levande avbildning möjliggör visualisering av dynamiska cellbeteende i zebrafisk käken. Här, att vi i detalj protokollet manipulera Zebrabow transgen fisk och direkt observera cell inlagring och morfologiska förändringar av kondrocyter i Meckels brosk.
Abstract
Utveckling av ryggradsdjur kraniofaciala strukturer kräver noggrann samordning av cellmigration, proliferation, vidhäftning och differentiering. Mönstring av Meckels brosk, en första svalg båge derivat, innebär migration av hjärn neurallisten (CNC) celler och den progressiva partitione, spridning och organisation av differentierade kondrocyter. Flera studier har beskrivit CNC migration under underkäken morfogenes, men detaljerna i hur kondrocyterna uppnår organisation i tillväxt och utvidgning av Meckels brosk är fortfarande oklart. Den sox10 bundet och kemiskt inducerad Cre-rekombinas-förmedlad rekombination genererar permutationer av distinkta fluorescerande proteiner (RFP, YFP och GFP), och därigenom skapa en multispektral märkning av progenitorceller och deras avkomma, vilket återspeglar distinkta klonala populationer. Med hjälp av konfokal time-lapse fotografering, är det möjligt att observera kondrocytema behavieller under utveckling av zebrafisk Meckels brosk.
Multispektrala cellmärkning gör det möjligt för forskarna att visa förlängning av Meckels kondrocyter. Under förlängningsfasen av Meckels brosk, vilket förebådar underkäken, kondrocyter inskjuta att åstadkomma utsträckning som de stack på ett organiserat encelliga lager rad. Misslyckande av detta organiserade interkalerande process för att förmedla cell förlängning ger den cellulära mekanistisk förklaring för hypoplastic käken som vi ser i underkäken missbildningar.
Introduction
Kraniofaciala utveckling kräver komplexa molekylära, cellulära och vävnadsinteraktioner att driva celltillväxt, migration och differentiering 1,2, 3. Detta hårt reglerad och komplicerad process är föremål för genetiska och miljömässiga störningar, så att kraniofaciala missbildningar är bland de vanligaste födelse missbildningar 1-9. Även kirurgiska ingrepp förblir grunden för behandling av kraniofaciala anomalier, att förstå utvecklingen grunden är viktigt att förnya framtida terapier. Därför studera morfogenes och mekanismerna i konvergens och utbyggnad och integration cell ger nya insikter i bildandet av den kraniofaciala skelettet 1.
Kraniell neurallisten migrera och fylla den första svalget bågen, sedan bilda parade mandibulära processer som sträcker sig för att bilda Meckels brosk, vilket förebådar underkäken. Morfogenes of Meckels brosk kräver kondrocyt organisationen via riktad spridning, cell polarisering och differentiering 1,10. Förblir dock intrikat av chondrocyte organisation i tillväxt och utvidgning av Meckels brosk oklar. Förstå dynamisk cellens beteende är avgörande för att förstå medfödda missbildningar som påverkar mandibular storlek, såsom hypoplastiska käken fenotyper 11.
Zebrafisk embryon erbjuder många utvecklings- och genetiska fördelar för detaljerad studie av Meckels brosk morfogenes. Deras genetiska spårbarhet, öppenhet, ex vivo och snabb utveckling är kraftfulla fördelar utlåning det bra för observation av cellrörelse och organisation av levande avbildning 6. Använda linje-spårning verktyg, såsom sox10: kaede transgen linje, har vi och andra avgränsade neurallisten ursprung embryonala kraniofaciala skelettet 1,5. USIng sox10: ERT2-Cre med ubi: Zebrabow-M transgen linje, är det nu möjligt att utforska detaljer om cellulära rörelser under kraniofaciala utveckling. Den Zebrabow-M, är en transgen linje framtagen med ubiquitin-promotorn som driver uttrycket av olika fluoroforer, vardera flankeras av lox-ställen 8. Den Zebrabow-M standard fluorofor är röd, som uttrycker RFP. Efter induktion av Cre uttryck, den Zebrabow-M konstruera rekombinerar och celler uttrycker en kombination av olika fluoroforer (RFP, GFP och YFP) skapar multi-spektrala uttryck i embryot. Alla dotterceller som skiljer från de märkta cellerna efter rekombinationshändelsen sedan klonalt märkta, så att cellpopulationer som härrör från olika intill varandra belägna stamceller är klonalt märkta. Genom denna kloningscellmärkning, kan celler spridning och migration med klon upplösning följas (Figur 1 och 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) godkände alla moment i protokollnummer # 2010N000106. Detta är i enlighet med Föreningen för bedömning och ackreditering av Laboratory Animal Care International (AAALAC) riktlinjer.
1. Reagens och material Förberedelser
- Bered en liter 50X E3 embryo medium (se tabell 1) och förbereda ett L 1X E3 embryo medium (se tabell 2).
- Förbered E3 embryo medium med N-fenyltiokarbamid (PTU) genom att tillsätta 30 mg av PTU till 1 L 1X E3. Rör O / N för att säkerställa att den PTU fullständigt har lösts upp. Förvara vid RT.
- För att framställa pronas lösning, späd 150 | il av pronas (0,5 mg / ml) med 15 ml 1X E3. Denna mängd är tillräcklig för en petriskål. Använd omedelbart.
- Bered Metylcellulosa lösning.
- Förbered E3-tricaine lösning genom att blanda 75 ml 0,2% tricaine med 25 ml1X E3. Koka 3 g metylcellulosa i 75 ml E3-tricaine lösning.
- Späd den slutliga volymen till 100 ml med E3-tricaine lösning. Den slutliga metylcellulosalösning är trögflytande och ogenomskinlig med en gulaktig nyans. Lagring: RT skyddas från ljus.
- Tamoxifen lager och induktionslösning
- Bered 5 mM tamoxifen förrådslösning genom upplösning av 4-hydroxitamoxifen i 100% etanol. Butiks lager vid -80 ° C.
- Framställ färsk utspädning av tamoxifen vid önskan koncentration i 1X E3 för erhållande induktionslösning. OBS! Kontakta säkerhetsdatablad före användning.
- Bered en L av 0,2% tricaine enligt tabell 3.
- Skaffa konfokala bilder. Limma fyra coverglass (18 x 18) tillsammans för att bilda ett block sedan placera 2 block på en 24 x 60 coverglass 2 cm från varandra för att medge montering av embryot i mitten.
2. Embryo Framställning
- Transgena linjer.
- sox10: ERT2-Cre
OBS: Generera målsökningsvektom pDestTol2- sox10: ERT2-Cre användning av standardmolekylkloningsmetoder och kommersiellt erhållen rekombination kloningsteknik.- Kombinera 5 'entryklon (pENTR5'- sox10p) innehållande 7.2Kb av sox10 promotor, en Gateway-mellan klon (PME-ERT2-Cre), och en 3' entryklon (pENTR3'-polyA) i en LR-reaktion med linsdestination vektor pDestTol2- α-kristallin: YFP.
- Rena konstrukt pDestTol2- sox10: ERT2-Cre. Samtidig injicera den renade konstruktionen (100 ng / ul) med Tol2 transposas-mRNA (50 ng / ul) i WT-embryon (F0) vid en cellstadiet.
- Skärm F0 vuxna grundare för bakterie line överföring baserad på en stark gul fluorescens i embryon F1.
- sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M
- Utparning den Zebrabow-Mline (2.1.1) med sox10: ERT2-Cre transgena linje.
- Välj embryon som uppvisar en stark överallt RFP uttryck och YFP objektiv markör och odla dem till vuxna.
3. embryosamlings
- Ställ in flera par sox10: ERT2-Cre, Zebrabow-M transgen zebrafisk från 05:00 till 18:00 på dag 1.
- Följande dag, dra avdelare på morgonen och samla in ägg vid middagstid.
- Överför dem till petriskålar och tillsätt 15 ml av pronas lösningen att dechorionate embryona.
- Inkubera embryon för 1-5 min tills cirka 60% av embryona har dechorionated. Stoppa reaktionen genom dekantering av pronas lösningen och tvätta embryona 3-4 gånger med färskt E3-medium.
- Inkubera dechorionated embryona i E3 vid RT O / N och låt dem att utveckla för att nå 10 somites scenen. Inkubera 50-60 embryon per kopplingen för att undvika olika utvecklings tillväxt. 4. Behandling
- Kontrollera embryon "utvecklingsstadiet under ett ljusfält mikroskop för att säkerställa att de är i 10 somites scenen.
- Med hjälp av en fluorescerande mikroskop med en röd fluorescerande protein (RFP) filter, isolera de röda embryon.
- Gå vidare till induktionen av den Cre-rekombination genom att tillsätta 10 uM av hydroxitamoxifen lösning på petriskål och inkubering av de isolerade embryon vid 28,5 ° C under 3 h.
- Dekantera den tamoxifen lösningen och tvätta embryon flera gånger med E3.
OBS! kassera tamoxifen lösningen i en särskild biologisk avfallsbehållare. - Inkubera embryon vid 28,5 ° CO / N.
- När embryona är ungefär 28-29 somites stadiet (cirka 24 timmar efter befruktning), inkubera embryona vid 28,5 ° C i E3-PTU lösning nedan.
OBS: PTU är här användas för att inhibera bildningen av melanoforer i utvecklingsembryon. Denna behandling är nödvändig för attundvika signal snedvridning av fluorescens genom auto-fluorescerande melanoforer. - Inkubera embryon vid 28,5 ° C
- Att visualisera färdigutvecklade kraniofaciala strukturer, välj embryon vid 4 dagar efter befruktningen för intensiteten hos den röda signalen och Cre uttryck markör positivitet (gul i näthinnan).
- Söva embryona med E3 / 0,015% tricaine lösning. Anestesi bekräftas när inga aktiva rörelser eller fin aktivitet observeras när försiktigt petade embryot.
- Överför det valda embryot för avbildning i en petriskål innehållande en droppe av metylcellulosa och försiktigt balsamera embryot med metylcellulosa.
- På en ren konfokal bild, placera en droppe av färsk metylcellulosa och montera din embryo inom släppa med hjälp av en microloader spets. Position embryo dorsalt med försiktighet inte röraembryot direkt.
- Täck monterad embryo med en 25 x 25 täckglas och justera positionen av embryot vid behov genom att manipulera täckglas.
- Embryot är nu klar för bilden.
- Använd 20x torr lins mål (numerisk bländare 0,75, pinhole storlek 2,0 pm) för att fokusera embryot.
- Tryck på L100-knappen på mikroskop och välj kanalerna i programvaran.
- Välj konfokala inställningar och klicka "auto" och välj följande kanaler innan du stänger fönstret: K1: GFP, Ch2: GFP, Ch3: RFP eller mCherry
- Slå på Ch2 och Ch3 innan du klickar på "ta bort spärr" -knappen. Klicka på "play" för att börja skanna.
- Fokus på struktur av intresse, som bäst sker genom att starta med ½ bild / sek och högspänning (HV) 150 och sedan justera inställningarna därefter tills önskad bildkvalitet är achieved. RFP skulle vara ljusare än andra färger, därför justera HV. Ändra Z-position för att hitta både YFP och RFP positiva celler.
- När set med inställningarna, fånga bilden av ditt embryo. Spara bilden i konfokala bildbehandlingsprogram format och TIFF-format för bildbehandling i varje delad kanal.
- Nästa, för den gemensamma fiskeripolitiken avbildning, stänga Ch2 och Ch3 och slå på Ch1. Och justera inställningarna som i steg 5 utan att ändra fokusområdet.
OBS: GFP kan vara riktigt svårt att upptäcka på grund av bakgrundssignalen i blått kanal som kan kringgås genom att justera hål storlek. Ett större hål storlek medger bättre detektering av fluorescens genom att reducera signal / bakgrundsbrusförhållande. Dock kommer en större hål minska confocal effekt, kompromissa med bildkvaliteten. Därför är noggrann justering av de inställningar som krävs för att uppnå den önskade bildkvaliteten och intensitet. - Fånga bilden och spara den i både format (konfokala programvara och TIFF) för bildbehandling. Bilder kan sedan bearbetas med hjälp av vanliga bildbehandlingsprogram för att sammanfoga lager och förbättra färginställningar som beskrivs av Pan och kollegor 8.
5. Embryo Selection
6. Montering av embryo i metylcellulosa
7. Analys med fluorescensmikroskopi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Traditionell brosk visualisering av hela mount alcianblått fläckar har varit ovärderligt att observera utvecklings Meckels brosk och som vanligen används för att visualisera slut cellulär organisation 12 (Figur 1A). För att ytterligare analysera utvecklings kondrocyter övertid, härstamning spårning med hjälp sox10: Kaede transgena linjer har gjort det möjligt för oss att studera cell migration, konvergens och förlängning i levande embryon 2,12 (Figur 1B). Men förblir organisationen av kondrocyter i kraniofaciala skelettstrukturen dåligt kända. Genom levande avbildning, är Zebrabow-M transgen linje kunna avslöja processen för kondrocyt interkalering och töjning som förmedlar utvidgning och tillväxten av Meckels brosk (Figur 1C-G).
I detta protokoll ubi: Zebrabow-M; sox10: ERT2-Cre embryon behandlades med tamoxifen vid 10 somiter och kondrocyter i underkäken visualiserades vid olika tidpunkter under utveckling (från 3 DPF till 5 DPF). Underkäken är bäst före ventralt att tillåta fri utsikt över Meckels brosk utan inblandning av ethmoid plattan och neurocranium dorsalt. De bibehålls stabilt och ärvda färger tillåter CNCC celler öde kartläggning lätt härstamning spårning och såsom anges med svarta pilar i fig 2A-2D. Den enda blå cell verkar migrera och inskjuta med dess angränsande celler. Det förlänger sedan längs främre-bakre axeln för att bilda en likformigt formad kondrocyt därmed upprätthålla den globala formen hos Meckels brosk när den sträcker sig anteriort.
Denna teknik gör det möjligt att studera underkäken tillväxt missbildningar på cell- och organnivå i tillstånd såsom Robin sekvens där mikrognati är en av de framträdande funktioner som beskrivs. Fel i proliferation, förlängning eller interkalering effektivt kan visualiseras i t Han växer kondrocyter över tiden.
| NaCI | 14,61 g |
| KCl | 0,65 g |
| CaCl2 | 1,83 g |
| MgSO 4 | 1,99 g |
| Avjoniserat H2O | 1000 ml |
| * Lagring: RT | |
| ** Tillsätt 1 droppe blå metylen som en anti-svamp | |
Tabell 1. 50X E3 embryonala medel recept
| 50X E3 | 20 ml |
| Avjoniserat H2O | 980 ml |
| * Lagring: RT | |
| 1M Tris-Cl (pH 9,5) | 9 ml |
| tricaine | 2 g |
| Avjoniserat H2O | Fyll upp till 1 L |
| * Lagring: RT | |
Tabell 3. 0,2% Tricaine recept
Figur 1. (A) Fluorescens Meckels brosk av sox10:.. GFP (B) dissekerade Meckels brosk av en 4 dpf Tübingen embryo färgas med Alcian Blue (C) transgena zebrafisk linjer UBI: Zebrabow-M kors med sox10: ERT2-cre. (GD) ubi: Zebrabow-M; sox10: ERT2-Cre bild i RFP (D), YFP (E), den gemensamma fiskeripolitiken (F) kanaler och sammanfoga (G). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. (AD) Timelapse fotografi av Zebrabow-M: sox10: ERT2-Cre vid 3dpf (A), 3.5dpf (B), 4dpf (C) och 5dpf (D). Svarta pilar pekar på samma enda klon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alcianblått och photoconvertible transgena linjer som beskrivits ovan kompletterar varandra för att definiera den komplicerade processen att brosk och ben utveckling. Dock har levande cellulär migration och organisation under organogenesen länge hypoteser och indirekt visat men aldrig visualiseras. Zebrabow-M transgen linje tillsammans med en brosk specifik Cre medger samtidig levande observation av alla dessa olika händelser som är involverade i ben- och broskbildning. Denna teknik gör det möjligt att studera underkäken tillväxtdefekter på cell- och organnivå i tillstånd såsom Robin sekvens där mikrognati är en av de framträdande funktioner som beskrivs. Fel i proliferation, förlängning eller interkalering effektivt kan visualiseras i de växande kondrocyterna över tiden.
Färg optimering mångfald
Optimera Cre nivåer genom att titrera koncentrationen av 4-hydroxitamoxifen kan styra EXTENton rekombination och färg mångfald utan att resultera i embryo dödlighet. Östrogen är avgörande för normal retinal utveckling och därför kan högre doser av tamoxifen (> 25 ^ m) inducerar näthinnan degeneration, hög dödlighet (~ 60 till 80%), kraniofaciala missbildningar och försenad utveckling. Dessutom är 4-hydroxitamoxifen utspädd i etanol, vilket i sig är giftig under embryonal utveckling 13. Därför är det viktigt att bestämma den bästa koncentrationen och varaktigheten av exponering för erhållande av en god rekombineringshastigheten men begränsa toxiciteten för embryon.
Den önskade koncentrationen av 4-hydroxitamoxifen har optimerats i detta protokoll. Olika koncentrationer (5-25 | iM), induktions tidpunkter (10 somiter, 24, 36 & 48 HPF) och varaktighet (30 min till 6 h) testades (data visas ej). En låg dos av tamoxifen (5 iM) producerade en begränsad rekombination medan högre doser (från 10 | iM till 20 ^ M) producerade simIlar rekombination och färg mångfald. Doser större än 20 iM äventyras normal utveckling av embryon och därför inte lämplig för att studera kraniofaciala missbildningar. Induktions löptider mindre än två timmar var inte tillräckligt för att skapa tillräcklig rekombination medan över 6 timmar induktions toxicitet och utvecklingsanomalier i embryon. Induktion för 3 eller 4 timmar inte skiljer sig i mängden rekombination och slutresultat.
Induktion efter 24 HPF fosterstadiet inte produceras önskad rekombination och fluorescerande uttryck. Därför var den bästa kompromissen mellan normal utveckling och lämplig mängd färger utan att resultera i betydligt stort antal embryonal dödlighet bestämdes till 3 timmar av induktion vid 10 somites med 10 | iM koncentration av tamoxifen.
Bildkvalitet
Erhålla konsekventa och högkvalitativa bilder kan vara en utmaning. Om ett enda fält av VIew är inte att visualisera hela Meckels brosk eller kraniofaciala strukturen av intresse, kan hela strukturen kartläggas genom att Z-stackar. Däremot kan erhålla Z-stackar vara utmanande i levande embryo avbildning på grund av rörelseartefakter. Därför är det viktigt att ha en kompromiss mellan kvaliteten på Z-stacken bild, den mängd information som krävs under avbildning session och förebyggande av laserinducerad fotoblekning under längre sikt laserexponering.
En annan begränsning hos denna teknik är att fluorescerande proteiner inte visar samma stabilitet under avbildning. Exempelvis RFP är en relativt stabil protein men YFP kan vara instabila. Därför är det viktigt att bestämma de bästa avbildningsinställningar empiriskt för att detektera det maximala antalet färger i en given embryo med lämplig intensitet.
Förutom färgstabilitet, är konfokalmikroskop en annan begränsning, eftersom det inte kan läsa den gemensamma fiskeripolitikenoch YFP kanaler tillsammans. Detta beror på det faktum att emissionen från GFP detekteras i både 470 nm och 535 nm kanaler. Dessutom emissionsspektrum för GFP (470-535nm) och excitationsspektrumet för YFP (530 nm) överlappar varandra, vilket skapar en FRET (fluorescensresonansenergiöverföring) artefakt. Med andra ord, när GFP fluorescens detekteras, exciterar det YFP-fluorescens på så sätt skapa en icke-specifik signal. Av denna anledning konturer detta protokoll skanna alla fluorescenskanaler var för sig och slå samman de enskilda bilderna separat med en gemensam bildbehandling programvara. För att kringgå begränsningarna för konfokalmikroskop, kan två fotoner mikroskop användas som beskrivs i Pan et al papper där alla tre fluorescens uttryck kan läsas samtidigt möjliggör mer färg mångfald 8. Pan et al har beskrivit ett brett spektrum av färg mångfald i sina Zebrabow-M rader (upp till 30 färger). Efter de förhållanden som beskrivs i denna protocol kan olika intensiteter av fluorescens och rekombinationer erhållas såsom visas i fig 2, även om vissa färg permutationer kan ha gått förlorade under efter bildbehandling.
Färg arv och klon analyser
Pan et al har beskrivit stabilt hållna färg arv i Zebrabow-M från stamfader till avkomma som möjliggör ödet kartläggning 8. Detta protokoll inriktat på neurala CNCC celler för att karakterisera bildandet av Meckels brosk. Användningen av CreERT2 i zebrafisk möjliggör effektiv tamoxifen inducerad loxP-kassett rekombination och förmågan att kontrollera uppkomsten av CNCC härstamning märkning under kraniofaciala utveckling. Denna metod kan lätt anpassas för att visualisera alla neurallist derivat förutom Meckels brosk. Dessutom med en annan transgen reporter linje för klonanalys i olika organsystem kommer att belysa olika moden av celltillväxt under organ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna tackar Alex Schier för vänligt dela Zebrabow-M transgen linje, Geoffrey Burns för pDEST vektorn och Renee Ethier-Daigle för utmärkt hand om fisken anläggningen och linjer.
FINANSIERING:
Vi är tacksamma för generösa finansieringsstöd från NIDCR RO3DE024490 och Shriners Hospitals for Children (ECL) och postdoktorsutbildningsstipendier från Shriners Hospitals for Children (LR och YK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
- McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
- Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Vieira, A. R. Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
- Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
- Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).
