Summary
Organização celular dos ossos craniofaciais tem sido a hipótese, mas nunca diretamente visualizado. Rotulagem célula multi-espectral e in vivo ao vivo imaging permite a visualização do comportamento das células dinâmica no peixe-zebra maxilar inferior. Aqui, nós detalhe o protocolo para manipular Zebrabow peixes transgénicos e observar diretamente intercalação celular e alterações morfológicas de condrócitos na cartilagem de Meckel.
Abstract
Desenvolvimento das estruturas craniofaciais vertebrados requer uma coordenação precisa de migração celular, a proliferação, a adesão e a diferenciação. Padronização da cartilagem de Meckel, um primeiro arco derivado da faringe, envolve a migração das células da crista neural cranial (CNC) e do particionamento progressiva, proliferação e organização dos condrócitos diferenciados. Vários estudos têm descrito a migração CNC durante inferior morfogênese mandíbula, mas os detalhes de como alcançar os condrócitos organização no crescimento e extensão da cartilagem de Meckel permanece obscuro. O SOX10 restrito e Cre recombinase mediada por recombinação induzida quimicamente gera permutações de proteínas fluorescentes diferentes (RFP, YFP e PCP), criando, assim, um rótulo multi-espectral de células progenitoras e a sua descendência, que reflecte as populações clonais distintos. Usando fotografia confocal time-lapse, é possível observar os condrócitos behaviou durante o desenvolvimento da cartilagem do peixe-zebra de Meckel.
Rotulagem célula Multispectral permite aos cientistas demonstrar extensão de condrócitos de Meckel. Durante a fase de extensão da cartilagem de Meckel, o que prefigura a mandíbula, condrócitos intercalar para efetuar extensão como eles se comportam em uma fileira em camadas de uma única célula organizada. A falha deste processo de intercalação organizado para mediar extensão célula fornece a explicação mecanicista celular para mandíbula hipoplásica que observamos em malformações mandibulares.
Introduction
Desenvolvimento craniofacial requer, interacções celulares e teciduais moleculares complexas para conduzir a proliferação celular, migração e diferenciação 1,2, 3. Este processo bem regulado e complexo está sujeito a perturbações genéticas e ambientais, de tal forma que deformidades craniofaciais estão entre as malformações congénitas mais comuns 1-9. Enquanto intervenções cirúrgicas continuam a ser a base do tratamento para anomalias craniofaciais, compreender a base de desenvolvimento é essencial para inovar futuras terapias. Portanto, estudar a morfogênese e os mecanismos para a convergência e extensão e integração de células proporciona novos insights sobre a formação do esqueleto craniofacial 1.
Cranial migração e de crista neural preencher o primeiro arco faríngeo, processos mandibulares então formar pares que se estendem para formar cartilagem de Meckel, o que prefigura a mandíbula. Morfogênese of cartilagem de Meckel exige organização dos condrócitos via proliferação direcional, polarização e diferenciação celular 1,10. No entanto, a complexidade da organização dos condrócitos no crescimento e extensão da cartilagem de Meckel permanece obscuro. Entender o comportamento de células dinâmica é fundamental para compreender malformações congênitas que afetam o tamanho da mandíbula, como fenótipos mandibulares hipoplásicos 11.
Zebrafish embriões oferecem muitas vantagens de desenvolvimento e genéticos para estudo detalhado da cartilagem de Meckel morfogênese. Sua rastreabilidade genética, transparência, ex vivo e rápido desenvolvimento são vantagens poderosas emprestando-lhe bem para observação do movimento celular e organização de imagens ao vivo 6. Usando ferramentas de rastreamento de linhagem, tais como: SOX10 linhagem transgênica kaede, nós e outros delinearam as origens da crista neural do esqueleto craniofacial embrionário 1,5. Using a SOX10: ERT2-Cre com o ubi: linhagem transgênica Zebrabow-M, é agora possível explorar detalhes de movimentos celulares durante o desenvolvimento craniofacial. O Zebrabow-H, é uma linha transgénica desenvolvida com o promotor da ubiquitina que conduz a expressão de fluoróforos diferentes, cada um flanqueado por locais lox 8. O fluoróforo padrão Zebrabow-M é Vermelho, expressando RFP. Após indução da expressão de Cre, o Zebrabow-H construir recombina e células expressam uma combinação de diferentes fluoróforos (RFP, CFP e YFP), criando expressão multi-espectral no embrião. Todas as células filhas que dividem a partir das células marcadas após o evento de recombinação são então clonalmente marcado, de modo que as populações de células que derivam de diferentes progenitoras justapostas são clonalmente marcado. Por esta marcação celular clonagem, células proliferação e migração com resolução clonal pode ser seguido (Figura 1 e 2).
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Protocol
Cuidado e Uso Comitê Massachusetts General Hospital Institucional Animal (IACUC) aprovou todas as operações sob o protocolo de número # 2010N000106. Isso está em conformidade com a Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC) orientações.
1. Os reagentes e materiais de preparação
- Prepare 1 L de 50X meio de embrião E3 (Ver Tabela 1) e preparar-se 1 L de meio de embrião E3 1X (Ver Tabela 2).
- Prepare meio embrião E3 com N-feniltioureia (PTU) por adição de 30 mg de PTU a 1 L de 1X E3. Agitar O / N para assegurar que o PTU se ter dissolvido completamente. Armazenar à temperatura ambiente.
- Para preparar a solução de pronase, diluir 150 uL de pronase (0,5 mg / ml) com 15 ml de 1X E3. Este montante é suficiente para uma placa de Petri. Utilizar imediatamente.
- Prepare solução de metilcelulose.
- Preparar a solução E3-tricaina por mistura de 75 ml de 0,2% com 25 ml tricaina1X da E3. Ferver 3 g de metilcelulose em 75 ml de solução E3-tricaina.
- Completar o volume final de 100 ml com solução E3-tricaina. A solução final metilcelulose é viscosa e opaco com uma tonalidade amarelada. Armazenamento: RT protegido contra a luz.
- Estoque Tamoxifen e solução de indução
- Prepare 5 mM de solução stock de tamoxifeno por dissolução de 4-hidroxitamoxifeno em etanol a 100%. Estoque armazenar a -80 ° C.
- Preparar fresco diluição de Tamoxifen à concentração desejo em 1X E3 para obter a solução de indução. CUIDADO! Por favor, consultar o MSDS, antes de usar.
- Prepare 1 L de 0,2% tricaina conforme indicado na Tabela 3.
- Obter lâminas confocal. Cole quatro lamela (18 x 18) em conjunto para formar um bloco, em seguida, colocá-2 em blocos de 24 x 60 cm de distância lamela 2 para permitir a montagem do embrião no meio.
2. Preparação de Embriões
- Linhagens transgênicas.
- SOX10: ERT2-Cre
NOTA: Gerar o vector alvo pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre usando métodos de clonagem molecular padrão e comercialmente obtido recombinação tecnologia de clonagem.- Combinar 5 'clone de entrada (pENTR5'- sox10p) contendo o promotor de 7.2Kb SOX10, um clone meio Gateway (PME-ERT2-Cre), e uma 3' do clone de entrada (pENTR3'-poliA) numa reacção com LR destino lente vetor pDestTol2- α-cristalina: YFP.
- Purificar construto pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre. A co-injectar o construto purificado (100 ng / ul) com Tol2 ARNm da transposase (50 ng / ul) em embriões de WT (F0) no estádio de uma célula.
- Tela fundadores F0 adultos para a transmissão da linha germinal com base na forte fluorescência amarela em embriões de F1.
- SOX10: ERT2-Cre; Zebrabow-M
- Outcross o Zebrabow-Mline (2.1.1) com a SOX10: linhagem transgênica ERT2-Cre.
- Selecionar embriões que apresentam uma forte expressão RFP onipresente e marcador lente YFP e cultivá-las até adultos.
Coleção 3. Embryo
- Configure vários pares de SOX10: ERT2-Cre; Zebrabow-M peixes-zebra transgénicos cinco horas - seis horas no Dia 1.
- No dia seguinte, retire os divisores de manhã e recolher os ovos em torno de meio-dia.
- Transferi-los para placas de petri e adicionar 15 ml da solução de pronase a dechorionate os embriões.
- Incubar os embriões de 1 a 5 min, até cerca de 60% dos embriões foram dechorionated. Parar a reacção por decantação da solução de pronase e lavar os embriões 3-4 vezes com meio fresco E3.
- Incubar os embriões dechorionated na E3 na RT O / N e deixá-los a desenvolver para chegar à fase 10 somitos. Incubar 50-60 embriões por embreagem para evitar o crescimento de desenvolvimento diferente. 4. Tratamento
- Verifique estágio de desenvolvimento dos embriões no âmbito de um campo de microscópio de luz para garantir que eles estão em fase de 10 somitos.
- Usando um microscópio de fluorescência com uma proteína fluorescente (RFP) filtro vermelho, isolar os embriões vermelhos brilhantes.
- Proceda à indução da Cre-recombinação pela adição de 10 uM de solução hidroxitamoxifeno numa placa de Petri e incubou-se os embriões isolados a 28,5 ° C durante 3 h.
- Decantar a solução tamoxifeno e lavar os embriões várias vezes com E3.
CUIDADO! descartar a solução tamoxifeno em um recipiente especial resíduos biológicos. - Incubar os embriões a 28,5 ° CO / N.
- Quando os embriões são aproximadamente a 28-29 fase somites (cerca de 24 horas após a fertilização), incubar os embriões a 28,5 ° C na E3-PTU solução a seguir.
NOTA: o PTU é aqui utilizado para inibir a formação de melanóforos nos embriões em desenvolvimento. Este tratamento é necessárioevitar a distorção do sinal de fluorescência por melanóforos auto-fluorescente. - Incubar os embriões a 28,5 ° C
- Para visualizar as estruturas craniofaciais totalmente desenvolvidas, seleccionar os embriões em 4 dias após a fertilização para a intensidade do sinal vermelho e Cre marcador expressão positividade (amarelo na retina).
- Anestesiar os embriões com uma solução de E3 / 0,015% tricaina. A anestesia é confirmado quando há movimentos ativos ou atividade fin é observado quando cutucando delicadamente o embrião.
- Transferir o embrião seleccionado para a imagem latente numa placa de Petri contendo uma gota de metilcelulose e embalsamar suavemente o embrião com metilcelulose.
- Em um slide confocal limpo, coloque uma gota de metilcelulose fresco e montar o seu embrião dentro da gota utilizando uma ponta microloader. Posição embrião dorsal tomando cuidado para não tocaro embrião directamente.
- Cobrir o embrião montadas com uma lamela de 25 x 25 e ajustar a posição do embrião, se necessário através da manipulação da lamela.
- O embrião está agora pronto para a imagem.
- Use a objetiva de 20x lente seca (abertura numérica 0,75; tamanho pinhole 2,0 mm) para focar o embrião.
- Pressione o botão L100 no microscópio e selecionar os canais do software.
- Selecione o botão de configuração confocal e clicar em 'auto' e selecionar as seguintes canais antes de fechar a janela: Ch1: PCP, Ch2: GFP, Ch3: RFP ou mCherry
- Ligue CH2 e CH3 antes de clicar no botão "remover interlock". Clique em 'play' para iniciar a digitalização.
- Concentre-se em estrutura de interesse, que é o melhor feito por começando com moldura ½ / seg e alta tensão (HV) 150 e, em seguida, ajustar as configurações de acordo até a qualidade de imagem desejada é achieved. A RFP seria mais brilhante do que as outras cores, por conseguinte, ajustar o HV. Mude a posição Z para encontrar tanto YFP e células positivas RFP.
- Uma vez definido com as configurações, capturar a imagem de seu embrião. Salvar a imagem no formato confocal formato de software de imagem e TIFF para processamento de imagem em cada canal de divisão.
- Em seguida, para a imagem latente PCP, desligue CH2 e CH3 e ligue Ch1. Re-ajustar as configurações como no passo 5 sem mudar a área de foco.
NOTA: PCP pode ser muito difícil de detectar devido ao sinal de fundo em azul canal que pode ser contornado, ajustando o tamanho pinhole. Um tamanho maior pinhole permite uma melhor detecção de fluorescência, reduzindo ruído / sinal de fundo. No entanto, uma pinhole maiores reduzirá efeito confocal, comprometer a qualidade da imagem. Portanto, é necessário um ajuste cuidadoso das configurações para obter a qualidade de imagem desejada e intensidade. - Capturar a imagem e salvá-lo no formato de ambos (software confocal e TIFF) para processamento de imagens. As imagens podem então ser processados usando software de processamento de imagem comum para mesclar camadas e melhorar as configurações de cores como descrito por Pan e colegas 8.
5. Seleção de Embriões
6. Montagem do embrião em metilcelulose
7. Análise por Microscopia de Fluorescência
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Representative Results
Visualização cartilagem tradicional pela montagem Alcian manchas azuis inteiras tem sido inestimável para observar o desenvolvimento da cartilagem de Meckel e comumente usado para visualizar celular organização 12 (Figura 1A) final. Para analisar melhor os condrócitos em desenvolvimento horas extras, linhagem rastreamento usando SOX10: linhagens transgênicas Kaede nos permitiu estudar a migração de células, a convergência ea extensão em embriões vivos 2,12 (Figura 1B). No entanto, a organização dos condrócitos no a estrutura do esqueleto craniofacial permanece pouco compreendido. Por imagens ao vivo, a linha transgénica Zebrabow-H é capaz de revelar o processo de intercalação de condrócitos e de alongamento que medeia a extensão e o crescimento da cartilagem de Meckel (Figura 1C-G).
Neste protocolo, ubi: Zebrabow-M; SOX10: embriões ERT2-Cre foram tratadas com tamoxifeno em 10 somitos e chondrocitos no maxilar inferior foram visualizados em diferentes pontos de tempo durante o desenvolvimento (a partir de 3 dpf a 5 dpf). A mandíbula inferior é melhor retratada ventrally para permitir uma visão clara de cartilagem de Meckel, sem a interferência do etmóide placa e neurocranium dorsal. As cores mantido estavelmente herdada e permitir a fácil rastreio linhagem e CNCC células mapeamento destino, como indicado pelas setas pretas na figura 2A-2D. A única célula azul aparece a migrar e intercalam com as suas células vizinhas. Em seguida, ele alonga ao longo do eixo ântero-posterior para formar um condrócitos uma forma uniforme mantendo, assim, a forma global da cartilagem de Meckel, uma vez que se estende anteriormente.
Esta técnica permite o estudo de malformações crescimento maxilar inferior ao nível celular e órgão em condições como a seqüência de Robin, onde micrognathia é uma das características proeminentes descritas. Falha na proliferação, extensão ou intercalação pode ser efetivamente visualizado em t ele crescer condrócitos ao longo do tempo.
| NaCl | 14,61 g |
| KCl | 0,65 g |
| CaCl2 | 1,83 g |
| MgSO4 | 1,99 g |
| Desionizada H2O | 1.000 ml |
| * Armazenamento: RT | |
| ** Adicionar 1 gota de azul de metileno como um anti-fúngica | |
Tabela 1. 50X E3 embrionário receita médio
| 50X E3 | 20 ml |
| Desionizada H2O | 980 ml |
| * Armazenamento: RT | |
| 1 M de Tris-Cl (pH 9,5) | 9 ml |
| tricaina | 2 g |
| Desionizada H2O | Completar até 1 L |
| * Armazenamento: RT | |
Tabela 3. 0,2% receita tricaina
Figura 1. (A) da cartilagem de fluorescência Meckel de SOX10:.. (B) da cartilagem de um 4 dpf Tubingen embriões corados com Azul de Alcian GFP do dissecado Meckel (C) linhas de peixes-zebra transgénicos UBI: Zebrabow-H transversal com SOX10: ERT2-CRE. (DG) ubi: Zebrabow-M; SOX10: ERT2-Cre imagem em RFP (D), YFP (E), PCP (F) canais e mesclar (G). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. (AD) Timelapse fotografia de Zebrabow-H: SOX10: ERT2-Cre em 3dpf (A), 3.5dpf (B), 4dpf (C) e 5dpf (D). Setas pretas apontam para o mesmo clone único. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Linhas transgénicas e azul Alcian photoconvertible como descrito acima complementa uns aos outros para definir o processo complicado de cartilagem e desenvolvimento ósseo. No entanto, a migração celular ao vivo e organização durante a organogénese tem sido a hipótese e, indiretamente, mas nunca demonstrou visualizado. A linha transgénica Zebrabow-H acoplado com uma cartilagem Cre específica permite a observação vivo simultânea de todos estes eventos distintas envolvidas na formação do osso e cartilagem. Esta técnica permite o estudo de defeitos de crescimento maxilar inferior ao nível celular e órgão em condições como a seqüência de Robin, onde micrognathia é uma das características proeminentes descritas. Falha em proliferação, extensão ou intercalação pode ser eficazmente visualizado nos condrócitos em crescimento ao longo do tempo.
Otimização diversidade de cores
Optimizar níveis Cre por titulação da concentração de 4-hidroxitamoxifeno pode controlar a extent de recombinação e diversidade de cores, sem resultar em mortalidade do embrião. Estrogênio é essencial para o desenvolvimento normal da retina e, portanto, maiores doses de tamoxifeno (> 25 uM) pode induzir a degeneração da retina, altas taxas de mortalidade (~ 60 a 80%), malformações craniofaciais e atrasos no desenvolvimento. Além disso, o 4-hidroxitamoxifeno é diluído em etanol, o que, por si só é tóxico durante o desenvolvimento embrionário 13. Portanto, é importante para determinar a melhor concentração e duração de exposição para obter uma boa taxa de recombinação, mas limitar a toxicidade para os embriões.
A concentração desejada de 4-hidroxitamoxifeno foi otimizado neste protocolo. Diferentes concentrações (5-25 uM), pontos de tempo de indução (10 somitos, 24, 36 & 48 HPF) e duração (30 min a 6 h) foram testadas (dados não mostrados). Uma dose baixa de tamoxifeno (5 uM) produziu uma recombinação limitado, enquanto doses mais elevadas (de 10 uM a 20 uM) produziu SIMrecombinação Ilar e diversidade de cores. Doses superiores a 20? M comprometido o desenvolvimento normal dos embriões e, portanto, não é adequado para o estudo de malformações craniofaciais. Durações de indução com menos de 2 horas não foram suficientes para criar recombinação adequado enquanto mais de 6 horas de indução de toxicidade induzida e anomalias de desenvolvimento dos embriões. Indução para 3 ou 4 horas não diferem na quantidade de recombinação e os resultados finais.
Indução após a fase embrionária 24 HPF não produziu expressão e recombinação desejado fluorescente. Por conseguinte, o melhor compromisso entre o desenvolvimento normal e quantidade apropriada de cores, sem resultar em significativamente elevados números de mortalidade embrionária foi determinada como sendo de 3 horas de indução a 10 somitos com uma concentração de 10 uM de tamoxifeno.
Qualidade da imagem
A obtenção de imagens consistentes e de alta qualidade pode ser um desafio. Se um único campo de VIew é incapaz de visualizar toda a cartilagem de Meckel ou estrutura craniofacial de interesse, a estrutura inteira pode ser mapeado, tendo Z-pilhas. No entanto, a obtenção de Z-stacks pode ser um desafio em imagem embrião vivo devido a artefatos de movimento. Por isso, é importante que haja um compromisso entre a qualidade da imagem Z-pilha, a quantidade de informação necessária durante a sessão de imagem e prevenção da induzida por laser foto-branqueamento durante a exposição a longo prazo a laser.
Outra limitação desta técnica é que as proteínas fluorescentes não mostram a mesma estabilidade durante o exame. Por exemplo RFP é uma proteína relativamente estável, mas YFP pode ser instável. Portanto, é importante para determinar as melhores configurações de imagem empiricamente para detectar o número máximo de cores numa dada embrião com a intensidade apropriada.
Além de estabilidade de cor, o microscópio confocal é mais uma limitação, pois é incapaz de ler o PCPe canais de YFP em conjunto. Isto é devido ao facto de a emissão de PCP é detectado em ambos os canais de 470nm e 535 nm. Além disso, o espectro de emissão de PCP (470-535nm) e o espectro de excitação de YFP (530nm) sobreposição, criando um TERF (transferência de energia de ressonância de fluorescência) artefato. Em outras palavras, quando a fluorescência é detectada PCP, que excita a fluorescência de YFP criando, assim, um sinal não específico. Por esta razão, este protocolo contornos digitalizando todos os canais de fluorescência foram separadamente e fundindo as imagens individuais separadamente utilizando um software comum de processamento de imagem. Para contornar as limitações do microscópio confocal, um microscópio de dois fotões podem ser utilizados como descrito em Pan et al papel onde todas as três expressões de fluorescência pode ser lida simultaneamente permitindo uma maior diversidade de cor 8. Pan et al descreveu um largo espectro de diversidade de cores em suas linhas Zebrabow-M (até 30 cores). Seguindo as condições descritas no presente ProtOCOL, diferentes intensidades de fluorescência e as recombinações podem ser obtidos como se mostra na Figura 2, apesar de alguns permutações de cor poderia ter sido perdido durante o processamento pós-imagiologia.
Herança da cor e análises clonais
Pan et al descreveu a herança da cor mantida de forma estável em Zebrabow-M do progenitor à progenitura que permite o mapeamento de destino 8. Este protocolo focada em células neurais CNCC para caracterizar a formação de cartilagem de Meckel. O uso de CreERT2 em peixes-zebra permite a eficiente tamoxifeno recombinação induzida cassete loxP e a capacidade para controlar o aparecimento de rotulagem linhagem CNCC craniofacial durante o desenvolvimento. Este método pode ser facilmente adaptado para visualizar todos os derivados da crista neural, além de cartilagem de Meckel. Além disso, usando uma linha diferente repórter transgénico para análise clonal em vários sistemas de órgãos diferentes destacará diferente modes de crescimento celular durante a organogénese.
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Acknowledgments
Os autores agradecem Alex Schier para gentilmente compartilhar a linhagem transgênica Zebrabow-M, Geoffrey Burns, para o vetor pDEST e Renee Ethier-Daigle para excelente atendimento das instalações e linhas de peixe.
FINANCIAMENTO:
Estamos gratos pelo apoio generoso financiamento do NIDCR RO3DE024490 e Shriners Hospitals for Children (ECL) e bolsas de formação pós-doutoramento do Shriners Hospitals for Children (LR e YK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
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