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Developmental Biology

Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

doi: 10.3791/52935 Published: October 21, 2015
* These authors contributed equally

Summary

Zellorganisation von Gesichtsschädelknochen war lange vermutet worden, aber nie direkt sichtbar gemacht. Multi-Spektral-Zellmarkierung und in vivo-Live- Bildgebung ermöglicht Visualisierung dynamischer Zellverhalten im Zebrafisch Unterkiefer. Hier haben wir ausführlich das Protokoll zu manipulieren Zebrabow transgene Fische und direkt zu beobachten Zell Einlagerung und morphologischen Veränderungen der Knorpelzellen in der Meckel-Knorpel.

Abstract

Entwicklung der Wirbeltiere kraniofazialen Strukturen erfordert eine genaue Abstimmung der Zellmigration, Proliferation, Adhäsion und Differenzierung. Strukturieren der Meckel-Knorpel, einem ersten Schlundbogen-Derivat, beinhaltet die Migration der Schädel Neuralleiste (CNC) Zellen und die fortschreitende Partitionierung, Proliferation und Organisation von differenzierten Chondrozyten. Mehrere Studien haben CNC Migration während der Unterkiefer Morphogenese beschrieben, aber die Details, wie die Chondrozyten zu erreichen Organisation in das Wachstum und die Erweiterung der Meckel-Knorpel, bleibt unklar. Die Sox10 beschränkt und chemisch induzierte Cre-Rekombinase-vermittelte Rekombination erzeugt Permutationen von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen (RFP, YFP und CFP), wodurch die Schaffung eines multispektralen Kennzeichnung von Vorläuferzellen und deren Nachkommen, was deutliche Klonpopulationen. Mittels konfokaler Zeitraffer-Fotografie, ist es möglich, die Chondrozyten beobachten behavioder während der Entwicklung des Zebrafisches Meckel-Knorpel.

Multispektrale Zellmarkierung ermöglicht es Wissenschaftlern auf eine Verlängerung des Meckel-Chondrozyten zu demonstrieren. Während der Extensionsphase des Meckel-Knorpel, der den Unterkiefer vorwegnimmt, interkalieren Chondrozyten zu Verlängerung zu bewirken, wie sie in einer organisierten Einzelzellschicht Reihe stapeln. Die Nichtbeachtung dieser organisierten interkalierenden Prozess zur Zellerweiterung vermitteln, bietet das Mobil mechanistische Erklärung für die hypoplastischen Unterkiefer, die wir in der Unterkieferfehlbildungen zu beobachten.

Introduction

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Kraniofazialen Entwicklung erfordert komplexe molekularer, zellulärer und Gewebe-Wechselwirkungen, die Zellproliferation, Migration und Differenzierung 1,2, 3 fahren. Diese streng reguliert und komplexer Prozess unterliegt genetischen und umweltbedingten Störungen, so dass kraniofazialen Fehlbildungen gehören zu den häufigsten Geburtsfehlbildungen 1-9. Während chirurgischer Eingriffe bleiben die Hauptstütze der Behandlung für kraniofaziale Anomalien, das Verständnis der Entwicklung Basis ist wichtig, um zukünftige Therapien zu innovieren. Daher Studium der Morphogenese und die Mechanismen in der Konvergenz und der Erweiterung und Zell Integration bietet neue Einblicke in die Bildung des kraniofazialen Skeletts 1.

Schädel Neuralleiste migrieren und Füllen der ersten Schlundbogen, dann gepaart bilden Kiefer Prozesse, die zur Meckel-Knorpel, der den Unterkiefer vorwegnimmt bilden verlängern. Morphogenese of der Meckel-Knorpel benötigt Chondrozyten-Organisation über Richtungsproliferation, Zellpolarisation und Differenzierung 1,10. Allerdings bleibt die Komplexität der Chondrozyten-Organisation in das Wachstum und die Erweiterung des Meckel-Knorpel unklar. Grundlegendes zu dynamischen Zellverhalten ist entscheidend für das Verständnis angeborene Fehlbildungen betroffen Kiefergröße, wie hypoplastische Mandibula Phänotypen 11.

Zebrafischembryonen bieten viele Entwicklungs- und genetische Vorteile für die detaillierte Untersuchung der Meckel-Knorpel Morphogenese. Ihre genetische Lenkbarkeit, Transparenz, ex vivo und schnelle Entwicklung sind leistungsstarke Vorteile verleiht ihm auch zur Beobachtung der Zellbewegung und Organisation von Live-Imaging-6. Verwendung Linie-Tracing-Tools, wie Sox10: kaede transgene Linie, haben wir und andere der Neuralleiste Ursprünge der embryonalen kraniofazialen Skeletts 1,5 abgegrenzt. Using der Sox10: ERT2-Cre mit dem ubi: Zebrabow-M transgene Linie, ist es nun möglich, um Details des Zellbewegungen während kraniofazialen Entwicklung zu erforschen. Die Zebrabow-M, eine transgene Linie mit der Ubiquitin-Promotor, der die Expression von verschiedenen Fluorophore, die jeweils von Lox-Stellen flankiert 8 entwickelt. Die Zebrabow-M Standard Fluorophor Rot, RFP ausdrückt. Nach Induktion der Cre-Expression, die Zebrabow-M zu konstruieren rekombiniert und Zellen exprimieren eine Kombination von verschiedenen Fluorophoren (RFP, CFP und YFP) Erzeugen multispektraler Expression im Embryo. Alle Tochterzellen, die von den markierten Zellen nach dem Rekombinationsereignis teilen werden dann klonal beschriftet, so dass die Zellpopulationen, die aus verschiedenen nebeneinander liegenden Vorläuferzellen abgeleitet werden klonal beschriftet. Durch diese Klonierung Markierung von Zellen, können die Zellen-Proliferation und Migration mit klonaler Auflösung (Abbildung 1 und 2) eingehalten werden.

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Protocol

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Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigt alle Verfahren unter Protokollnummer # 2010N000106. Dies ist im Einklang mit der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung von Laboratory Animal Care International (AAALAC) Richtlinien.

1. Reagenzien und Materialien Vorbereitung

  1. Bereiten Sie 1 l 50X E3 Embryo Medium (siehe Tabelle 1) und bereiten 1 l 1X E3 Embryo Medium (siehe Tabelle 2).
  2. Vorbereitung E3 Embryo Medium mit N-Phenylthioharnstoff (PTU), die durch Zugabe von 30 mg PTU zu 1 l 1X E3. Stir O / N, um sicherzustellen, daß die PTU vollständig gelöst hat. Lagern bei RT.
  3. Auf Pronase-Lösung herzustellen, verdünnter 150 ul Pronase (0,5 mg / ml) mit 15 ml 1X E3. Diese Menge reicht für 1 Petrischale. Verwenden Sie sofort.
  4. Bereiten Methylcellulose-Lösung.
    1. Vorbereitung E3-Tricaine Lösung durch Mischen von 75 ml 0,2% Tricaine mit 25 ml1X E3. Sieden 3 g Methylcellulose in 75 ml E3-Tricaine Lösung.
    2. Bilden das Endvolumen auf 100 ml mit E3-Tricaine Lösung. Die endgültige Methylcelluloselösung ist viskos und opak mit einem gelblichen Farbton. Lagerung: RT lichtgeschützt.
  5. Tamoxifen Lager und Induktionslösung
    1. Vorbereitung 5 mM Tamoxifen Stammlösung durch Auflösen von 4-Hydroxytamoxifen in 100% Ethanol. Shop Lager bei -80 ° C.
    2. Bereiten Sie frische Verdünnung von Tamoxifen auf den Wunsch Konzentration in 1X E3, um die Induktion Lösung zu erhalten. VORSICHT! Bitte wenden Sie sich vor dem Gebrauch MSDS.
  6. Bereiten Sie 1 l 0,2% Tricaine gemäß Tabelle 3.
  7. Erhalten konfokalen Rutschen. Kleben Sie vier Deckglas (18 x 18) zusammen, um einen Block zu bilden dann legen Sie 2 Blocks auf einem 24 x 60 Deckglas 2 cm voneinander entfernt, damit die Montage des Embryos in der Mitte.

2. Embryo Vorbereitung

  1. Transgenen Linien.
  2. Sox10: ERT2-Cre
    HINWEIS: Generieren Sie die Targeting-Vektor pDestTol2- Sox10: ERT2-Cre unter Verwendung von Standardverfahren und molekulare Klonierung kommerziell erhalten Rekombination Cloning-Technologie.
    1. Kombinieren Sie 5 "entry clone (pENTR5'- sox10p) enthält 7.2Kb des Sox10-Promotor, eine Gateway-Mitte-Klon (PME-ERT2-Cre) und eine 3'-entry clone (pENTR3'-polyA) in einer LR-Reaktion mit Objektiv Ziel vector pDestTol2- α-Kristallin: YFP.
    2. Reinige Konstrukt pDestTol2- Sox10: ERT2-Cre. Co-einspritzen des gereinigten Konstrukts (100 ng / ul) mit Tol2 Transposase mRNA (50 ng / & mgr; l) in WT Embryonen (F0) an dem einen Zellstadium.
    3. Screen F0 Erwachsenen Gründer für Keimbahn-Übertragung auf der Grundlage starker gelber Fluoreszenz in F1 Embryonen.
  3. Sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M
    1. Outcross die Zebrabow-MLinie (2.1.1) mit der Sox10: ERT2-Cre transgene Linie.
    2. Wählen Sie die Embryonen eine starke allgegenwärtigen RFP Ausdruck und YFP Linsenmarkierung und wachsen sie, bis Erwachsenen zeigt.

3. Embryonen

  1. Richten Sie mehrere Paare von Sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M transgenen Zebrafisch von 17.00 bis 06.00 Uhr am Tag 1.
  2. Am folgenden Tag, ziehen Sie die Teiler in der Früh und sammeln die Eier um die Mittagszeit.
  3. Übertragen Sie sie auf Petrischalen und fügen Sie 15 ml des Pronaselösung, um die Embryonen dechorionate.
  4. Die Embryonen für 1 bis 5 min inkubieren, bis ca. 60% der Embryonen wurden dechorionated. Die Reaktion durch Dekantieren der Pronaselösung und waschen Sie die Embryonen 3-4 mal mit frischem E3 Medium.
  5. Inkubieren Sie die dechorionated Embryonen in E3 bei RT O / N und lassen Sie sie zu entwickeln, um die 10 Somiten Stadium zu erreichen. Inkubieren 50-60 Embryonen pro Gelege zu verschiedenen Entwicklungswachstum zu vermeiden.
  6. 4. Behandlung

    1. Überprüfen Entwicklungsstadium der Embryonen unter einem Lichtfeld-Mikroskop, um sicherzustellen, sie sind auf dem 10 Somiten Stadium.
    2. Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit einem rot fluoreszierendes Protein (RFP) Filter, isolieren die leuchtend roten Embryonen.
    3. Verfahren zur Induktion des Cre-Rekombination durch Zugabe von 10 uM Hydroxytamoxifen Lösung in eine Petrischale und Inkubieren der isolierten Embryonen bei 28,5 ° C für 3 Stunden.
    4. Dekantiert man die Tamoxifen-Lösung und waschen Sie die Embryonen mehrmals mit E3.
      VORSICHT! verwerfen die Tamoxifen-Lösung in einem speziellen biologischen Abfallbehälter.
    5. Die Embryonen Inkubation bei 28,5 ° CO / N.
    6. Wenn die Embryonen sind ungefähr 28-29 Somiten Stadium (etwa 24 Stunden nach der Befruchtung), Inkubation der Embryonen bei 28,5 ° C in der E3-PTU-Lösung Jenseits.
      HINWEIS: PTU hier verwendet, um die Bildung von Melanophoren in den sich entwickelnden Embryonen zu hemmen. Diese Behandlung notwendig istvermeiden Sie die Signalverzerrung der Fluoreszenz von Autofluoreszenz Melanophoren.
    7. Die Embryonen Inkubation bei 28,5 ° C

    5. Embryonenauswahl

    1. Um die ausgereifte kraniofazialen Strukturen sichtbar zu machen, wählen Sie die Embryonen im 4 Tage nach der Befruchtung für die Intensität des roten Signals und Cre Expressionsmarker Positivität (gelb in der Netzhaut).
    2. Betäuben die Embryonen mit E3 / 0,015% Tricaine Lösung. Anästhesie wird bestätigt, wenn keine aktiven Bewegungen oder fin-Aktivität beobachtet wird, wenn sanft Drängen des Embryos.

    6. Montage der Embryo in Methylcellulose

    1. Übertragung der gewählten Embryo zur Bildgebung in eine Petrischale gegeben, die einen Tropfen von Methylcellulose und sanft embalm den Embryo mit Methylcellulose.
    2. Auf eine saubere konfokalen Rutsche, einen Tropfen von frischem Methylcellulose und montieren Ihren Embryo innerhalb der Tropfen mit Hilfe eines Microloader Spitze. Position Embryo dorsal unter Vorsicht, nicht zu berührender Embryo direkt.
    3. Decken Sie die montierten Embryo mit einer 25 x 25 Deckglas und die Position des Embryos ggf. durch Manipulation des Deckglases.
    4. Der Embryo ist nun bereit, image.

    7. Analyse durch Fluoreszenzmikroskopie

    1. Nutzen Sie die 20-fach trockenen Linsenobjektiv (numerische Apertur 0,75; Lochblendengröße 2,0 um) zum Fokussieren des Embryos.
    2. Drücken Sie die L100-Taste auf dem Mikroskop und wählen Sie die Kanäle in der Software.
    3. Wählen Sie das konfokale Setup-Taste und klicken Sie auf 'auto' und wählen Sie die folgenden Kanäle vor dem Schließen des Fensters: Ch1: CFP, Kanal 2: GFP, Ch3: RFP oder mCherry
    4. Schalten Sie CH2 und CH3, bevor Sie auf die 'entfernen Interlock "-Taste. Klicken Sie auf "Play", um das Scannen zu beginnen.
    5. Konzentrieren Sie sich auf Struktur von Interesse, die sich am besten, indem Sie mit ½ Rahmen / s und Hochspannung (HV) 150 und dann die Einstellungen entsprechend durchgeführt wird, bis die gewünschte Bildqualität achieved. Der RFP wäre heller als andere Farben, damit die HV einzustellen. Ändern Sie die Z-Position, um sowohl YFP und RFP-positiven Zellen zu finden.
    6. Sobald Sie mit den Einstellungen festgelegt, erfassen Sie das Image Ihres Embryos. Speichern Sie Ihr Bild in der konfokalen Imaging-Software-Format und TIFF-Format für die Bildverarbeitung in jedem Split-Kanal.
    7. Als nächstes wird für CFP-Bildgebung, schalten Sie CH2 und CH3, und schalten Sie Ch1. Durch Veränderung der Einstellungen wie in Schritt 5 ohne Änderung des Fokusbereichs.
      HINWEIS: CFP kann wirklich schwer zu erkennen aufgrund von Hintergrundsignal in blauen Kanal, der durch Einstellen der Lochblendengröße umgangen werden kann. Eine größere Lochblendengröße ermöglicht eine bessere Detektion der Fluoreszenz durch die Reduzierung Signal / Rausch-Verhältnis. Allerdings wird eine größere Pinhole konfokalen Effekt zu reduzieren, Kompromisse bei der Bildqualität. Daher ist eine sorgfältige Einstellung der Einstellungen erforderlich ist, um die gewünschte Bildqualität und Intensität zu erreichen.
    8. Nehmen Sie das Bild und speichern Sie es in der sowohl Format (konfokalen Software und TIFF) für die Bildverarbeitung. Bilder können dann mit gängigen Bildverarbeitungssoftware, um Schichten zusammenzuführen und zur Verbesserung der Farbeinstellungen, wie Pan und Kollegen 8 beschrieben verarbeitet werden.

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Representative Results

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Traditionelle Knorpel Visualisierung ganze Berg Alcianblau Flecken ist von unschätzbarem Wert bei der Beobachtung der Entwicklung von Meckel-Knorpel und häufig verwendet, um endgültige zelluläre Organisation 12 (1A) zu visualisieren. Um die Entwicklung von Knorpelzellen weiter zu analysieren Überstunden, Linie Tracing mit Sox10: Kaede transgenen Linien hat uns ermöglicht, die Zellmigration, Konvergenz und Extension im Live-Embryonen 2,12 (1B) zu studieren. Allerdings bleibt die Organisation der Chondrozyten in der kraniofazialen Skelettstruktur kaum verstanden. Durch die Echtzeit-Bildgebung ist die Zebrabow-M transgene Linie in der Lage, den Prozess der Chondrozyten-Einlagerung und Dehnung, die die Erweiterung und das Wachstum der Meckel-Knorpel (1C-G) vermittelt zu offenbaren.

In diesem Protokoll UBI: Zebrabow-M; Sox10: ERT2-Cre Embryonen wurden mit Tamoxifen mit 10 Somiten und chondro behandeltenzyten im Unterkiefer wurden zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung sichtbar gemacht (von 3 dpf bis 5 dpf). Der Unterkiefer ist am besten ventral Bild zu klarem Blick auf die Meckel-Knorpel ohne die Einmischung des Siebbeins Platte und Neurocranium dorsal ermöglichen. Die stabil beibehalten und vererbt Farben ermöglichen eine einfache Linienverfolgung und CNCC Zellen Schicksal Mapping, wie durch die schwarzen Pfeile in 2A bis 2D dargestellt. Die einzelnen blauen Zelle angezeigt zu migrieren und interkalieren mit seinen Nachbarzellen. Es verlängert sich dann entlang der anterior-posterioren Achse, um eine gleichmäßig geformte Chondrozyten bilden somit die globale Form der Meckel-Knorpel beibehalten, wie es nach vorn erstreckt.

Diese Technik erlaubt die Untersuchung der Unterkieferwachstum Bildungen auf zellulärer und Organebene in Bedingungen wie Robin-Sequenz in dem Mikrogenie ist eines der herausragenden Merkmale beschrieben. Die Nichtbeachtung der Proliferation, Erweiterung oder Einlagerungs effektiv in t visualisiert werden er wachsenden Knorpelzellen im Laufe der Zeit.

NaCl 14,61 g
KCl 0,65 g
CaCl 2 1,83 g
MgSO4 1,99 g
Entionisiertem H 2 O 1,000 ml
* Lagerung: RT
** Als ein Anti-Pilz-1 Tropfen Methylenblau

Tabelle 1 50X E3 embryonalen Medium Rezept

50X E3 20 ml
Entionisiertem H 2 O 980 ml
* Lagerung: RT
nt "> Tabelle 2 1X E3 embryonalen Medium Rezept

1M Tris-Cl (pH 9,5) 9 ml
Tricaine 2 g
Entionisiertem H 2 O Auf 1 L
* Lagerung: RT

Tabelle 3. 0,2% Tricaine Rezept

Abbildung 1
Abbildung 1. (A) Fluoreszenz Meckel-Knorpel Sox10:.. GFP (B) Dissected Meckel-Knorpel eines 4 dpf Tübingen Embryo mit Alcianblau angefärbt (C) Transgenic Zebrafischlinien ubi: Zebrabow-M Kreuz mit Sox10: ERT2-cre. (DG) ubi: Zebrabow-M; Sox10: ERT2-Cr-e Bild in RFP (D), YFP (E), GFP (F) Kanäle und Zusammenführen (G). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. (AD) Timelapse Fotografie von Zebrabow-M: Sox10: ERT2-Cre in 3dpf (A), 3.5dpf (B), 4dpf (C) und 5dpf (D). Schwarze Pfeile zeigen auf die gleiche einzigen Klon. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Alcianblau und Photokonvertierbare transgenen Linien wie oben beschrieben, gegenseitig ergänzt den komplizierten Prozess der Knorpel- und Knochenentwicklung zu bestimmen. Allerdings hat Live-Zellmigration und Organisation während der Organogenese lange vermutet worden und indirekt nachgewiesen, aber nie visualisiert. Zebrabow-M transgene Linie gepaart mit einer Knorpel spezifischen Cre ermöglicht die gleichzeitige Live-Beobachtung aller dieser verschiedenen Ereignisse im Knochen- und Knorpelbildung beteiligt. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Unterkieferwachstum Defekte auf zellulärer und Organebene in Bedingungen wie Robin-Sequenz, wo Mikrogenie ist eine der hervorstechenden Eigenschaften beschrieben. Die Nichtbeachtung der Proliferation, Erweiterung oder Einlagerungs effektiv in den wachsenden Knorpelzellen im Laufe der Zeit sichtbar gemacht werden.

Farbvielfalt Optimierung

Optimierung Cre Ebenen durch Titration der Konzentration an 4-Hydroxytamoxifen kann exten steuernt der Rekombination und Farbvielfalt, ohne zu Embryoletalität. Östrogen ist entscheidend für die normale Entwicklung der Retina und daher können höhere Dosen von Tamoxifen (> 25 um) Netzhaut-Degeneration, erhöhter Sterblichkeit (~ 60-80%), kraniofazialen Fehlbildungen und Entwicklungsverzögerungen zu induzieren. Zusätzlich ist 4-Hydroxytamoxifen in Ethanol, die in sich selbst während der Embryonalentwicklung 13 toxischen verdünnt. Daher ist es wichtig, die beste Konzentration und Dauer der Exposition, um eine gute Rekombinationsrate zu erhalten festzustellen, aber die Toxizität für Embryonen begrenzen.

Die gewünschte Konzentration von 4-Hydroxytamoxifen ist in diesem Protokoll optimiert. Verschiedenen Konzentrationen (5-25 uM), Induktionszeitpunkten (10 Somiten, 24, 36 und 48 hpf) und Dauer (30 Minuten bis 6 Stunden) wurden getestet (Daten nicht gezeigt). Eine geringe Dosis von Tamoxifen (5 & mgr; M) erzeugte eine begrenzte Rekombination während höhere Dosen (von 10 um bis 20 um) hergestellt simIlar Rekombination und Farbvielfalt. Dosen von mehr als 20 uM beeinträchtigt die normale Entwicklung von Embryonen und daher nicht für die Untersuchung kraniofazialen Mißbildungen geeignet. Induktionsdauer von weniger als 2 Stunden nicht ausreichten, um angemessene Rekombination zu schaffen, während mehr als 6 Stunden der Induktion induzierte Toxizität und Entwicklungsstörungen bei den Embryonen. Induktions für 3 oder 4 Stunden nicht in der Menge der Rekombination und den Ergebnissen unterscheiden.

Induktion nach der 24 HPF Embryonalstadium nicht gewünschte Rekombination und fluoreszierende Ausdruck produziert. Daher der beste Kompromiss zwischen der normalen Entwicklung und geeignete Menge von Farben, ohne daß es deutlich hohe Zahlen der embryonalen Sterblichkeit bestimmt wurde 3 h Induktion bei 10 Somiten mit einer 10 uM-Konzentration von Tamoxifen ist.

Bild Qualität

Beziehen konsistente und qualitativ hochwertige Bilder kann eine Herausforderung sein. Wenn ein einzelnes Feld der view nicht in der Lage, das gesamte Meckel-Knorpel oder kraniofazialen Struktur von Interesse zu visualisieren, kann die gesamte Struktur, indem sie Z-Stapel zugeordnet werden. Allerdings Erhalt Z-Stapel kann eine Herausforderung mit lebenden Embryo Bildgebung aufgrund von Bewegungsartefakten. Daher ist es wichtig, einen Kompromiß zwischen der Qualität des Bildes der Z-Stapels, die Menge an Informationen, die während der Bildgebungssitzung und Prävention von laserinduzierten Photobleaching während längerfristig Laserbelichtung erforderlich.

Eine weitere Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass fluoreszierende Proteine ​​nicht die gleiche Stabilität während der Bilderzeugung zu zeigen. Beispiels RFP ist ein relativ stabiles Protein YFP aber instabil sein kann. Daher ist es wichtig, die beste Abbildungseinstellungen empirisch bestimmen, um die maximale Anzahl von Farben in einem gegebenen Embryo mit geeigneter Intensität zu detektieren.

Neben der Farbstabilität ist der konfokalen Mikroskops eine weitere Einschränkung, weil sie nicht in der Lage, die GFP zu lesen istund YFP Kanäle zusammen. Dies ist aufgrund der Tatsache, daß die Emission von CFP in beiden 470 nm und 535 nm-Kanäle detektiert. Zusätzlich kann das Emissionsspektrum der CFP (470-535nm) und das Anregungsspektrum des YFP (530 nm) überlappen, wodurch eine FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) Artefakt. In anderen Worten, wenn das GFP-Fluoreszenz nachgewiesen wird, regt es YFP-Fluoreszenz somit ein nicht-spezifisches Signal erzeugt wird. Aus diesem Grund Konturen dieses Protokoll scannen alle Fluoreszenzkanäle getrennt waren und die Zusammenführung der Einzelbilder getrennt mit einem gemeinsamen Bildverarbeitungssoftware. Um die Einschränkungen des konfokalen Mikroskops zu umgehen, kann ein Zwei-Photonen-Mikroskop verwendet werden, wie in Pan et al das Papier in dem alle drei Fluoreszenz Ausdrücke können gleichzeitig gelesen werden und so für mehr Farbvielfalt 8 beschrieben. Pan et al hat ein großes Spektrum an Farbvielfalt in ihren Zebrabow-M-Leitungen (bis zu 30 Farben) beschrieben. Entsprechend den in dieser prot beschriebenen BedingungenOcol, unterschiedliche Intensitäten der Fluoreszenz und Rekombinationen können wie in Figur 2 gezeigt, erhalten werden, obwohl einige Farb Permutationen können während der Nach-Bildverarbeitung verloren wurden.

Farbe Vererbung und klonalen Analysen

Pan et al hat die stabil aufrechterhalten Farbvererbung in Zebrabow-M von Vorläufer Nachkommen, die für das Schicksal Mapping 8 erlaubt beschrieben. Das Protokoll über die neuronalen CNCC Zellen konzentriert, um die Bildung der Meckel-Knorpel zu charakterisieren. Die Verwendung von CreERT2 im Zebrafisch ermöglicht eine effiziente Tamoxifen induzierte loxP-Kassette Rekombination und der Fähigkeit, das Auftreten von CNCC Linie Etikettierung während kraniofazialen Entwicklung zu steuern. Dieses Verfahren kann leicht angepasst, um alle Neuralleiste Derivate neben der Meckel-Knorpel zu visualisieren. Darüber hinaus mit einem anderen transgenen Reporter Linie für klonalen Analyse in verschiedenen Organsystemen werden verschiedene m markierenOden von Zellwachstum während der Organogenese.

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Acknowledgments

Die Autoren danken Alex Schier für die freundliche Aufteilung der Zebrabow-M transgene Linie, Geoffrey Verbrennungen für den pDest Vektor und Renee Ethier-Daigle für hervorragende Betreuung der Fische Anlage und Leitungen.

FINANZIERUNG:

Wir sind dankbar für die großzügige finanzielle Unterstützung von NIDCR RO3DE024490 und Shriners Hospitals for Children (ECL) und Post-Doc-Ausbildungsstipendien von Shriners Hospitals for Children (LR und YK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pronase Roche Life Sciences 10165921001 Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml
Methylcellulose Sigma-Aldrich M0262
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7619
Tricaine Sigma-Aldrich E10521
4-HydoxyTamoxifen Sigma-Aldrich T176
24 x 60 coverslips Fisher Scientific 12-548-5P
18 x 18 coverslips Fisher Scientific 12-540A
25 x 25 coverslips Fisher Scientific 12-540C
pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit Life technologies  K591-20
pENTR/D-TOPO Cloning Kit  Life Technologies K2400-20
pENTR3'-pA Tol2Kit 302
pDEST Gift from Geoffrey Burns labs
Bright field microscope 
Fluorescent microscope 
Confocal microscope
Image processing software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Cite this Article

Rochard, L. J., Ling, I. T. C., Kong, Y., Liao, E. C. Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel’s Cartilage. J. Vis. Exp. (104), e52935, doi:10.3791/52935 (2015).More

Rochard, L. J., Ling, I. T. C., Kong, Y., Liao, E. C. Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel’s Cartilage. J. Vis. Exp. (104), e52935, doi:10.3791/52935 (2015).

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